Tài liệu Thu nhận và tinh chế enzyme

Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH CHỦ ĐỀ: GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM MSSV: 06126031 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 MỤC LỤC Y Z I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME ......................................................2 1. Định nghĩa .............................................................................................2 2. Tính chất của enzyme ............................................................................2 II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ ............................................3 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme .....................................3 2. Thu nhận enzyme thô .............................................................................5 III. TINH SẠCH ENZYME .........................................................................6 1. Các phương pháp tủa protein/enzyme.....................................................6 2. Sự thẩm tách ..........................................................................................8 3. Sắc ký ...................................................................................................8 4. Phương pháp dùng chất hấp phụ ............................................................14 IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM ..........................................................15 V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME ...................................15 1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan ................................................15 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel .....................................16 3. Phương pháp siêu ly tâm ........................................................................17 4. Kỹ thuật khối phổ ..................................................................................18 VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME ........................................................18 VII. TỔNG KẾT ...........................................................................................19 1 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm...Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua trọng của enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men. Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. TÓM TẮT Enzyme bản chất là protein được thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật. Do đó rất đa dạng về cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục tiêu, và phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau tùy từng loại enzyme. Tuy vậy, các quá trình tinh sạch enzyme vẫn ứng dụng các phương pháp cơ bản sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hoá), tủa ( bằng muối, dung môi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, từng bước tinh sạch bằng sắc ký ( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết quả tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan, điện di (điện di một chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ, I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1. Định nghĩa Enzyme (E) là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã). Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. E không chỉ có thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện nhất định.Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym [1]. E có tính đặc hiệu cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất bình thường. 2 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2. Tính chất của enzyme 1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. 2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. 3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động. 4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. 5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein). ™ Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu. • Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.. II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E Như đã nói ở trên, E là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi rất không bền, có thể dễ bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ. Do đó, khi làm việc với E phải chú ý tránh làm mất hoạt tính của nó. Thông thường phần lớn E hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+ 2). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E. Nhiệt độ cao và các chất oxy hoá và chất khử, …cũng là một trong số những nguyên nhân gây biến tính E. Tuy nhiên các E khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân gây biến tính khác nhau. Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0oC đến 5oC. Đối với các E không bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -5oC đến -20oC. Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc… Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3oC Nước đá : H2SO4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 oC Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E 3 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease chứa kim loại. Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch protein/E Chất ức chế Nồng độ và thời gian hiệu quả Dung môi pha dung dịch gốc và nồng độ chất ức chế 0,1-1mM Leupeptin 10-100μM Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM 100mM vài giờ trong H2O Ethylene diamine 1-2mM, tetra acetic acid lâu dài (EDTA) Pepstain A E proteolytic bị ức chế 100mM Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) vài giờ Điều kiện và thời gian bảo quản ở dạng dung dịch gốc 2-3 tháng ở nhiệt độ Protease serine trong ethanol hoặc phòng isopropanol 10mM trong H2O 500mM pH 8,0 1μM 1mM vài giờ trong tanol Protease kiểu trypsin 1 tuần ở 4oC hoặc 1 và một số kiểu o tháng ở -20 C protease cystein Chỉ chuẩn bị trước Protease cystein khi dùng Protease chứa kim 6-12 tháng ở nhiệt loại (trừ loại chứa độ phòng Ca2+ thì phải dùng EGTA) 3-4 tháng ở -20oC Một số protease acid Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl2 hay MgCl2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 1020%...), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…). Xây dựng quy trình đơn giản cũng là cách để bảo toàn hoạt tính E. Đối với một số E bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt (70-80oC, trong vòng 15-30 phút) và xử lý acid (pH 3-4) đối với các E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt của proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không mong muốn. Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh bọt khí. Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại nặng làm mất hoạt tính E. 4 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2. Thu nhận enzyme a . Chọn nguồn nguyên liệu Việc điều chế chúng bằng phương pháp hoá học rất khó khăn và tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học: ™ Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác. Ví dụ: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat. ™ Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy. Ví dụ: hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus… Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với quy công nghiệp bởi các nhược điểm: - Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài - Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được - Đây là nguồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực. ™ Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ. E vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng. b. Thu dịch chiết E thô Các E nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng. Do đó, để chiết rút E nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa E và chuyển chúng và dung dịch. Biện pháp cơ học như nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá (homogenizator). Đối với mô thực vật thì ta thường thái nhỏ mẫu hoặc cho trương nước để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Còn ở mô động vật khi chiết E người ta cần cắt bỏ mô liên kết. Đối với các E trong cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận dịch chiết E ta có thể dùng các yếu tố vật lý và hoá học khác như sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…), chất detergent. Các chất này có tác dụng tốt trong phá vỡ cấu tử tế bào do trong các bào quan này thường có chứa nhiều mỡ. Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, E được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính. * Một số lưu ý khi chiết rút E + Chiết rút và kết tủa E ở nhiệt độ thấp ( 3 - 5oC ) 5 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 + Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly được thêm vào để tăng hiệu quả chiết rút E như NaCl, ZnCl2, CaCl2… * Lưu ý: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan E trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. III. TINH SẠCH ENZYME Thu nhận E dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký. 1. Các phương pháp tủa protein enzyme Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử dụng nhiều nhất. a. Tủa bằng muối Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bước thẩm tách. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Hình1. Độ tan theo nồng độ muối (http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html) Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. 6 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese (NH4)2SO4, do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720g/l,nhiệt độ 25oC), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra ammonium sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein không mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa + Dạng bột: Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. X: khối lượng (NH4)2SO4 0,515 x V (S2-S1) S1: độ bão hoà cho trước X(g) = S2: độ bão hoà cần thiết 1-0,272S2 + Dịch bão hòa: Cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết E thì độ (NH4)2 SO4 không tăng dột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Ðiều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. ++ 100 ( S1-S2 ) V (ml) = 1-S2 V: thể tích (NH4)2SO4 S1: độ bão hoà cho trước S2: độ bão hoà cần thiết * Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese + Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E. + Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa. b. Tủa bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau 7 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không khí. Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến – 20 oC, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu. Ví dụ: Hình 2: Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau (Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM) c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. + pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). + pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). + Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH. Hình 3: Tỷ lệ protein tủa theo pH (http://sosnick.uchicago.edu/precpph.html ) Phương pháp này thường dùng cho các protein 8 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 đậu nành (có pI= 4.6) d. Dùng nhiệt Ngoài ra có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy nhiên phương pháp này ít đuợc dùng vì hiếm E bền với nhiệt. 2. Sự thẩm tách Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất cóphân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch E vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn. Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M Túi cellophane 3. Sắc ký Sắc ký là phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng định lượng và định tính. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha tĩnh và pha động.Bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong tinh sạch E là: o Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy) o Sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy) o Sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). Hình5: Hai phương pháp sắc ký cơ bản A: Sắc ký trao đổi ion, dựa vào sự tích điện của protein B: Sắc ký phân loại kích thước, dựa vào kích thước protein 9 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 a. Sắc ký trao đổi ion Nguyên tắc: là dựa vào điện tích thực của E tại một điểm pH nhất định (trừ điểm đẳng điện) ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử mục tiêu mang điện tích trái dấu với chúng. Gel trao đổi ion được tổng hợp bằng cách gắn một nhóm chức tích điện lên chất nền cellulose, sephadex, sepharose, molselect…có 2 loại gel trao đổi ion: Trao đổi anion (anionit) và trao đổi cation (cationit). Một số nhóm chức tích điện dương như DEAE (diethyaminoethyl), QAE (quaternary aminoethy)…Hoặc tích điện âm như CM (carboxyl methyl), SP (sulphoropyl)…Tuỳ theo nhóm chức tích điện gì mà chúng sẽ trao đổi ion trái dấu với nhóm chức, ví dụ: DEAE trao đổi ion tích điện âm (-), CM hay SP thì ion trao đổi tích điện dương (+). Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ái lực liên kết giứ protein/E phụ thuộc vào mức độ tích điện của các phân tử trong mẫu và chúng được đẩy ra và rửa chiết (eluted) ra khỏi gel nhờ sự thay đổi muối hay pH của môi trường. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Sắc ký trao đổi ion thường dùng ở bước tinh sạch đầu tiên để sơ bộ phân tách các protein khác nhau nhằm thu nhỏ thể tích mẫu khi việc tủa protein bằng các dung môi hữu cơ hay ammonium sulfate còn nhiều bất tiện. Hình6: Minh họa sắc ký trao đổi ion Ví Hình 7: Minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein dụ: Mẫu E 10 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 urease đậu nành sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích đối nước và qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient bằng muối NaCl nồng độ từ 0 – 1M. Hình7: Sắc ký đồ trên DEAE-Cellullose Hình 8: kết quả điện di sau các bước tinh sạch Kết quả điện di cho thấy, hiệu quả tinh sạch cũng như kết quả tách phân đoạn qua cột sắc ký rất cao, đã loại bỏ gần toàn bộ các protein tạp, và chỉ có một vạch sau chạy sắc ký là urease đậu nành (theo tài liệu của nghiên cứu). Kết luận của thí nghiệm: urease đậu rựa (jackbean) là loại enzymheterogeneous, còn urease dậu nành (Glycine max) là homogeneous.(Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng-Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7-2006) b. Sắc ký lọc gel Nguyên tắc: là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của E có trong hỗn hợp để tách chúng ra, dựa trên mức độ di chuyển khác nhau của các phân tử đó trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, molselect và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel 11 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọtvào ở các nguỡng sau đây: Các loại sephadex G. 10 G. 15 G. 25 hạt tinh (F) hạt thô (C) G. 50 hạt tinh (F) hạt thô (C) G. 75 G. 100 G. 150 G. 200 Trọng luợng phân tử 0 - 700 0 - 1.500 100 - 5000 1500 - 30.000 3.000 - 70.000 4.000 - 150.000 5.000 - 400.000 5.000 - 800.000 Các Molselect cũng có ký hiệu từ G10 dến G200 phục vụ trong việc lọc phân tử cho phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọt vào ở các nguỡng sau đây: Các loại Molselect G - 10 G - 15 G - 25 G - 50 G - 75 G - 100 G - 200 Trọng luợng phân tử <700 <1500 100 - 5000 500 - 10.000 1.000 - 50.000 1.000 - 100.000 1.000 - 200.000 Kỹ thuật này áp dụng để loại muối thay cho phương pháp thẩm tích. Và trong quá trình tinh chế protein enzyme, thì được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme. Phương pháp lọc gel không áp dụng với phương pháp mẫu lớn vì vậy ít được dùng ở bước tinh sạch ban đầu. Tuy nhiên nếu lượng mẫu được cô đặc lại thì vẫn có thể dùng phương pháp lọc gel. Ví dụ: Tinh sạch urease từ đậu nành Hình 10: Sắc ký đồ của dịch trích ly từ đậu nành khi qua cột SephadexG-50 Hình 11: Kết quả điện di mẫu đã qua cột Sephadex, ở phân đoạn 4 Sắc ký đồ trên gel acrylamide cho thấy hầu như tất cả các vạch trên mẫu trích ly đều xuấthiện ở mẫu đã qua tinh sạch trên sephadex. Ðiều đó có nghiã trước và sau khi chạy sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-50 chưa có hiệu quả lắm về mặt tinh sạch, có thể do Sephadex G-50 không phù hợp nên chưa thể loại bỏ một số tạp chất.Î Việc chọn kích thước hạt gel là vô cùng quan trọng trong quá trình tinh sạch E. (Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức ThắngTạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006) 12 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 c. Sắc ký ái lực Phương pháp này cho phép tinh sạch nhanh chóng hợp chất hay E quan tâm. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh học để tạo ra sự gắn kết đăc hiệu giữa chất cần tách với gel sắc ký. Đối với E,người ta sẽ gắn với gel một chất có ái lực đặc hiệu với E như: cơ chất, cofactor, chất ức chế cạnh tranh, chất tương đồng (analogue) cơ chất. Quá trình gắn này có thể trực tiệp hay qua một cầu nối hay cánh tay đòn (spacer). Khi hỗn hợp protein chứa E đi qua cột sắc ký ái lực, E và những chất có ái lực với nhóm chất đặc hiệu trên gel sẽ được giữ lại, còn các chất khác sẽ đi qua.E sẽ được tách ra bằng cách thay đổi nồng độ muối, pH của môi trường hay dùng mộy chất cạnh tranh với E. Hiện nay, sắc ký ái lực được sử dụng rất nhiều trong tinh sạch E và hợp chất sinh học khác, tuy nhiên khó khăn lớn nhất của phương pháp này là tìmchất gắn kết thích hợp. d. Sắc ký lỏng cao áp Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh. 4. Phương pháp dùng chất hấp phụ Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định như silicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có được làm sạch với hiệu suất cao. Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch E) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch E. Chất hấp phụ chủ yếu thuờng được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả 13 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách : chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Bằng cách đổi độ pH hoặc lực ion của dung môi thích hợp, các E được hấp phụ có thể được chiết khỏi chất hấp phụ. IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYME Ðây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng. Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh chúng. Chú ý: là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là tinh khiết hoàn toàn. Đặc biệt là các tinh thể protein E kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein E khác. Quá trình kết tinh protein E được thực hiện trong dung dịch (NH4)2SO4. Quá trình kết tinh kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết. Thường ta là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein E khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách: + Thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein enzyme theo từng giọt. + Thêm muối qua màng bán thấm. + Có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein E. Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ. Ðể kết tinh protein E được dễ dàng, ở những giai đoạn truớc đó, người ta thường tách từng phần các protein E bằng các dung môi hữu cơ. Ðiều này liên quan đến việc các chất có bản chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh. V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME Sau khi nhận được một E ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Vì thế nếu dùng nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của E mà kết quả đều cho là đồng thể thì E đó được công nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể thường dùng là xây dựng đồ thị về độ hòa tan, điện di và siêu ly tâm. 1. Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng E khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị. Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hòa tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt được bão hòa. Nếu protein đem hòa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hòa tan nữa. 14 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu dịch chiết có nhiều protein E thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất có kết quả đến nay vẫn còn ứng dụng nhiều. Số lượng protein trong dịch lọc Hình 12: Đường biểu diễn độ hòa tan protein A: Protein đơn thể B: Hỗn hợp 2 protein A B Số lượng protein cho thêm 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel Là phương pháp tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường. Tốc độ di chuyển của protein trong điện trường: V = Ez/f Hình 13: Minh hoạ phương pháp (1) điện di V: Tốc độ di chuyển E: Lực điện trường z: Điện tích của protein f: Hệ số ma sát, tuỳ thuộc vào hình dạng và khối lượng protein và độ nhớt của môi trường. Đây là phương pháp để đánh giá quá trình tinh sạch protein/E có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein/E có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm phát hiện các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước tinh sạch. Tuy nhiên, phương pháp này là khó áp dụng ở quy mô lớn. Gel là trạng thái trung gian giữa pha gắn và lỏng, bởi vì gel giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách, vì vậy, điện di luôn được thực hiện trên gel. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. Điện di protein được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Gel polyacrylamide (PAGE), được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, có tính trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng. Trong nhiều trường hợp, để khẳng định chắc chắn băng protein tinh sạch trên điện di đồ là E cần quan tâm, người ta phải dùng đến phương pháp điện di gel hoạt tính. Thường dùng nhất là đồng trùng hợp cơ chất trong gel polyacrylamide, sau khi điện di rửa gel bằng một dung dịch thích hợp, sau đó ủ gel với dung dịch cơ chất trong điều kiện phản ứng thích hợp. Băng protein nếu có hoạt tính sẽ chuyển cơ chất thành sản phẩm có màu khác với màu của nền gel chứa cơ chất, nhờ đó dễ dàng nhận ra băng có hoạt tính E. Ví dụ: Với protease, cơ chất casein, sau đó nhuộm gel với coomassie thì vị trí có E sẽ không có màu (do E phân giải cơ chất), tạo thành vệt sáng trên gel có cơ chất nhuộm màu xanh. 15 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 a. Điện di một chiều Các protein/E có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên gel polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Một số chất biến tính protein như: SDS (sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Ureùa, Formamide. Thường dùng nhất là SDS. Hỗn hợp protein có chứa E được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu. Vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Và những protein/E trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần giếng. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.[2] b. Điện di dựa vào điểm đẳng điện Các protein/E còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính base và số acid amin có tính acid của chúng mà không cần biến tính. Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại điểm pH này, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z bằng 0(công thức 1). Mỗi một protein có một pI riêng. Ví dụ: pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8. Khi ta cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với một khuynh độ pH, không có sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này. 16 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 c. Điện di hai chiều Đây là phương pháp có khả năng phân tách cao do sự kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Hình 14: Hình minh hoạ phương pháp điện di hai chiều Những protein/E được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau có thể phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽ được xác định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất nhiều protein được phân tách nhưng lại không phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổ. d. Capillary Electrophoresis (Điện di mao dẫn) Hình 15: Hình minh hoạ phương pháp điện di mao dẫn Phương pháp này được ứng dụng trong giám sát quá trình tinh sạch protein/E-protein/E tinh sẽ cho một band đơn. Ngoài ra phương pháp này còn giúp xác định khối lượng phân tử tương đối của protein/E. 3. Phương pháp siêu ly tâm Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein E. Dưới tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua một môi trường lỏng. Để biết được tốc độ di chuyển của phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s). ™ Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào: + Khối lượng: một phân tử có cùng hình dạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn. 17 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 + Hình dạng: cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt. Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng có cùng khối lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng có cùng khối lượng. + Tỉ trọng của dung dịch (p): các phân tử lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và không di chuyển khi p = 1. ™ Các bước tiến hành: với tốc độ ly tâm rất lớn, bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút. Ta có thể tách ra được các phân tử E có trọng lượng phân tử khác nhau.Tốc độ kết tủa của protein E trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nó. Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Do đó, để quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loại protein E thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai hay nhiều protein enzyme thì sẽ có hai hoặc nhiều đỉnh... Sau ly tâm mẫu được hút ra nhẹ nhàng theo từng phân lớp, hay đục lỗ nhỏ ở đáy ống ly tâm để lấy từng phân lớp. 4. Kỹ thuật phân tích khối phổ (mass spectrometry – MS) Với phương pháp phân tích này, các protein được phân cắt bằng một protease đặc hiệu (thường dùng là trypsin) thành các peptide nhỏ, sau đó cho qua hệ thống phân tích khối phổ. Nhờ hệ thống này, phổ các peptide được xác định khối lượng phân tử chính xác và kết quả được so sánh với khối phổ của các protein trong ngân hàng dữ liệu quốc tế. Protein phân tích được nhận dạng chính xác là loại protein hay E gì. VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME Ngoài ra sau mỗi bước tinh sạch, cần đánh giá quá trình tinh sạch E dựa vào những thông số sau : + Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn - bằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đó. + Hoạt tính tổng: hoạt tính của E trong phân đoạn đó - tính bằng cách nhân hoạt tính E có trong lượng mẫu được xét nghiệm với tổng thể tích của phân đoạn đó. + Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số. + Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%. + Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu. Thực tế, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. kỹ thuật điện di, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng E mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng . Vì vậy, mức độ tinh sạch và yield là 2 thông số để đánh giá quá trình tinh sạch. Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu. 18 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 ™ Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong E học, người ta không định lượng E một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của E. Trong phán ứng có E xúc tác, sự hoạt động của E được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của E thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Ðể xác định hoạt độ của E ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ... được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng E. Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau: + Ðo lượng cơ chất bị mất di hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ E xác định. + Ðo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ E nhất định. + Chọn nồng độ E như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Ðơn vị hoạt độ E (U) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1μmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1μmol cơ chất (10 -6 mol)/ phút. Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat) Katal (Kat) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn 1 Kat = 6.10 7 U 1 Và 1 U = microkatal 60 VII. TỔNG KẾT Để thu được một chế phẩm E tinh khiết và vẫn đảm bảo hoạt tính xúc tác, thì quá trình tách từng phần và tinh sạch E phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau. Tuỳ theo nguồn cho, loại E, mục đích sử dụng và điều kiện sẵn có mà ta lựa chọn phương pháp cũng như trật tự các phương pháp sao cho đạt hiệu tinh sạch quả tốt nhất. Trong từng bước tinh sạch các điều kiện nhiệt độ, pH… phải luôn được kiểm soát ở mức cho phép, nhằm tránh làm biến tính E cũng như mất hoạt tính. Và sau mỗi bước tinh sạch cần kiểm tra hiệu quả tinh sạch cũng như hoạt độ của E, nhằm đánh giá hiệu quả của từng phương pháp để đưa ra một quy trình tinh sạch hiệu quả cao đồng thời ít tốn chi phí. Ngày nay, E được ứng dụng ngày càng rộng rãi hơn, nhưng giá thành chế phẩm E vẫn còn khá cao. Để giải quyết vấn đề này, cần tìm nguồn nguyên liệu thích hợp, hoặc tìm biện pháp sử dụng E lặp lại nhiều lần, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất cũng như thu nhận E. TÀI LIỆU THAM KHẢO 19