Thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang - Khánh Hòa và thử nghiệm sử dụng Phlorotannin làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa (TT)

  • Số trang: 39 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 240 |
  • Lượt tải: 0
thuvientrithuc1102

Đã đăng 15337 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------------------ĐẶNG XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ (SARGASSUM SERRATUM) TẠI NHA TRANG VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỒ UỐNG CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 62540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Nha Trang - 2015 Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Nha Trang và Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Vũ Ngọc Bội Trường Đại học Nha Trang 2. PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Phản biện 1: GS. TSKH Nguyễn Trọng Cẩn .......................... ................................................................................................ Phản biện 2: PGS. TS Phùng Thị Thanh Tú ........................... ................................................................................................ Phản biện 3: PGS. TS Nguyễn Anh Tuấn ............................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sỹ cấp Trường họp tại: …………………………………………………………………………… Vào hồi …………giờ ………..ngày ……tháng ……….năm……….. Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Trường Đại học Nha Trang hoặc thư viện Quốc gia Hà Nội. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Rong nâu (Phaeophyta) là loại rong giàu các chất có hoạt tính sinh học như lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất này có nhiều hoạt tính sinh học, trong đó đáng chú ý là hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…. Ngành rong nâu (Phaeophyta) có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae và Sargassaceae. Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ (Sargassaceae) được biết là chi rong có sản lượng lớn và có giá trị cao, do chi rong này có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,…. Trong đó đáng chú ý là phlorotannin - một hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp phenolic. Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như: hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin là một trong những hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất và phlorotannin được biết đến là chất chống oxy hóa không độc và an toàn với con người nên có thể khai thác và sử dụng trong hỗ trợ cơ thể đào thải các gốc tự do giúp tăng cường sức khỏe. Do vậy, phlorotannin từ rong mơ đã được các nhà nghiên cứu quan tâm. Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú và đa dạng về số lượng, chủng loại. Mặt khác, rong mơ ở vùng biển Nha Trang được cho rằng có chứa các hoạt chất sinh học như fucoidan, phlorotannin, alginate,…. với hàm lượng cao. Do vậy việc nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ Sargassum serratum tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa” là cần thiết. 2 2. Mục tiêu của Luận án: - Nghiên cứu thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. - Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa. 3. Đối tƣơng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang được thu mẫu, rửa sạch bằng nước mặn, sấy khô đến độ ẩm 19% và bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng làm nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu thu nhận phlorotannin. 3.2. Phạm vi nghiên cứu: gồm 5 phần 1) Nghiên cứu tách chiết và tối ưu hóa quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. 2) Bước đầu phân đoạn và tinh sạch phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum). 3) Nghiên cứu sấy phun để thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S. serratum. 4) Đánh giá độc tính của phlorotannin thu từ rong mơ S. serratum. 5) Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chuẩn của Thế giới và Việt Nam trong nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum), có sử dụng toán học để tối ưu hóa nhằm tìm ra 3 các quy luật, phát hiện ra các tính chất mới, các mối quan hệ giữa các đại lượng và kiểm chứng các giả thuyết. 5. Các đóng góp mới về mặt khoa học - Lần đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về phlorotannin của rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa từ nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết đến tinh sạch, thử nghiệm độc tính trên chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và thử nghiệm sản xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy, kết quả nghiên cứu của Luận án có ý nghĩa khoa học cao. Kết quả này góp phần khẳng định giá trị của nguồn lợi rong biển Việt Nam. Mặt khác, kết quả của luận án còn là tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực nghiên cứu các chất tự nhiên từ rong biển. - Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở để các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa một số sản phẩm từ phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang. 6. Kết cấu của luận án Luận án bao gồm 171 trang, trong đó 34 trang tổng quan, 22 trang phương pháp nghiên cứu, 89 trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2 trang, tài liệu tham khảo 24 trang và phụ lục. 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ Rong mơ là nguồn tài nguyên giàu hoạt chất sinh học với các hoạt tính sinh học phong phú và đa dạng, như chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ và chống bức xạ UV-B, khả năng làm lành vết thương và tái tạo cấu trúc tế bào (Kang và ctv., 2003). Thực tế cho thấy, tỉnh Khánh Hòa có 21 loài rong mơ trong đó loài Sargassum serratum là loài phân bố rộng, trữ lượng lớn và là loài mới, có chứa nhiều chất có hoạt tính tự nhiên như fucoidan, phlorotannin,… nhưng chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN Phlorotannin là một trong những hoạt chất chống oxy hóa mạnh mẽ có nguồn gốc từ rong mơ (Ahn và cộng sự (2007); Kang và cộng sự (2003); LIM (2002); Kuda (2007) và Shibata (2008)). Phlorotannin có các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) với kích thước phân tử dao động trong khoảng 126 Da - 650 kDa (Singh và cộng sự (2006)) và có các kiểu liên kết đặc trưng trong cấu trúc như: liên kết ether, liên kết phenyl, liên kết ether và liên kết phenyl, liên kết dibenzodioxin (La Barre và cộng sự (2010)). Điều thú vị là hàm lượng, cấu trúc và cơ chế chống oxy hóa của polyphenol/ phlorotannin trong rong nâu có mối liên hệ chặt chẽ với hoạt tính chống oxy hóa. Phlorotannins là hỗn hợp phenolic với bản chất polymer của phloroglucinol, chúng tồn tại trong nhiều họ của ngành rong nâu như: Alariaceae, Fucaceae và Sargassaceae. Như vậy có thể thấy phlorotannin là hoạt chất đáng để quan tâm nghiên cứu. 5 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM * Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hỗn hợp phenolic trong rong nâu chính là phlorotannin (Jormalainen và cộng sự, (2004); Koivikko và cộng sự, (2007); Swanson và cộng sự, (2002)). Siti A. Budhiyanti và cộng sự (2012) công bố khả năng bắt gốc tự do (DPPH) dao động từ 14,61 ÷ 48,71% và 0,17 ÷ 44,05% tương ứng khi dịch chiết từ thành tế bào và tế bào chất có nồng độ 0,45 mg/ml; hoạt tính khử sắt dao động từ 2,05 ÷ 12,51% và 26,77 ÷ 68,80% tương ứng khi dịch chiết từ tế bào chất và thành tế bào của một số loài Sargassum thu ở bờ biển Indonesia có nồng độ 0,45 mg/ml được sử dụng, các dịch chiết này đều chứa phlorotannin. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của loài S. ramifolium và S. pteropleuron với chỉ số oxi hóa EC50 dao động từ 6,64 đến 7,14 mg/ml (Mayalen Zubia và cộng sự, 2007). Đồng thời Soo Jin Heo và cộng sự (2005) chỉ ra khả năng bắt gốc tự do của loài S. thunbergii và S. fulvellum tương ứng là 97,41% và 84,66%. Hoạt tính chống oxy hóa mạnh của phlorotannin tinh chế từ một số loài rong nâu có mối liên hệ mật thiết với phân tử skeleton (Ahn và cộng sự, 2007). Như vậy thấy rằng có sự đa dạng về hoạt tính và hoạt lực của phlorotannin ở các loài rong Sargassum khác nhau trên thế giới. Những nghiên cứu trên cùng công bố của Barry Halliwell (2001) đã cho thấy, phlorotannin có khả năng giảm thiểu sự tổn thương tế bào dưới tác động của những gốc tự do như: superoxide, hydroxyl, peroxyl, alkoxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được coi là gốc tự do. Điều này cũng được minh chứng trên loài S. ringgoldianum có khả năng bắt gốc (.OH) đến 78% và (O2-) đến 6 88,4% và hoặt tính bắt gốc tự do (DPPH) của loài S. vulgare là 0,2% ÷ 20,3% (Naja và cộng sự, 2012) cũng như loài S. pallidum có hoạt tính chống oxy hóa tổng dao động từ 0,04 ± 0,02 đến 52,08 ± 0,02µmol FeSO4/mg (Hong Ye và cộng sự, 2009). * Tình hình nghiên cứu trong nƣớc về phlorotannin Phlorotannin chống oxy hóa được chiết từ rong nâu mới bước đầu được nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 2009. Tuy nhiên đến năm 2010 mới có một số công bố về hoạt tính chống oxy hóa của một số loài rong nâu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, Việt Nam và những công bố đều do nhóm nghiên cứu của tác giả công bố. 1.4. ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA PHLOROTANNIN Thực tế cho thấy kỹ thuật sấy phun sẽ giúp chuyển hóa hoạt chất từ dạng dịch qua dạng bột, loại bỏ hầu hết dung môi, tiết kiệm chi phí vận chuyển, nâng cao thời gian bảo quản hoạt chất và quan trọng nhất là hình thành hạt vi nang nâng cao độ bền của hoạt chất nhờ khả năng liên kết và bao gói của các chất trợ sấy được đính kèm trong quá trình sấy phun. Nên kỹ thuật sấy phun rất phù hợp để tạo bột phlorotannin chống oxy hóa có nguồn gốc từ rong biển. Từ những phân tích ở trên thấy rằng, trên thế giới chưa có bất kỳ công trình nào về nghiên cứu chiết tách, tối ưu, sấy phun tạo bột ứng dụng, xác định cấu trúc của phlorotannin từ rong nâu Sargassum serratum sinh trưởng ở bờ biển Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam hay sàng lọc đánh giá hàm lượng trữ lượng theo mùa vụ thời gian sinh trưởng cũng như sự tích lũy và phân bố ở từng phần cây rong hay theo thời gian bảo quản. Do vậy Luận án tập trung nghiên cứu những vấn đề trên. 7 CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Rong mơ (Sargassum serratum) thuộc: Ngành (Phaeophyta), Lớp (Phaeophyceae), Bộ (Fucales), Họ (Sargassaceae), Chi (Sargassum). Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa được thu mẫu, rửa sạch bằng nước mặn, sấy khô đến độ ẩm 19% và bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp phân tích 2.2.1.1. Phƣơng pháp định lƣợng phlorotannin: theo Swanson và cộng sự, 2002, với phloroglucinol là chất chuẩn. 2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa + Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): theo phương pháp của Prieto và cộng sự, (1999) với chất chuẩn là acid ascorbic. + Hoạt tính khử Fe (RP): xác định theo Zhu và cộng sự, (2002) với chất chuẩn là FeSO4. + Hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH): xác định hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH) theo Blois M. S. (1958) Sử dụng máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/6405 để đo độ hấp thụ. 2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định độ màu sản phẩm: theo phương pháp xử lý UF của Neslihan và cs (2005). 2.2.1.4. Phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần khác - Định lượng carbohydrate: Xác định hàm lượng carbohydrate theo AOAC (1990). 8 - Định lượng hàm lượng Pb: theo TCVN 7602:2007 Thực phẩm. - Định lượng hàm lượng acid citric: Theo phương pháp AOAC (1932). - Định lượng hàm lượng đường sucrose: Theo phương pháp AOAC (2000). 2.2.2. Phƣơng pháp tinh chế Mỗi phân đoạn này được tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi rửa giải là chloroform: methanol: acid formic (90: 9: 1). Thuốc thử phát hiện phlorotannin là FeCl3 5% trong cồn ethanol 96%. Sau đó kiểm tra lại độ tinh sạch của mẫu trên bản mỏng bằng LC/MS và phân tích phlorotannin theo phương pháp Swanson và cộng sự. Phân đoạn phlorotannin sạch nhất được chạy qua sắc ký cột Sephadex LH 20 với dung môi chạy sắc ký là chloroform : methanol : acid formic theo tỷ lệ (90 : 9: 1). Phân đoạn phlorotannin sạch thu từ cột LH 20 được chạy NMR 1H và 13C. (pha động gồm pha A H2O 0,1% acid formic, pha B Acetonitril 0,1% acid formic). Phương pháp chạy là HPLC-MS, nhận biết chất qua tỉ lệ m/z. - Chạy LC/MS: Chương trình gradient như sau: Bảng 2.1. Chƣơng trình gradient trên LC/MS Thời gian Pha B (%) 0 10 10 10 40 90 60 90 61 10 70 10 9 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 với thang điểm 20 để đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm. 2.2.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ ml) theo TCVN 4884:2005. - Xác định E. coli theo TCVN 6848:2007. - Xác định Coliforms theo TCVN 6846:2007. - Xác định C. perfringens theo TCVN 4991:2005 - Xác định Streptococci faecal theo TCVN 6189-2:1996. - Xác định Pseudomonas aeruginosa theo ISO 16266:2006. - Xác định Staphycus aureus theo TCVN 4830-1:2005. - Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/ml) theo TCVN 5166:1990. 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Bố trí thí nghiệm tổng quát của quá trình nghiên cứu thể hiện ở hình 2.1. 10 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Trên cơ sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định các thông số phù hợp cho từng công đoạn. 11 2.3. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 2.3.1. Hóa chất - Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: HCl, Na2CO3, H2SO4, sodium phosphate, ammonium molybdate, đệm phosphate, K3[Fe(CN)6], CCl3COOH, FeCl3, chất chuẩn là FeSO4 và acid ascorbic, phloroglucinol,…, DPPH, ethanol, n-hexan, ethyl acetate, chloroform, đều là các hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích do Merck - Đức và Sigma - Mỹ cung cấp. Ethanol 96% do Việt Nam sản xuất. - Các loại phụ gia thực phẩm: acid citric, acid ascorbic, carrageenan, sacharose,... đều là phụ gia tinh khiết đạt tiêu chuẩn sử dụng làm dược phẩm và thực phẩm do Merck - Đức cung cấp. 2.3.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng Sử dụng các thiết bị chủ yếu hiện có trong các phòng thí nghiệm Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Trung tâm Thực hành phân tích - Trường Đại học Nha Trang gồm: Thiết bị ổn nhiệt - Memment (Đức), máy đo pH HANA (Mỹ), Thiết bị Cô quay chân không (Đức), Máy sấy phun Bucchi - Thụy Sỹ, máy so mầu UV- VIS - Mỹ,… 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Phân tích dữ liệu và tiên đoán bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Design Expert 8 trial, Nemrodw và Excell. Nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Giá trị bất thường được loại bỏ bằng phương pháp Dulcan. 12 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S. SERRATUM 3.1.1. Xác định dung môi chiết rút phlorotannin Kết quả cho thấy dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng phlorotannin (Phc) và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết. Đối với cả 2 phương pháp chiết (hồi lưu và ngâm chiết) thì hàm lượng Phc và hoạt tính chống oxy hóa thu được đều giảm dần theo thứ tự dung môi chiết như sau: ethanol > acetone > ethyl acetate > chloroform > nhexan. Kết quả phân tích cũng cho thấy chiết rút phlorotannin từ rong mơ bằng phương pháp ngâm chiết luôn cho dịch chiết có hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt cao hơn so với dịch chiết thu nhận bằng phương pháp hồi lưu. Cụ thể, hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA), hoạt tính khử sắt (RP) của dịch chiết ethanol theo phương pháp hồi lưu chỉ bằng tương ứng 98,19%, 91,12% và 93,89% so với dịch chiết phlorotannin bằng ethanol theo phương pháp ngâm chiết. Vì vậy, ethanol được lựa chọn làm dung môi chiết và phương pháp ngâm chiết cũng được lựa chọn để chiết phlorotannin từ rong mơ. 3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch ethanol sử dụng chiết rút phlorotannin Kết quả phân tích cho thấy sử dụng ethanol ở nồng độ 96% để chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum thì dịch chiết thu được có hàm lượng Phc, TA và RP cao nhất. Phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa Phc, TA và RP ở các điều kiện chiết khác nhau và có sự tương tác qua lại rất chặt chẽ (R2 > 0,8) đồng thời đều thay đổi theo mô hình hồi quy phi tuyến bậc 2. Do vậy ethanol ở nồng độ 96% được lựa chọn để chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. serratum. 13 3.1.3. Xác định tỷ lệ dung dịch chiết so với nguyên liệu rong Khi chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum bằng dung môi ethanol 96% với tỷ lệ DM:NL 40:1 (v/w) thì hàm lượng Phc, TA và RP của dịch chiết thu được cao nhất và đạt tương ứng 4,102 ± 0,005mg phloroglucinol/g trọng lượng khô (DW), 4,279 ± 0,001 mg acid ascorbic/g DW và 24,228 ± 0,014 mg FeSO4/g DW. Trong khi đó nếu chiết với tỷ lệ dung môi (DM): nguyên liệu (NL) 10:1 (v/w) thì hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP của dịch chiết chỉ đạt tương ứng 57,80%, 73,63%, 86,50% so với khi chiết với tỷ lệ DM:NL 40:1 (v/w). Nếu chiết với tỷ lệ DM/NL 30:1 (v/w) thì Phc, TA và RP của dịch chiết chỉ đạt 86,57%, 96,79%, 86,89% so với khi chiết ở tỷ lệ DM:NL 40:1 (v/w). Nếu chiết tỷ lệ DM/NL 50/1 (v/w) hàm lượng phlorotannin (Plc), hoạt tính oxy hóa tổng (TA), hoạt tính khử sắt (RP) của dịch chiết đạt 96,32%, 96,61%, 96,65% so với khi chiết ở tỷ lệ DM:NL 40:1 (v/w). Do vậy, tỷ lệ giữa dung môi chiết so với nguyên liệu rong là 40:1 (v/w) được lựa chọn để nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. serratum. 3.1.4. Xác định nhiệt độ chiết Kết quả phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy khi chiết rút phlorotannin từ rong mơ (S. serratum) ở 500C thì dịch chiết thu được có hàm lương phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt cao nhất. Do vậy, nhiệt độ được lựa chọn cho quá trình chiết phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum serratum là 500C. 3.1.5. Xác định thời gian chiết Kết quả phân tích cho thấy sự thay đổi hàm lượng Phc theo thời gian chiết tuân theo phương trình phi tuyến bậc 2, kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. mcclurei của Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội, Bùi Minh Lý công bố năm 2014 [10]. Hoạt tính RP của dịch chiết ở các thời gian chiết khác nhau có sự khác biệt mang tính thống kê và 14 giữa thời gian chiết với hoạt tính TA có mối tương quan mạnh. Mặt khác, giữa hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP có mối tương quan chặt chẽ, trong đó hàm lượng Phc và hoạt tính TA có mối tương quan cao mạnh mẽ hơn cả. Mối tương quan này thể hiện ở chỗ khi thời gian ngâm chiết dài thì quá trình khuếch tán của phlorotannin từ nguyên liệu ra môi trường đạt mức cao nhất thể hiện qua hàm lượng phlorotannin hòa tan trong dung dịch tăng và đạt mức cực đại khi thời gian chiết đủ dài. Kết quả phân tích còn cho thấy thời gian chiết 32 giờ thì hàm lượng hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP của dịch chiết cao nhất. Do vậy thời gian chiết 32 giờ được lựa chọn để chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ S. serratum. 3.1.6. Xác định pH dung dịch chiết Kết quả phân tích ANOVA và hồi quy cũng cho thấy pH của dung dịch chiết và hoạt tính chống oxy hóa có sự tương quan dương rất lớn (R > 0,9). Đồng thời hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng cũng có mối tương quan rất mạnh (R2 = 0,95) và tuân theo phương trình phi tuyến bậc 2 với sự ảnh hưởng mạnh mẽ của pH môi trường chiết. Tuy nhiên, hàm lượng phlorotannin chỉ tương quan với hoạt tính khử sắt ở mức trung bình (R2 = 0,65). Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. mcclurei của Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội, Bùi Minh Lý công bố năm 2014. Kết quả phân tích cho thấy pH 7 phù hợp với quá trình chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. serratum. Do vậy, chúng tôi lựa chọn pH của dung môi để chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum là 7. Từ các nghiên cứu ở trên cho phép lựa chọn một số thông số phù hợp cho quá trình chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum serratum làm cơ sở cho việc tối ưu hoá quá trình chiết rút sau này như sau: Nhiệt độ: 500C, thời gian chiết 32 giờ, dung môi chiết là ethanol 96%, tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu (DM:NL) là 40:1 (v/w). 3.2. TỐI ƢU HÓA 15 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-BEHNKEN Sau khi xác định được một số điều kiện phù hợp để chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ S. serratum. Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá trình chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. serratum các biến số như sau: Nhiệt độ chiết (U1: 24 - 600C), thời gian chiết (U2: 16 - 42 giờ) và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) (U3: 10 - 50). Các hàm mục tiêu Y1: Hàm lượng phlorotannin (mg/g), Y2: Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbic/g), Y3: Hàm lượng FeSO4 (mg FeSO4/g). Kết quả tối ứu hóa được trình bày ở các bảng 3.1 và 3.2, hình 3.1. Bảng 3.1. Kết quả tối ƣu hóa công đoạn chiết rút phlorotannin từ rong mơ S. serratum theo mô hình Box-behnken U1 U2 U3 X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 24 16 30 -1 -1 0 1,607 1,652 1,575 60 16 30 1 -1 0 1,292 3,640 6,650 24 42 30 -1 1 0 1,071 1,666 7,630 60 42 30 1 1 0 1,607 5,180 10,080 24 29 10 -1 0 -1 1,512 2,100 11,200 60 29 10 1 0 -1 1,670 4,970 10,325 24 29 50 -1 0 1 0,914 1,246 6,020 60 29 50 1 0 1 2,394 6,300 11,830 42 16 10 0 -1 -1 2,079 2,772 8,190 42 42 10 0 1 -1 5,796 15,316 44,835 42 16 50 0 -1 1 2,142 1,736 3,780 16 42 42 50 0 1 1 3,087 5,754 18,410 42 29 30 0 0 0 6,017 15,400 45,150 42 29 30 0 0 0 6,080 15,442 45,080 42 29 30 0 0 0 6,048 15,414 45,010 (A) Bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu Y1 (B) Bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu Y2 (C) Bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu Y3 Hình 3.1. Mô hình 3D bề mặt đáp ứng Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm lặp lại ở điểm tối ƣu X1 (0C) X2 (h) X3 (v/w) Y1 Y2 Y3 DPPHtb 43 33 27:1 5,92 15,06 45,27 61,55 43 33 27:1 5,98 15,11 45,34 64,66 43 33 27:1 5,96 14,99 45,29 65,75 X1 (0C) X2 (h) X3 (v/w) 0,2 ml 0,4 ml 0,6 ml 0,8 ml 1 ml 43 33 27:1 34,00 58,60 71,50 80,32 82,11 43 33 27:1 33,70 57,40 69,90 79,70 82,59 43 33 27:1 36,00 59,80 70,23 81,40 81,30 DPPH (%) Ghi chú: DPPHtb: hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH) trung bình 17 Kết quả tối ưu hóa này phù hợp với dữ liệu thực nghiệm đã kiểm định về quá trình chiết phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum serratum. Từ kết quả này cho phép chọn điều kiện chiết tối ưu cho quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum: dung môi chiết là ethanol 96%, nhiệt độ chiết tối ưu 430C, tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu (DM:NL) 27:1 (v/w) và thời gian chiết 33 giờ.. * Xác định số lần chiết Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng Phc của dịch chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum 3 lần bằng cồn 96% tăng lên không đáng kể so với hàm lượng phlorotannin của dịch chiết chiết 1 lần. Mặt khác, nếu chiết 3 lần thì tổng lượng cồn sử dụng quá nhiều và nếu so sánh hiệu quả giữa lượng phlorotannin thu được khi chiết lần 2 và lần 3 so với lượng cồn đã sử dụng cho các lần chiết này thì hiệu quả không đáng kể. Do vậy, để đảm bảo tính kinh tế, luận án quyết định chỉ chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum 01 lần. 3.3. NGHIÊN CỨU CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S. SERRATUM Kết quả nghiên cứu cô đặc dịch chiết thu nhận từ rong mơ S. serratum được lọc và cô đặc lần 1 ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C cho thấy khi tăng nhiệt độ cô đặc thì hàm lượng Phc với hoạt tính chống oxy hóa của dịch sau cô đặc có xu hướng giảm theo phương trình hồi quy bậc 1 và nhiệt độ cô đặc ở 400C ít gây tổn thất cho hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy nhiệt độ 400C, áp suất 3mbar và điều kiện hồi lưu lạnh được lựa chọn 18 để cô đặc dịch phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ. 3.4. NGHIÊN CỨU TINH CHẾ PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADEX LH 20 3.4.1. Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel Sephadex LH 20 Tiến hành tách phân đoạn dịch phlorotannin cô đặc lần lượt bằng các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Phân đoạn sạch nhất được chạy qua cột sephadex LH 20, cột 2x25cm, mỗi phân đoạn thu 10ml. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và 3.3. Hình 3.2. Hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn dịch cô đặc bằng các dung môi khác nhau Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch phlorotannin từ rong mơ S. serratum cô đặc qua cột lọc gel Sephadex LH 20, cột 2x25cm, 10ml/phân đoạn
- Xem thêm -