Tài liệu THU NHẬN CHITIN, CHITOSAN TỪ VỎ TÔM ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM MÀNG BAO SINH HỌC TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU -------- ĐỀ TÀI KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG THU NHẬN CHITIN, CHITOSAN TỪ VỎ TÔM ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM MÀNG BAO SINH HỌC TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Nga Hướng dẫn : Ts. Nguyễn Thị Minh Nguyệt Ts. Đặng Thu Thủy Vũng Tàu, tháng 07 năm 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chủ biên: Nguyễn Thị Nga Ký tên Phối hợp: Ký tên GVHD: Ts. Nguyễn Thị Minh Nguyệt Ký tên Ts. Đặng Thu Thủy Ký tên Xác nhận đã chỉnh sửa theo ý kiến hội đồng Cán bộ phản biện 1 Cán bộ phản biện 2 BÀ RỊA-VŨNG TÀU - NĂM 2013 Chủ tịch Hội đồng LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bài báo khoa học này, lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa hóa học và công nghệ thực phẩm cùng các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện tốt cho em làm bài báo này tại phòng thí nghiệm trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới 2 cô giáo hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Minh Nguyệt và Ts. Đặng Thu Thủy là những người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành bài báo này. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Minh Nhựt phụ trách phòng thí nghiệm thực phẩm đã giúp đỡ và hướng dẫn cho em trong quá trình làm các thí nghiệm tại phòng thí nghiệm. Em xin cảm ơn thầy Vương của Viện Công nghệ Thực phẩm và Sinh học, trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM đã giúp đỡ và hướng dẫn em trong quá trình em phân tích mẫu tại trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm bài báo này. Tuy nhiên vì kiến thức thực tế còn hạn hẹp do đó trong quá trình thực hiện bài đồ án tốt nghiệp khó có thể tránh được thiếu sót. Em rất mong được sự đóng góp của các thầy cô và bạn bè để có thêm về kiến thức chuyên môn. Em xin chân thành cảm ơn! Vũng Tàu, tháng 07 năm 2013 Sinh viên Nguyễn thị Nga Nghiên cứu khoa học 2013 MỞ ĐẦU  Lý do chọn đề tài Chitin là một polysaccharide đứng thứ hai về lượng trong tự nhiên chỉ sau cellulose.[3] Chitin và các sản phẩm của chúng hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý môi trường.[5] Ngoài ra khi ta khử acetylene trong hợp chất chitin sẽ tạo thành chitosan là đơn vị cao phân tử của glucosamine, là một chất có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, thực phẩm, nông nghiệp. Việc nghiên cứu và tách chiết chitin từ vỏ giáp xác đã được thực hiện hơn một thế kỷ nay. Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lượng tôm năm 2010 là 693,3 nghìn tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lượng nguyên liệu.[8] Tương ứng với sản lượng tôm hàng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm được tạo ra. Hiện nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn. Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao chitin – chitosan. Việc bảo quản các loại thực phẩm tươi sống giàu đạm dễ hư hỏng như: thịt, cá, rau quả …trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta là một trong những vấn đề đã và đang được quan tâm của các nhà sản xuất, chế biến và của các nhà khoa học thực phẩm. Chính vì vậy nên làm màng bao sinh học để bảo quản thực phẩm bằng màng bao sinh học từ chitosan đã và đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều năm qua.  Mục tiêu đề tài - Thu nhận chitin – chitosan từ vỏ tôm, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của bán thành phẩm thu được. - Thử nghiệm chế tạo màng bao sinh học ở quy mô phòng thí nghiệm từ nguồn chitosan tách chiết được. - Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến tính kéo đứt của màng chitosan thu nhận từ vỏ tôm - Khảo sát tác dụng của màng chitosan khi bảo quản táo xanh Mỹ. 1 Nghiên cứu khoa học 2013  Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết về nguyên liệu, chitin – chitosan. - Nghiên cứu quá trình khử khoáng và tách protein trong vỏ tôm để thu được chitin. - Nghiên cứu quá trình deacetyl chitin để tạo ra chitosan. - Nghiên cứu tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến tính kéo đứt của màng chitosan thu nhận từ vỏ tôm. - Nghiên cứu quá trình bảo quản táo xanh bằng màng chitosan. - Nghiên cứu các biến đổi của táo trong quá trình bảo quản.  Trình tự nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu và nội dung nghiên cứu trên chúng tôi tiến hành theo các trình tự như sau: - Nghiên cứu tài liệu, sách báo và tra cứu thông tin về nguyên liệu, quá trình điều chế ra chitin – chitosan và ứng dụng của chúng trong cuộc sống cũng như khoa học. - Tiến hành thực nghiệm tách chiết chitin từ nguyên liệu vỏ tôm. - Deacetyl chitin để thu chitosan , dùng phổ IR để xác đ ịnh mức độ deacetyl. Xác định một số chỉ tiêu của chitosan thu nhận được. - Tìm hiểu các yếu tố có ảnh hưởng đến sự tạo màng . Thực nghiệm và chọn ra các yếu tố có ảnh hưởng đến tính ch ất của màng. Tiến hành tối ưu các yếu tố này v ới mục tiêu xác định được các thông số kỹ thuật cần thiết cho việc chế tạo ra màng bao sinh học có tí nh kéo đứt tốt. - So sánh khả năng ứng dụng của màng trên sản phẩm táo qua khảo sát một số chỉ tiêu như trạng thái cảm quan , sự hao hụt khố i lượng, hàm lượng vitamin C , hàm lượng đư ờng khử, đường tổng, hàm lượng các acid hữu có trong mẫu táo sau thời gian bảo quản giữa mẫu táo có và không có bọc màng chitosan. 2 Nghiên cứu khoa học 2013 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chitin và chitosan 1.1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitosan trong tự nhiên Chitin – chitosan là một polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn đứng thứ hai sau cellulose. Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật. Chitin – chitosan là polysaccharide có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosaccharide (N-acetyl-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucoside và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các liên kết đồng hóa trị với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [4]. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống như cellulose [3]. 1.1.2. Chitin 1.1.2.1. Khái niệm Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monomer của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Ngoài ra chitin có ở thành tế bào nấm họ Zygenmycetas, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Trong động vật thủy sản đặc biệt là tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin khá cao, từ 14 – 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin – chitosan và các sản phẩm từ chúng [4]. Chitin có khối lượng phân tử lớn. Mchitin = (203,09)n [4]. Công thức phân tử chitin: (C8H13O5N)n [9]. Tùy thuộc vào loại nguyên liệu để chiết tách chitin mà giá trị n sẽ thay đổi như sau: Với tôm thẻ: n = 400 - 500 Với tôm hùm: Với cua: n = 700 - 800 n= 500 - 600 3 Nghiên cứu khoa học 2013 Qua nhiều nghiên cứu về sự thuỷ phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl--D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucoside.[9]. Công thức cấu tạo chitin được thể hiện dưới hình sau: Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin [9] Tên gọi: Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta có thể chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin [ 9]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ - chitin được mô tả như sau: α – chitin β - chitin γ – chitin α– chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo 4 Nghiên cứu khoa học 2013 chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. Có nhiều ở phần cứng vỏ động vật [9]. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β- chitin ) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin ), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β- chitin cũng có thể chuyển sang dạng α– chitin nhờ quá trình acetyl hoá cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Chúng có nhiều ở phần mềm của động vật [9]. 1.1.2.2. Tính chất vật lý của chitin Chitin có màu trắng, cũng giống như cellulose, chitin có tính kỵ nước cao và không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… Tính không tan của chitin là do chitin có cấu trúc chặt chẽ, có liên kết trong và liên phân tử mạnh thông qua các nhóm hydroxyde và acetamide. Tuy nhiên, β – chitin có tính trương nở với nước cao. Chitin bị hòa tan bởi dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 và dimethylacetamide chứa 5% lithiumchoride [9]. Chitin có cấu trúc rắn chắc hơn các polymer sinh học khác. Độ rắn cao của chitin sẽ thay đổi theo từng loại chitin được chiết rút ra từ các nguyên liệu khác nhau [5]. Chitin tự nhiên có độ deacetyl dao động trong khoảng từ 8 - 12%, phân tử lượng trung bình lớn hơn 1 triệu Dalton. Tuy nhiên, chitin chiết từ vi sinh vật thì có phân tử lượng thấp, chỉ khoảng vài chục nghìn Dalton [5]. Khả năng hấp thụ tia hồng ngoại của chitin ở bước sóng:  = 884 - 890µm [5]. 1.1.2.3. Tính chất hóa học Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D- glucosamim) có liên kết với nhau bởi các cầu nối glucoside và hình thành các mạng sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn liên kết đồng hóa trị với các protein, CaCO3, và các hợp chất hữu cơ khác [8]. Chitin tương đối ổn định với các chất oxy hóa, như thuốc tím (KMnO4), nước oxy già (H2O2), nước javen (NaClO) hay Ca(ClO)2…[9] lợi dụng tính chất này người ta sẽ khử chitin bằng các chất oxy hóa trên. Phản ứng thủy phân hoàn toàn xảy ra khi đun nóng chitin trong acid HCl đậm đặc sẽ thu được glucosamin. Quá trình thủy phân xảy ra đầu tiên ở cầu nối glucoside sau đó loại nhóm acetyl (-CO-CH3) [9]. (C32H54N4O21)x + 2(H2O)x → (C28H50N4O19)x + 2(CH3COOH)x Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan. Chitin+ n NaOHđđ → chitosan + n CH3COONa 5 Nghiên cứu khoa học 2013 Phản ứng este hóa: - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat [5]. - Chitin tác dụng với anhydride sunfuric trong pyridin, dioxan và N,Ndimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat [5]. Từ thế kỷ trước các nghiên cứu về việc hấp thu, tạo phức với kim loại nặng đã được thực hiện. Chitin có thể tạo phức với nhiều kim loại như đồng, chì, crom …[5] 1.1.3. Chitosan 1.1.3.1. Khái niệm Chitosan được xem như là polymer tự nhiên quan trọng nhất. Với đặc tính là có thể hoà tan tốt trong môi trường acid, chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm ... Giống như cellulose, chitosan là chất xơ song không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất của cấu trúc quang học… [8]. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan đã được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược, y học, xử lý nước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, hay tác nhân ổn định …[8] Cấu trúc của chitosan Chitosan là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glucoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly β-(1-4)-D- glucosamin (cấu trúc III) [9]. Hình 1.2. Công thƣ́c cấu tạo của chitosan (poly β -(1-4)-D- glucozamin) [9] 6 Nghiên cứu khoa học 2013 - Công thức phân tử: (C6H11O4N)n [9] - Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n [9] Tuy nhiên, trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%) [9]. Vì vậy công thức chính xác của chitosan được thể hiện như sau: Trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa. Chế phẩm này còn có tên là PDP: Poly- β - (1, 4) – D- glucosamin, hay còn gọi là Poly- β - (1- 4) – 2 – amino – 2- deoxy – D- glucose [9]. Chitosan có cấu trúc rất giống cellulose. Hình 1.3. Công thức so sánh cấu tạo của chitin, chitosan, cellulose [9] 1. Chitin 2. Chitosan 3. Cellulose 7 Nghiên cứu khoa học 2013 Như công thức ở hình 2.3, thì sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và cellulose là nhóm amin (-NH2) ở vị trí C2 của chitosan thay thế nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose. 1.1.3.2. Tính chất vật lý của chitosan Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. Chitosan có tính kiềm nhẹ, có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH = 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt [4]. Nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C [4]. Khi hoà tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb2+, Hg+…[8]. Trọng lượng phân tử trung bình: 10.000- 500.000 Dalton tùy loại. Loại PDP có trọng lượng phân tử trung bình từ 200.000 đến 400.000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và thực phẩm [4] . Do là một polycationic mang điện tích dương (pH<6,5) nên chitosan có khả năng bám dính trên các bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) [4]. Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể. [4] Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, như ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn như E.coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài [3]. 1.1.3.3. Tính chất hóa học của chitosan Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamin và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong các mắt xích D-glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế -OH, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O, N- [8]. Mặt khác chitin/chitosan là những polimer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: acid, base, tác nhân oxy-hóa và các enzyme thuỷ phân [8]. 8 Nghiên cứu khoa học 2013 a. Các phản ứng của nhóm –OH [8] - Dẫn xuất sunfat. - Dẫn xuất O-acyl của chitin/chitosan. - Dẫn xuất O–tosyl hoá chitin/chitosan. b. Phản ứng ở vị trí N [8] - Phản ứng N-acetyl hoá chitosan. - Dẫn xuất N-sunfat chitosan. c. - Dẫn xuất N-glycochitosan (N-hidrroxy-etylchitosan). Dẫn xuất acroleylen chitossan. Dẫn xuất acroleylchitosan. Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N [8] Dẫn xuất O, N–cacboxymetylchitosan. Dẫn xuất N, O-cacboxychitosan. - Phản ứng cắt đứt liên kết β-(1-4) glucoside - Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan. - Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan. d. Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp Hình 1.4. Công thƣ́c phức của chitosan với kim loại [8] 9 Nghiên cứu khoa học 2013 Trong phân tử chitin/chitosan và một số dẫn xuất của chitin có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử oxi và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+… tùy nhóm chức trên mạch polymer mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau [8]. Ví dụ: với ph ức Ni (II) nếu chitin có cấu trúc bát diện có số phối trí bằng 6, nếu chitosan có cấu trúc tứ diện có số phối trí bằng 4. e. Các phản ứng đặc trƣng khác của chitosan [9] - Phản ứng Van-Wisselingh: chitosan tác dụng với lugol tạo dung dịch màu nâu trong môi trường acid sunfuric có màu đỏ tím. - Phản ứng Alternative: tác dụng với acid sunfuric tạo tinh thể hình cầu chitosan sunfat làm mất màu dung dịch fucsin 1%. - Khử amin nhờ: Ba(BrO)2, AgNO3, N2O2…. - Cắt mạch bởi acid, enzyme, bức xạ. 1.1.3.4. Tính chất sinh học của chitosan - Vật liệu chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân huỷ sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [4]. - Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã được giải thích trong một số trường hợp. Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dương [4]. Một số cơ chế đã được giải thích như sau: + Nhờ tác dụng của những nhóm NH3+ trong chitosan lên các vị trí mang điện tích âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào làm cho quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Lúc này, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản cho sự phát triển bình 10 Nghiên cứu khoa học 2013 thường như glucose dẫn đến mất cân bằng giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào và cuối cùng dẫn đến sự chết của tế bào [7]. + Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd2+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm anion của bề mặt thành tế bào[4]. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng. + Điện tích dương của những nhóm NH3+của glucosamine monomer ở pH< 6,3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rò rỉ các phần tử ở bên trong màng tế bào. Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm của quá trình thuỷ phân có khả năng khuếch tán bên trong tế bào vi sinh vật với ADN dẫn đến sự ức chế mARN và sự tổng hợp protein tế bào [7] . + Chitosan có khả năng phá huỷ màng tế bào thông qua tương tác của những nhóm NH3+ với những nhóm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi khuẩn [7]. - Có tác dụng làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật tổng số trên bề mặt thực phẩm. Với hàm lượng 1,5% đã giảm số lượng vi sinh vật trên bề mặt cam là 93%, trên bề mặt quýt là 96%, trên bề mặt cà chua là 98% … [7] - Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [4]. - Chitosan là chất thân mỡ có khả năng hấp thụ dầu mỡ rất cao có thể hấp thu đến gấp 6-8 lần trọng lượng của nó. Chitosan phân tử có điện tích dương nên có khả năng gắn kết với điện tích âm của acid béo và acid mật tạo thành những chất có phân tử lớn không bị tác dụng bởi các enzyme tiêu hóa và do đó không bị hấp thụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài theo phân qua đó làm giảm mức cholesterol nhất là LDL-cholesterol, acid uric trong máu nên có thể giúp ta tránh các nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh gút, kiểm soát được tăng huyết áp và giảm cân [4]. - Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid, insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS [4]. - Chitosan chống tia tử ngoại, chống ngứa [4]. 11 Nghiên cứu khoa học 2013 1.1.4. Ứng dụng của chitin – chitosan 1.1.4.1. Ứng dụng chitosan trong ngành công nghệ thực phẩm a. Chất làm trong - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nƣớc quả Trong sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc. Thực tế hiện nay đang sử dụng các chất làm trong như: gelatin, bentonite, kali caseinat, tannin, polyvinyl pyrovinyl ... chitosan là tác nhân tốt loại bỏ độ đục, giúp điều chỉnh acid trong nước quả. Đối với dịch quả táo, nho, chanh, cam không cần qua xử lý pectin, sử dụng chitosan để làm trong. Đặc biệt nước táo, độ đục có thể giảm tối thiểu chỉ ở mức xử lý với 0,8 kg/m3 mà không hề gây ảnh hưởng xấu tới chỉ tiêu chất lượng của nó. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn với các polyphenol như catechin, proanthocyanydin, acid cinamic, dẫn xuất của chúng; những chất mà có thể biến màu nước quả bằng phản ứng oxy hóa [13]. b. Sử dụng trong thực phẩm chức năng Chitosan có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu. Nếu sử dụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4% chitosan thì lượng cholesterol trong máu giảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần. Ngoài ra chitosan còn xem là chất chống đông tụ máu. Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong huyết và chống đông tụ máu được biết là ngăn không cho tạo các micelle. Điều chú ý là, ở pH = 6- 6,5 chitosan bắt đầu bị kết tủa, toàn bộ chuỗi polysacchride bị kết lắng và giữ lại toàn bộ lượng micelle trong đó [4]. Chính nhờ đặc điểm quan trọng này chitosan ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm chức năng. c. Thu hồi protein Nước Whey được coi là chất thải của trong công nghiệp sản xuất format, nó có chứa lượng lớn lactose và protein ở dạng hòa tan. Nếu thải trực tiếp ra ngoài nó gây ô nhiễm môi trường, còn nếu xử lý nước thải thì tốn kém trong vận hành hệ thống mà hiệu quả kinh tế không cao. Việc thu hồi protein trong whey được xem là biện pháp làm tăng hiệu quả kinh tế của sản xuất format. Whey protein khi thu hồi được bổ sung vào đồ uống, thịt băm, và các loại thực phẩm khác. Đã đưa ra nhiều phương pháp khác nhau nhằm thu hồi protein này và chitosan được coi mang lại hiệu suất tách cao nhất. Tỷ lệ chitosan để kết bông các chất lơ lửng là 2,15% (30mg/lit); độ đục thấp nhất ở pH 6,0. Nghiên cứu về protein thu được bằng phương pháp này: không hề có sự khác biệt về giá trị giữa protein có chứa chitosan và protein thu được bằng đông tụ casein hoặc whey protein [4]. Ngoài việc thu h ồi protein từ whey, người ta sử dụng chitosan trong thu hồi các acid amin trong nước của sản xuất đồ hộp , thịt, cá … 12 Nghiên cứu khoa học 2013 d. Phân tách rƣợu - nƣớc Chitosan đã được xử lý đặc biệt để tạo ra dạng màng rỗng. Với việc điều chỉnh tốc độ thẩm thấu (lượng chất lỏng đi qua màng khoảng 1m2/giờ ). Màng này được sử dụng trong hệ thống phản ứng đòi hỏi không dùng nhiệt độ quá cao. Việc phân tách này chỉ loại đi nước, kết quả là hàm lượng ethanol có thể lên đến 80 % [3]. e. Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả) Lớp màng không độc bao toàn bộ khu cư trú từ bề mặt khối nguyên liệu nhằm hạn chế sự phát triển vi sinh vật bề mặt nguyên nhân chính gây thối hỏng thực phẩm. Màng chitosan cũng có lợi ích lớn với việc làm cứng thịt quả, ổn định acid, làm chậm phản ứng tổng hợp anthocyanin trong dâu tây khi để ở 40C. Sau 31 ngày thịt quả cứng hơn, độ acid ổn định hơn so với việc sử dụng thuốc diệt nấm. Ngoài ra nó còn làm giảm tỷ lệ “nâu hóa”. Điều này được chỉ ra bởi nó làm giảm lượng anthocyanin chứa trong quả. Nấm là thủ phạm chính dễ gây thối quả nhất, trong khi đó ưu điểm của chitosan là khả năng kháng n ấm. Thêm vào đó, màng chitosan gần giống như môi trường bên ngoài mà không gây ra nguyên nhân hô hấp kị khí, nó có thể hấp thu chọn lọc tới oxy nhiều hơn là carbonic [12]. Một nghiên cứu khác trên tỏi và hạt tiêu chỉ ra rằng màng chitosan rõ ràng đã làm giảm tổn thất hạt ở 13-200C (độ ẩm tương đối 85%), bằng việc nhúng dung dịch nồng độ 1,5%. Mức độ hô hấp, mất màu, bị héo, hay bị nhiễm n ấm giảm đi đáng kể [12]. Các kiểm tra trên hạt tiêu xanh, khoai tây, carrot, củ cải, hành tây cho thấy ch ỉ có khoai tây và hạt tiêu xanh có phản ứng lại với màng, không làm giảm sự khối lượng thực phẩm, làm chậm lại sự lão hóa. Khả năng ngăn ch ặn quá trì nh hư th ối cũng đã tìm thấy ở carrot, củ cải, măng tây được phủ màng. Chất màng này cũng có thể gây hại đến các loại quả bằng cách làm tăng khả năng thối hỏng. Việc sử dụng 2% (w/v) màng chitosan cho hạt tiêu xanh làm giảm sự hư thối, giảm nâu, tăng CO2 và làm giảm O2 bên trong màng [12]. Trong khi đó nó cũng không có hiệu qu ả với các quả, củ có hơi nước bị mất thông qua các sẹo trên củ như khoai tây. Tuy vậy lớp màng này giảm tỷ lệ nâu hóa trong hơn 12 ngày của quá trình bảo quản. Ngoài việc chỉ s ử dụng màng chitosan để bảo quản , hiện nay ở Việt Nam có sự kết hợp giữa bảo quản bởi màng chitosan và PE. Qui trình bảo quản trái quýt đường với thời gian tồn trữ đến 8 tuần. Đó là bảo quản trái bằng cách bao màng chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao polyethylene có đ ục 5 lỗ với đường kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép. 13 Nghiên cứu khoa học 2013 Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 120C [12]. Với phương pháp này, phẩm chất bên trong trái như: hàm lượng đường, hàm lượng vitamin C... luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt trọng lượng thấp, màu sắc vỏ trái đồng đều và đẹp. 1.1.4.2. Ứng dụng trong nghành công nghiệp khác a. Trong y dƣợc [4] Từ chitosan vỏ cua, vỏ tôm có thể sản xuất glucosamin, một dược chất quý dùng để chữa khớp đang phải nhập khẩu ở nước ta [4]. Ngoài ra còn sản xuất ra một số chất như: - Da nhân tạo. - Kem chống khô da. - Kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da. - Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng. b. Trong công nghiệp [7] - Vải col dùng cho may mặc. - Vải chịu nhiệt, chống thấm. - Vải chitosan dùng cho may quần áo diệt khuẩn trong y tế. - Làm tăng độ bền của giấy. - Dùng làm thấu kính tiếp xúc. c. Trong nông nghiệp [7] - Bảo quản quả, hạt giống mang lại hiệu quả cao. - Dùng như một thành chính trong thuốc trừ nấm bệnh (đạo ôn, khô vằn…). - Dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng cho lúa, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh … - Không tan trong nước. - Tan trong acid loãng như acid acetic. d. Trong các ngành công nghệ khác [3] - Dùng làm mực in cao cấp trong công nghệ in. - Tăng độ bám dính của mực in. - Trong công nghệ môi trường. - Xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu quả. - Xử lý nước thải trong công nghiệp nhuộm vải. - Xử lý nước trong công nghiệp nuôi tôm, cá. 14 Nghiên cứu khoa học 2013 e. Trong công nghệ sinh học [3] Chất mang cố định enzyme và cố định tế bào. 1.1.5. Nguồn thu nhận chitin – chitosan Chitin – chitosan được chiết xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: phế liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn… tuy nhiên nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan là phế liệu thủy sản, đặc biệt là vỏ tôm, ghẹ, mực. Tùy theo từng nguyên liệu mà hàm lượng chitin biến đổi khác nhau, trong đó nang mực có hàm lượng chitin cao nhất kế đến là tôm sú và tôm thẻ. Bảng 1.1. Thành phần hóa học một số phế liệu thủy sản để sản xuất chitin [9] Nguyên liệu Thành phần hóa học (%) Độ ẩm Protein Khoáng Lipid Chitin Vỏ cua xanh 4,5 24,0 56,0 2,0 12,9 Vỏ ghẹ chấm 12,9 10,3 57,9 0,3 17,1 Đầu tôm sú 9,1 26,8 29,3 0,5 34,9 Vỏ tôm sú 9,7 42,8 20,8 1,2 36,5 Nang mực 6–8 7–8 0,7 - 1 - 75– 80 Vì thành phần của mỗi nguyên liệu khác nhau nên quy trình chiết xuất chitin – chitosan cũng khác nhau. Trong nghiên cứu này sử dụng nguyên liệu là vỏ tôm nên chúng tôi xin tổng quan qua các vấn đề liên quan đến vỏ tôm: 1.1.5.1. Thành phần phế liệu tôm Bảng 1.2. Thành phần hóa học của vỏ tôm [9] STT Thành phần (% khối lượng) Trong vỏ tôm tươi Trong vỏ tôm khô 1 2 3 4 Muối khoáng (%) Protein (%) Chitin (%) Sắc tố (%) 12,25 8,05 4,50 Chưa xác định 45,16 23,25 27,50 Chưa xác định 5 Độ ẩm (%) 75 4 Phế liệu tôm từ các cơ sở chế biến là những phần phế thải như đầu, vỏ, chân và đuôi tôm. Trong thành phần của tôm, phần đầu chiếm khoảng 35 = 45% khối lượng, phần vỏ, chân và đuôi chiếm khoảng 10 -15%. Như đã nói trên, thành phần hóa sinh của vỏ tôm gồm có chitin, protein, chất khoáng, lipid, và các sắc tố. Tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn định mà thay đổi giữa các giống, loài, đặc điểm, sinh thái, sinh lý cũng như giai đoạn phát triển con tôm. 15