Tài liệu Thử nghiệm sản xuất men rượu trên cơ chất mầm lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT MEN RƢỢU TRÊN CƠ CHẤT MẦM LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG NGUYỄN MINH ĐỜI MSSV: 3082508 LỚP: CNSH TT K34 Cần Thơ, Tháng 5/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. Ngô Thị Phương Dung Nguyễn Minh Đời DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………….………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ -------------------------------Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu Trường, Ban Lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi vô cùng biết ơn Cô Ngô Thị Phương Dung, người hướng dẫn đề tài, người Thầy đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những tri thức bổ ích, tác phong làm việc, tư duy khoa học, đã quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng rất biết ơn Thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình quan tâm, giúp đỡ và cho tôi những góp ý quý báo trong quá trình thực hiện các thí nghiệm cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Thầy Nguyễn Hữu Hiệp, cố vấn học tập, người Thầy đáng kính đã luôn tận tình quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, Thầy cũng đã truyền đạt cho tôi những tri thức bổ ích trong lĩnh vực vi sinh vật học. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô đã giảng dạy và truyền đạt tri thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường. Xin chân thành cảm ơn anh Phạm Hồng Quang đã quan tâm, đóng góp ý kiến giúp tôi hoàn thành đề cương luận văn cũng như luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh – quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm và quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến các Anh Chị học viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Nguyễn Minh Đời Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Nguồn men giống ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng rượu thành phẩm, các loại men trên thị trường thường không thuần chủng, bị lẫn tạp nhiều loại vi sinh vật gây hại làm giảm năng suất và chất lượng rượu. Đề tài được thực hiện nhằm mục đích thử nghiệm sản xuất men rượu thuần Saccharomyces cerevisiae trên cơ chất mầm lúa đồng thời kết hợp với nấm mốc thuần Amylomyces rouxii để thử nghiệm khả năng lên men của men rượu thuần. Men rượu thuần được sản xuất trên cơ chất là bột gạo và bột mầm lúa với các tỷ lệ phối trộn khác nhau gồm: A1 (toàn bộ cơ chất là bột mầm lúa), A2 (1:0,5) A3 (1:1), A4 (1:2) và A5 (1:3). Kết quả cho thấy men thuần sản xuất trên cơ chất bột mầm lúa không phối trộn bột gạo đạt mật số nấm men 8,13 log CFU/g và cho độ rượu cao nhất 11,3% (v/v ở 20°C). Bột mốc thuần Amylomyces rouxii sản xuất trên cơ chất bột bắp và vỏ trấu đạt mật số cao (8,74 log CFU/g) được bổ sung vào men thuần với tỷ lệ khác nhau (0,5%, 1%, 1,5%, và 2% w/w) và xác định tỷ lệ bổ sung bột mốc thích hợp là 1% cho khả năng lên men cao nhất đạt độ rượu 12,67% (v/v). Thời gian thích hợp cho quá trình lên men của men rượu thuần cũng được xác định là 2 ngày cho quá trình lên men hiếu khí và ủ kín 4 ngày cho quá trình lên men kỵ khí, khi đó độ rượu đạt được là 13,67% (v/v). Kết quả sản xuất thử nghiệm với 8 kg gạo, năng suất rượu thành phẩm đạt 1,23 lít rượu 30% trên 1 kg nguyên liệu. Kết quả kiểm định các chỉ tiêu lý hóa cho thấy hàm lượng methanol và furfural đạt mức cho phép, đặc biệt hàm lượng aldehyde đạt mức cho phép khi chưng cất tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học (33,8 mg/L) và được hạn chế đáng kể khi chưng cất tại cơ sở sản xuất rượu ở địa phương (135,0 mg/L). Ngoài ra, rượu thành phẩm được chấp nhận về mặt cảm quan. Do đó, men rượu thuần sản xuất trên cơ chất mầm lúa có triển vọng ứng dụng trong sản xuất tại cơ sở sản xuất rượu ở địa phương. Từ khóa: Amylomyces rouxii, lên men, mầm lúa, men rượu thuần, Saccharomyces cerevisiae. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... v CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................................... vi CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................... 1 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Hệ vi sinh vật trong men làm rƣợu................................................................... 3 2.1.1. Nấm men ....................................................................................................... 3 2.1.2. Nấm mốc ....................................................................................................... 4 2.1.3. Vi khuẩn ........................................................................................................ 4 2.2. Sơ lƣợc về hệ enzyme trong mầm lúa ............................................................... 4 2.2.1. Enzyme amylase ........................................................................................... 4 2.2.2. Hệ enzyme amylase trong mầm lúa .............................................................. 5 2.3. Quy trình sản xuất men rƣợu ........................................................................... 6 2.3.1. Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền ........................................................ 6 2.3.2. Quy trình sản xuất men rượu đế thuần ......................................................... 7 2.4. Quá trình lên men rƣợu ..................................................................................... 9 2.4.1. Cơ chế quá trình lên men .............................................................................. 9 2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa ......................................... 10 2.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình rượu hóa....................................... 10 2.5. Quy trình sản xuất rƣợu truyền thống ở Đồng bằng Sông Cửu Long ........ 12 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14 3.1. Phƣơng tiện thí nghiệm ................................................................................... 14 3.1.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................. 14 3.1.2. Nguyên liệu ................................................................................................. 14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 3.1.3. Hóa chất ...................................................................................................... 14 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 14 3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm ................................................................................. 15 3.2.1. Sản xuất bột men rượu sử dụng bột mầm lúa làm cơ chất ......................... 15 3.2.2. Sản xuất bột nấm mốc từ nấm mốc Amylomyces rouxii ............................. 17 3.2.3. Khảo sát tỷ lệ phối trộn giữa bột mốc với bột men .................................... 20 3.2.4. Khảo sát thời gian lên men hiếu khí và lên men kỵ khí ............................. 21 3.2.5. Sản xuất rượu ở quy mô sản xuất thử nghiệm ............................................ 21 3.2.6. Phương pháp phân tích ............................................................................... 23 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 24 4.1. Sản xuất bột men rƣợu sử dụng bột mầm lúa làm cơ chất .......................... 24 4.1.1. Mật số nấm men có trong các nghiệm thức bột men đã sản xuất ............... 24 4.1.2. Hoạt tính lên men rượu của các nghiệm thức bột men đã sản xuất ............ 25 4.2. Sản xuất bột mốc Amylomyces rouxii ............................................................. 27 4.3. Tỷ lệ phối trộn giữa bột mốc với bột men ...................................................... 27 4.4. Thời gian quá trình lên men hiếu khí và quá trình lên men kỵ khí ............ 28 4.5. Sản xuất rƣợu ở quy mô sản xuất thử nghiệm .............................................. 30 4.5.1. Kết quả năng suất lên men .......................................................................... 30 4.5.2. Kết quả kiểm định các chỉ tiêu lý, hóa của rượu ........................................ 32 4.5.3. Kết quả đánh giá cảm quan rượu thành phẩm ............................................ 32 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 34 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 34 5.2. Đề nghị............................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 35 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Kết quả khảo sát tỷ lệ phối trộn bột mốc ........................................................ 27 Bảng 2. Kết quả khảo sát thời gian lên men .................................................................. 29 Bảng 3. Năng suất lên men rượu từ men thuần sản xuất trên cơ chất mầm lúa ............ 31 Bảng 4. Kết quả phân tích các chỉ tiêu lý, hóa của rượu thành phẩm ........................... 32 Bảng 5. Kết quả đánh giá cảm quan của rượu thành phẩm ........................................... 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền .............................................................. 6 Hình 2. Quy trình tổng quát sản xuất men rượu đế thuần ............................................... 8 Hình 3. Quy trình sản xuất rượu đế tại Đồng bằng Sông Cửu Long ............................. 13 Hình 4. Quy trình sản xuất bột men rượu sử dụng mầm lúa làm cơ chất ..................... 15 Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng lên men rượu của bột men ..................... 17 Hình 6. Quy trình sản xuất bột mốc thuần Amylomyces rouxii ..................................... 18 Hình 7. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả năng đường hóa của bột mốc .......................... 19 Hình 8. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tỷ lệ phối trộn giữa bột mốc với bột men .............. 20 Hình 9. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát thời gian đường hóa và rượu hóa ........................... 21 Hình 10. Sơ đồ thí nghiệm sản xuất rượu ở quy mô thử nghiệm .................................. 22 Hình 11. Mật số nấm men có trong các nghiệm thức bột men theo các nghiệm thức bột men ........................................................................................................... 24 Hình 12. Độ rượu sau lên men theo các nghiệm thức bột men ..................................... 25 Hình 13. Độ Brix sau lên men theo các nghiệm thức bột men...................................... 26 Hình 14. Sự phát triển của hệ khuẩn ty nấm mốc sau 1 ngày ủ .................................... 28 Hình 15. Sơ đồ quy trình lên men thử nghiệm .............................................................. 30 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU Colony forming unit CNSH Công nghệ sinh học HN men Hà Nội do cơ sở Thi ở Vĩnh Long sử dụng để sản xuất rượu PP Polypropylene TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam V/v Volume/volume W/w Weight/weight Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Rượu là loại thực uống mang đậm bản sắc văn hóa của người Việt Nam, thưởng thức rượu đã là một phần không thể thiếu trong các hoạt động văn hóa của dân tộc như lễ hội, cưới xin. Ở mỗi vùng miền, tuy rượu có hương vị và cách thưởng thức khác nhau nhưng đều được dùng làm phương tiện để bày tỏ lòng hiếu khách của người dân. Trong quá trình sản xuất rượu đế, men rượu là nhân tố đóng vai trò quan trọng, quyết định chất lượng và năng suất của quá trình lên men. Trên thực tế, các cơ sở sản xuất rượu đế nói chung và các cơ sở sản xuất rượu đế tại Đồng bằng Sông Cửu Long nói riêng sử dụng rất đa dạng các chủng men rượu với nguồn gốc khác nhau. Việc sử dụng men rượu giống không được đảm bảo sẽ ảnh hưởng đến chất lượng và năng suất của rượu thành phẩm. Bên cạnh đó thì việc sử dụng men giống thuần trong lên men rượu đế mang lại nhiều lợi ích như: men có hoạt tính cao và ổn định, không bị nhiễm tạp bởi các vi sinh vật gây hại, cho chất lượng và hương vị rượu thơm ngon phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng, đặc biệt là chủng nấm men đã được định danh và đảm bảo an toàn thực phẩm. Thành phần của đa số các loại men rượu trên thị trường gồm nấm men và nấm mốc nên đảm bảo được quá trình chuyển hóa tinh bột thành rượu. Tuy nhiên, men rượu có bổ sung enzyme amylase ngày càng được chú ý vì tiện lợi khi sử dụng mà còn giúp quá trình lên men diễn ra ổn định và đạt năng suất cao. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính lên men cao, ổn định và đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc bổ sung enzyme amylase từ mầm lúa vào bột nấm men Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu khá thành công và rất có tiềm năng đưa vào ứng dụng trong sản xuất rượu đế tại nông hộ. Nhằm khảo sát một cách đầy đủ hơn việc bổ sung enzyme amylase vào men rượu cũng như cải thiện chất lượng men rượu, đề tài “Thử nghiệm sản xuất men rƣợu trên cơ chất mầm lúa” được đề nghị. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là sản xuất và khảo sát hoạt tính bột men rượu từ nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng bột mầm lúa làm cơ chất. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài dự kiến thực hiện thông qua các bước sau:  Sản xuất bột men rượu Saccharomyces cerevisiae sử dụng bột mầm lúa và bột gạo làm cơ chất với các tỷ lệ khác nhau.  Khảo sát mật số nấm men trong các nghiệm thức men rượu đồng thời khảo sát hoạt tính của các nghiệm thức men rượu để chọn ra nghiệm thức thích hợp nhất.  Sản xuất bột mốc, khảo sát mật số và hoạt tính đường hóa của bột mốc.  Khảo sát tỷ lệ phối trộn của bột mốc vào bột men.  Khảo sát thời gian lên men đối với cả hai giai đoạn lên men hiếu khí và lên men kỵ khí.  Khảo sát khả năng ứng dụng của bột men, mốc đã sản xuất ở quy mô sản xuất thử.  Đánh giá rượu thành phẩm thông qua các chỉ tiêu lý, hóa và cảm quan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Hệ vi sinh vật trong men làm rƣợu Hệ vi sinh vật chính trong viên men rượu bao gồm nấm men, nấm mốc và vi khuẩn (Hesseltine et al., 1988; Lim, 1991). Một số dòng nấm mốc gồm Amylomyces rouxii, Rhizopus spp., Mucor spp., Aspergillus spp. Các dòng nấm men phổ biến gồm có Saccharomyces cervisiae, Hansenula spp. và Endomycopis spp. (Steinkraus, 1997; Nout và Aidoo, 2002). Cơ chất thường dùng để sản xuất men rượu là bột gạo, bột sắn, bột bắp,… Hệ vi sinh vật được giữ khô và tồn tại ở trạng thái nghỉ, các hoạt động sinh lý được giảm thiểu nên viên men có thể được bảo quản trong một thời gian nhất định. Trong quá trình sản xuất rượu, khi men rượu được chủng vào nguyên liệu thì các vi sinh vật có trong viên men sẽ chuyển sang trạng thái hoạt động. Khi đó, vai trò chủ yếu của nấm mốc là chuyển hóa tinh bột có trong nguyên liệu thành đường và nấm men sử dụng đường để chuyển hóa thành rượu trong giai đoạn lên men kỵ khí. Chất lượng rượu và năng suất lên men ngoài phụ thuộc vào nguyên liệu thì còn chịu ảnh hưởng lớn từ men rượu. 2.1.1. Nấm men Nấm men thường được sử dụng trong viên men là nấm men Endomycopsis và Saccharomyces. Nấm men Endomycopsis chủ yếu là Endomycopsis fibuligers, loài giả nấm men có khả năng tổng hợp enzyme amylase, glucoamylase do đó chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, fructose, maltose, rafinose, galactose. Nấm men có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (36 - 40°C) và chịu được môi trường acid. Đặc điểm quan trọng nhất là Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, nếp, ngô, khoai, sắn cho nồng độ rượu trong dung dịch lên men 10 - 12% với nhiệt độ lên men thích hợp là 28 - 32ºC (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Ngoài hai chi nấm men cơ bản trên thì trong một số bánh men thuốc bắc còn có nhiều loài nấm men dại khác, chúng vừa có khả năng phân hủy tinh bột vừa có khả năng chuyển đường thành rượu, tuy sự chuyển hóa này thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao có khi lên tới 60 - 65°C và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05 - 1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT Trong một nghiên cứu về đặc tính của 29 mẫu men rượu tại Việt Nam, mật số nấm men trong các mẫu men rượu được khảo sát trong khoảng 5,8 - 7,2 log CFU/g (Dung et al., 2007). 2.1.2. Nấm mốc Trong quá trình lên men rượu từ các nguyên liệu giàu tinh bột như gạo, nếp, khoai, sắn thì nấm mốc đóng vai trò rất quan trọng. Trong giai đoạn đường hóa, hệ enzyme amylase từ nấm mốc đảm nhận quá trình thủy phân tinh bột. Mật số nấm mốc trong viên men trên thị trường vào khoảng 3,4 - 6 log CFU/g (Dung et al., 2007). Nấm mốc được sử dụng trong các loại men rượu thuốc bắc chủ yếu thuộc các chi Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus. Loài Mucor rouxii có nhiều đặc tính tốt như khả năng chịu được nhiệt độ cao 32 - 35°C (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Nấm mốc Amylomyces rouxii phân lập từ viên men trên thị trường có khả năng đường hóa cao với hoạt tính của enzyme amyloglucosidase lên đến 0,6 U/g đạt nồng độ glucose trong dịch đường hóa là 25% w/w (Dung et al., 2006) 2.1.3. Vi khuẩn Các loài vi khuẩn trong viên men chủ yếu là vi khuẩn acid lactic và vi khuẩn acid acetic. Các loài vi khuẩn này làm giảm pH của môi trường. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi vì pH của môi trường thấp tạo điều kiện thuận lợi nấm men và nấm sợi phát triển. Tuy nhiên nếu pH giảm xuống quá thấp sẽ ảnh hưởng không tốt cho quá trình lên men. Mặc khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acid acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic, quá trình này làm giảm năng suất lên men (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Mật số của vi khuẩn trong 29 mẫu men rượu Việt Nam được khảo sát vào khoảng 2,6 - 6,2 CFU/g (Dung et al., 2007). 2.2. Sơ lƣợc về hệ enzyme amylase trong mầm lúa 2.2.1. Enzyme amylase Amylase là enzyme thủy phân, xúc tác phản ứng phân giải các liên kết trong chuỗi polysaccharide với sự tham gia của nước. Enzyme amylase có khả năng phân cắt các phân tử tinh bột tạo sản phẩm là dextrin và những phân tử ngắn hơn có đơn vị cấu trúc là phân tử glucose (Windish và Mhatre, 1965). Enzyme amylase được tìm thấy trong nấm mốc, mầm lúa, hạt đại mạch nẩy mầm, bắp nẩy mầm,… Enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì khác nhau về tính chất và cơ chế xúc tác cũng như sản Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT phẩm cuối của quá trình thủy phân cũng khác nhau. Enzyme có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp (Pandey et al., 2000). Enzyme amylase có sáu loại và được xếp vào hai nhóm là endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào). Endoamylase gồm có -amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh gồm hai loại là enzyme khử nhánh trực tiếp là pullulanase (hay dextrin 6-glucosidase); enzyme khử nhánh gián tiếp là transglucosylase (hay oligo 1,6glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Enzyme -amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1-4) của cơ chất một cách ngẫu nhiên tạo thành maltose, dextrin và glucose. Dextrin 6--glucosidase tác động lên amylopectin và chuyển hóa thành maltose. Oligo 1,6-glucosidase thủy phân các liên kết (1-6) trong cơ chất. Maylo-1,6-glucosidase phân cắt liên kết -1,6 có trong mạch nhánh của cơ chất như glucogen và amylopectin. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. β-amylase xúc tác sự thủy phân liên kết (1-4) tạo thành glucose và maltose. Enzyme γ-amylase có thể thủy phân tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin thành glucose. 2.2.2. Hệ enzyme amylase trong hạt ngũ cốc và mầm lúa Enzyme amylase hiện diện trong cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Ở thực vật hệ enzyme amylase xuất hiện trong quá trình nẩy mầm của các loại hạt ngũ cốc như lúa gạo, nếp, lúa mì, bắp,... Trong quá trình nẩy mầm của hạt, mầm cần nhiều chất dinh dưỡng để phát triển do đó hệ enzyme hoạt động rất mạnh trong giai đoạn này để phân cắt tinh bột thành đường cung cấp năng lượng cho sự phát triển của mầm. Acid gibberellic hoạt động như một hormone thúc đẩy quá trình tổng hợp hệ enzyme amylase trong hạt. Enzyme phân giải tinh bột như α-amylase, β-amylase và glucanase được tổng hợp trong quá trình nẩy mầm của hạt, hệ enzyme này tập trung phần lớn ở phôi mầm và một ít tập trung ở phần dưới của nội nhũ hoặc trong màng ngăn giữa vỏ trấu và nội nhũ. Hoạt tính của hệ enzyme bắt đầu tăng trong giai đoạn đầu của quá trình nẩy mầm, đặc biệt vào ngày thứ 3 và 4. Hoạt tính của hệ enzyme amylase trong mầm lúa đạt cao nhất sau 4 ngày ủ (Bùi Duy Nhân, 2010). Enzyme này thủy phân tinh bột có trong hạt gạo tạo thành maltose và dextrin. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme là 72 - 76°C và pH 5,8. Trong hạt đại mạch, enzyme β-amylase hoạt động tốt ở pH 5,5 - 5,8 và Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT nhiệt độ tối ưu 55 - 60°C. Enzyme β-amylase phân cắt tinh bột trong đại mạch thành đường maltose và dextrin. Hệ enzyme trong mầm lúa có thể được bổ sung vào bột men rượu để lên men rượu từ gạo. Với tỷ lệ phối trộn giữa bột enzyme mầm lúa và bột men là 3 : 1 thì nồng độ rượu sinh ra đạt 6,5% (v/v). Nếu sử dụng thêm bột mốc Amylomyces rouxii với tỷ lệ 1% thì độ rượu sinh ra có thể đạt được 12% (v/v) (Nguyễn Thị Bé Lan, 2011). 2.3. Quy trình sản xuất men rƣợu 2.3.1. Quy trình sản xuất men rƣợu cổ truyền Men rượu trong dân gian được sản xuất theo nhiều cách thức khác nhau, sử dụng cơ chất và phương pháp đa dạng tạo ra nhiều loại bánh men khác nhau như bánh men rượu lá, bánh men rượu thường, men rượu thuốc bắc. Bên cạnh đó sự khác biệt giữa các vùng, miền cũng làm nên tính phong phú trong phương thức sản xuất men rượu. Tuy vậy, quy trình sản xuất men rượu đều bao gồm một số giai đoạn chính như chuẩn bị cơ chất, chuẩn bị men giống, phối trộn men, ủ và phơi sấy để tạo men thành phẩm. Gạo hoặc khoai mì Men giống Thuốc bắc Ngâm nước Nghiền mịn Nghiền mịn Để ráo nước Nghiền thành bột Trộn đều Nước (Độ ẩm 55 - 60%) Làm thành viên Xếp ra nong có lớp trấu mỏng ở trên và dưới các bánh men Ủ ở nhiệt độ phòng (28 - 30°C) trong 4 ngày Men rượu Hình 1. Quy trình sản xuất men rƣợu cổ truyền (Dung et al., 2005) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT Các loại men trên thị trường được sản xuất trên nhiều loại cơ chất chứa tinh bột khác nhau như bột khoai mì, bột gạo, bột bắp,… Ngoài ra còn có một số loại men rượu thuốc bắc được bổ sung thêm các thành phần thuốc bắc như tiểu hồi, đinh hương, cam thảo,… Enzyme amylase có trong mầm lúa có hoạt tính cao trong việc phân giải phân tử tinh bột thành các phân tử đường ngắn mà vi sinh vật có thể sử dụng được để sinh trưởng và phát triền. Việc bổ sung bột mầm lúa làm cơ chất sản xuất bột men nhằm nâng cao mật số nấm men và khả năng gia tăng sinh khối của nấm men trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. 2.3.2. Quy trình sản xuất men rƣợu đế thuần Trên thực tế, cơ chất và chủng loại men giống được sử dụng trong sản xuất men cổ truyền rất đa dạng, nguồn men giống không được xác định rõ ràng. Thao tác sản xuất thủ công, điều kiện vô trùng không được đảm bảo nên rất dễ bị xâm nhiễm bởi các loài vi sinh vật không mong muốn. Do đó men rượu trên thị trường thường cho kết quả lên men không ổn định, chất lượng rượu và độ an toàn chưa được đảm bảo. Chính vì lý do đó việc sản xuất men rượu thuần với nguồn men giống được đảm bảo sẽ giúp nâng cao được năng suất lên men, chất lượng rượu cũng như cải thiện tính ổn định của men rượu trong quá trình sản xuất rượu đế. Tuy vây, để đảm bảo được giá trị truyền thống, nét đặc sắc của hương vị và văn hóa thưởng thức rượu thì quy trình sản xuất men rượu thuần cũng cần phải dựa trên quy trình sản xuất thủ công truyền thống. Với mục tiêu sản xuất men rượu thuần cải thiện chất lượng rượu lên men tại vùng Đồng bằng Sông Cửu Long. Từ 29 mẫu men rượu tại Đồng bằng Sông Cửu Long, Dung et al. (2007) đã phân lập được 53 dòng nấm mốc, 51 dòng nấm men và 15 dòng vi khuẩn. Các dòng nấm mốc và nấm men được khảo sát hoạt tính nhằm tuyển chọn ra nguồn giống mốc và men có khả năng lên men tốt để ứng dụng vào sản xuất men rượu thuần. Kết quả đã xác định được dòng nấm mốc có khả năng đường hóa cao là Amylomyces rouxii và dòng nấm men có hoạt tính lên men mạnh là Saccharomyces cerevisiae (Dung et al., 2007). Quy trình sản xuất men rượu thuần sử dụng nguồn giống vi sinh trên đã đươc nghiên cứu và đề xuất, quy trình được trình bày ở Hình 2. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Bột gạo 80 g bột khoai mì 20 g Sấy 100°C qua đêm (17 giờ) Trường ĐHCT Tiểu Hồi (Foeniculum vulgare M.) Đinh Hương (Syzygium aromaticum L.) Ly trích trong nước cất (100 mL nước cất cho 5 g) Lọc qua giấy lọc và màng Để nguội ° 30 - 40 C Trộn dịch thảo mộc với lượng như nhau Nấm mốc A. rouxii nấm men S. cerevisiae Ủ A. rouxii và S. cerevisiae trong môi trường thạch nghiêng ở 30°C Thêm nước muối 0,85% vô trùng để lấy sinh khối mốc và men Huyền phù nấm mốc Huyền phù nấm men Thêm nước cất vô trùng để đạt độ ẩm 30% Trộn đều Ủ ở 30°C trong 24 giờ Sấy khô hạt trên khai đục lỗ Men rượu thuần Đóng giói và tồn trữ Hình 2. Quy trình tổng quát sản xuất men rƣợu đế thuần (Dung, 2005) Men rượu thuần Amylomyces rouxii và Saccharomyces cerevisiae sản xuất trên cơ chất bột gạo 80% và bột khoai mì 20% có khả năng lên men được nhiều nguồn cơ chất tinh bột khác nhau. Vi khuẩn thường xâm nhiễm trong bột men rượu thuần là Bacillus subtilis/amyloliquefaciens ở mật số thấp (2 log CFU/g) nhưng không gây ngộ độc thực phẩm và không gây hại cho sức khỏe con người (Ngo Thi Phuong Dung và Huynh Xuan Phong, 2011). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 2.4. Quá trình lên men rƣợu 2.4.1. Cơ chế quá trình lên men Quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hóa từ tinh bột thành rượu được thực hiện bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng vai trò chủ yếu là của nấm men và nấm mốc. Quá trình lên men rượu gạo gồm hai giai đoạn chính: - Quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường (đường hóa): trong giai đoạn này nấm mốc đóng vai trò rất quan trọng và được thực hiện trong điều kiện hiếu khí nên cũng được gọi là quá trình lên men hiếu khí, trong giai đoạn này nấm men sẽ phát triển để gia tăng mật số đồng thời lên men một phần đường tạo thành rượu. - Quá trình chuyển hóa đường thành rượu (rượu hóa): quá trình được thực hiện bởi nấm men trong điều kiện kỵ khí nên cũng được gọi là quá trình lên men kỵ khí. (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6 (tinh bột) (glucose) C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 (glucose) (ethanol) Đối với một số loại nguyên liệu có hàm lượng đường cao như rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín thì quá trình lên men được thực hiện trực tiếp bởi nấm men mà không cần thông qua quá trình đường hóa. Thông thường, để đảm bảo quá trình lên men đạt năng suất cao thì mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men phải lớn hơn 10 triệu/mL. Đường và các chất dinh dưỡng trong dịch lên men sẽ được hấp thụ bởi nấm men và khuếch tán vào trong màng tế bào, đường sẽ được hệ enzyme trong nấm men chuyển hóa thành rượu và khí CO2. Bên trong dịch lên men rượu được sinh ra từ nấm men sẽ nhanh chóng tan vào nước, CO2 cũng tan vào nước nhưng nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa. Khi đó, CO2 sinh ra sẽ bám vào xung quanh tế bào nấm men tạo thành bọt khí làm nấm men nổi lên. Khi nấm men nổi lên, bọt khí CO2 vỡ ra giải phóng khí ra bên ngoài. Lúc này khối lượng riêng của nấm men lớn trở lại nên chúng sẽ chìm xuống lại. Quá trình tế bào nấm men nổi lên rồi chìm xuống diễn ra liên tục làm cho nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang thái động, gia tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với môi trường, gia tăng tốc độ lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2001). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình đƣờng hóa Theo Lê Ngọc Tú (1997), các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa gồm:  Nồng độ enzyme: trong điều kiện cùng nồng độ một loại cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường và chủng cùng một loại enzyme, khi tăng hoặc giảm nồng độ enzyme thì tốc độ đường hóa tương ứng tăng hoặc giảm.  Thời gian đường hóa: thời gian đường hóa càng lâu làm tăng hàm lượng chất khô hòa tan và nâng cao tính đệm của enzyme amylase, tuy nhiên khả năng nhiễm khuẩn tăng cao và hiệu suất thu hồi bị giảm xuống.  Nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên enzyme không bền ở nhiệt độ cao, đa số bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C. Nhiệt độ tối ưu khoảng 40 - 50°C. Tuy nhiên mỗi enzyme có khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau và phụ thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH môi trường,…  pH: mỗi enzyme có một pH tối ưu, tại đó vận tốc phản ứng mà nó xúc tác là cực đại. Các thay đổi nhỏ xung quanh pH tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính enzyme do thay đổi sự ion hóa các nhóm tại trung tâm hoạt động của enzyme. Các thay đổi lớn của pH làm biến tính protein của enzyme, do sự can thiệp vào các liên kết không đồng hóa trị yếu giữ vai trò ổn định cấu trúc không gian của enzyme. Phần lớn các enzyme đều có hoạt tính cực đại ở pH = 5 - 9. Các enzyme khác nhau thường có pH tối ưu không giống nhau. pH tối ưu của enzyme không cố định mà có thể thay đổi tùy theo bản chất hóa học, nồng độ cơ chất, nhiệt độ phản ứng và dung dịch đệm. Ngoài ra, các chất hoạt hóa hay các chất kìm hãm cũng có khả năng làm tăng hay giảm hoạt tính của enzyme. 2.4.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình rƣợu hóa + Hàm lượng đường Nồng độ đường cao hay thấp đều ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu của nấm men. Nồng độ đường cao làm thay đổi độ nhớt của môi trường, tăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men, từ đó ức chế hoạt tính của nấm men. Ngược lại nếu hàm lượng đường thấp quá thì năng suất lên men giảm dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao. Nếu đảm bảo được nồng độ chất khô có trong dịch đường từ 16 đến Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 18% thì sau khi lên men nhận được nồng độ ethanol trong dịch lên men từ khoảng 8,5 đến 9,5% (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). + Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của nấm men. Tùy từng loài nấm men mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là khác nhau. Thông thường, nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 - 30ºC. Nhiệt độ trong khoảng hơn 50ºC và dưới 0ºC thì sự lên men hầu như bị đình trệ. Nếu quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ thấp thì thời gian lên men sẽ bị kéo dài, không có tính kinh tế. Quá trình lên men ở nhiệt độ cao thường làm tổn thất sản phẩm dễ bị xâm nhiễm bởi các vi sinh vật không mong muốn và ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm. Tuy nhiên, việc lên men trong điều kiện nhiệt độ cao cũng có một số thuận lợi nhất định như hoạt động trao đổi chất tốt, tốc độ lên men cao tạo ra nhiều sản phẩm, độ tan của oxy và các khí khác giảm tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men, độ nhớt của môi trường lên men giảm nên quá trình lên men thuận lợi hơn (Roehr, 2001). Nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật lên men và nhiệt độ thích hợp cho quy trình lên men trong công nghiệp thường không trùng khớp với nhau. + pH Sự ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men cũng rất quan trọng, pH là nhân tố kiểm soát việc xâm nhiễm của các vi sinh vật gây hại đến quá trình lên men rượu. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, vi khuẩn acid lactic và vi khuẩn acid acetic làm giảm pH của môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm men và nấm mốc, tuy nhiên pH thấp quá sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo rượu. Ngoài ra, pH ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men, có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng và chiều hướng lên men, tạo sản phẩm chính và phụ khác nhau. Nếu pH trong khoảng 4 - 5, quá trình lên men rượu bình thường tạo sản phẩm chính là ethanol, đây là điều kiện cần thiết trong quá trình lên men rượu. Khi pH cao hơn thì glycerol và acid hữu cơ được tạo thành từ rượu (Wayman và Parekh,1990). Hiện nay ở các nhà máy, để acid hóa môi trường thường dùng H2SO4 hoặc acid lactic. Khi pH được điều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học