Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung người

  • Số trang: 75 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 138 |
  • Lượt tải: 4
hoanggiang80

Đã đăng 24000 tài liệu

Mô tả:

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung người
Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Ñaët vaán ñeà “Söï soáng quaù phöùc taïp khoâng cho pheùp chæ qua moät vaøi nghieân cöùu maø hieåu ñöôïc toaøn boä cô theå con ngöôøi” – Linus Pauling. Hieän nay treân theá giôùi caùc öùng duïng kyõ thuaät cuûa haøng loaït coâng trình nghieân cöùu nuoâi caáy caùc teá baøo ung thö ñaõ vaø ñang giuùp caùc nhaø khoa hoïc töøng böôùc giaûi ñaùp nhöõng vaán ñeà cô baûn trong sinh hoïc phaân töû vaø caû nhöõng ñieàu bí aån trong cô theå con ngöôøi. Caùc nhaø khoa hoïc vaãn ñang tieáp tuïc tìm kieám vaø khaùm phaù ra nhöõng doøng teá baøo ñoàng nhaát veà maët di truyeàn. Caùc teá baøo ñöôïc choïn loïc naøy laø muïc tieâu cho vieäc tieán haønh caùc lieäu phaùp sinh hoïc nhaèm goùp phaàn ngaên chaän caên beänh hieåm ngheøo. Khoa hoïc veà nuoâi caáy teá baøo ung thö coù phaïm vi öùng duïng raát roäng vaø phong phuù caû trong nghieân cöùu khoa hoïc vaø trong thöông maïi. Doøng teá baøo ung thö ñöôïc söû duïng nhö moät vaät lieäu ñeå saûn xuaát ra caùc cô chaát. Caùc protein ngöôøi coù theå ñöôïc phaân laäp tröïc tieáp töø vieäc nuoâi caáy teá baøo. Caùc doøng teá baøo ñoùng vai troø quan troïng trong caùc kyõ thuaät taùi toå hôïp DNA trong sinh hoïc phaân töû. Ngöôøi ta coøn söû duïng doøng teá baøo ñeå thöû nghieäm caùc loaïi thuoác coù ñoäc tính ñeå ñieàu trò caùc beänh di truyeàn, ung thö. Vieäc nuoâi caáy teá baøo coøn goùp phaàn môû ra kyõ thuaät dung hôïp teá baøo. Kyõ thuaät naøy giuùp chuùng ta hieåu bieát nhöõng ñieàu bí aån xaõy ra beân trong cô theå con ngöôøi nhö caùc caáu taïo vaø chöùc naêng cuûa gen ngöôøi, caùc bieåu hieän vaø caùc cô cheá di truyeàn, caùc phaûn öùng sinh hoïc bình thöôøng vaø quaù trình phaùt trieån cuûa nhöõng gen beänh. Muïc tieâu chính cuûa luaän vaên naøy laø giôùi thieäu neàn taûng cô baûn vaø phöông phaùp luaän caàn thieát ñeå tieán haønh nuoâi caáy teá baøo ung thö noùi chung vaø ñaëc bieät laø thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy sô caáp teá baøo ung thö coå töû cung töø caùc maãu moâ sinh thieát cuûa caùc beänh nhaân ñöôïc chaån ñoaùn bò toån thöông loaïn saûn ôû giai ñoaïn IB, IIA vaø IIB. ÔÛ Vieät Nam vieäc nuoâi caáy caùc teá baøo coøn heát söùc môùi meõ. Döïa treân caùc taøi lieäu coù ñöôïc vôùi söï höôùng daãn cuûa caùc Thaày Coâ, caùc anh chò vaø söï hoã trôï cuûa beänh vieän Ung böôùu thaønh phoá Hoà Chí Minh em ñaõ coá gaéng tieán haønh coâng vieäc nuoâi caáy doøng teá baøo ung thö coå töû cung trong phaïm vi khaû naêng, thôøi gian vaø caùc ñieàu kieän kyõ thuaät hieän coù. Keát quaû cuõng môùi chæ döøng ôû möùc ñoä xaùc ñònh teá baøo ung thö coå töû cung coù theå nuoâi caáy trong moät moâi tröôøng nhaát ñònh vôùi caùc thao taùc chuaån, keøm theo ñieàu kieän moâi tröôøng vaø caùc duïng cuï thí nghieäm caàn phaûi ñöôïc voâ truøng tuyeät ñoái. Maëc duø tyû leä thaønh coâng ôû laàn thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy ñaàu tieân cuûa em laø 1/20 maãu sinh thieát nhöng ñaây laø tieàn ñeà ñeå em coù theå tieáp tuïc theo ñuoåi ñeà taøi naøy trong töông lai. Tp Hoà Chí Minh, thaùng 7 – 2004 Taï 1 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung 1.1. MOÄT SOÁ MOÁC LÒCH SÖÛ NGHIEÂN CÖÙU VEÀ UNG THÖ Theo caùc taøi lieäu ñöôïc ghi cheùp töø thôøi coå ñaïi, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ tìm thaáy daáu veát cuûa moät khoái u aùc tính ôû maãu xöông hoùa thaïch cuûa xaùc öôùp Ai Caäp (caùch ñaây 5.000 naêm) vaø moät baûn thaûo ñöôïc vieát treân giaáy coû lau moâ taû 8 tröôøng hôïp bò khoái u hay veát loeùt ôû phaàn ngöïc. Trong baûn moâ taû ngöôøi vieát coøn ghi theâm “khoâng coù caùch ñieàu trò”. Luùc baáy giôø thuaät ngöõ “cancer” chöa ñöôïc söû duïng. Hyppocrate, ngöôøi thaày thuoác Hy Laïp cuõng xaùc nhaän ung thö coù theå laøm cheát ngöôøi. Vaøo thôøi naøy ñaõ söû duïng thuaät ngöõ carcinoma ñeå moâ taû hai loaïi ung thö: loaïi suøi ra ngoaøi nhieàu chaân nhö loaøi cua (carcinoma) vaø loaïi phaùt trieån saâu trong thòt (sarcom). Tuy nhieân maõi ñeán theá kyû 15, Giovanni Morgagni môùi laø ngöôøi ñaàu tieân thöïc hieän giaûi phaãu töû thi moät beänh nhaân u xöông vôùi muïc ñích tìm hieåu baûn chaát vaø nguyeân nhaân beänh. Ñaây laø neàn taûng ñeå phaùt trieån khoa hoïc veà u böôùu (oncology). Naêm 1846, nhaø nghieân cöùu beänh hoïc ngöôøi Ñöùc Rudolph Virchow moâ taû teá baøo ung thö maùu vaø ñöa ra giaû thuyeát veà nguoàn goác ung thö teá baøo. OÂâng cho raèng taát caû caùc teá baøo, bao goàm caû teá baøo ung thö ñeàu coù nguoàn goác töø moät teá baøo khaùc. Giaû thuyeát cuûa oâng vaøo thôøi ñoù ñaõ raát tieán boä vaø vaøi thaäp kyõ sau giaû thuyeát naøy ñöôïc chöùng minh laø ñuùng. Ñaàu theá kyû 19, caùc nhaø khoa hoïc môùi heù môû phaàn naøo söï bí aån cuûa ung thö. Naêm 1911, Peyton Rous ñaõ khaùm phaù ñöôïc moät trong nhöõng viruùt gaây ung thö ñaàu tieân ñaët teân laø RSV. Ñoù laø moät retrovirus (viruùt phieân maõ ngöôïc) maø voán di truyeàn ñöôïc caáu taïo baèng RNA. Thôøi ñieåm naøy moät vaán ñeà ñaët ra cho caùc nhaø khoa hoïc laø laøm theá naøo RSV coù theå nhaäp vaøo voán di truyeàn cuûa teá baøo caáu taïo baèng DNA. Naêm 1960, Temin nghó ra raèng RNA coù theå taïo ra DNA nhôø moät chaát men. Möôøi naêm sau, Temin vaø Baltimore ñaõ chöùng minh ñöôïc söï hieän höõu cuûa enzym naøy, ñoù laø enzym sao cheùp ngöôïc vaø caùc viruùt gaây ung thö loaïi RNA ñöôïc goïi laø viruùt phieân maõ ngöôïc. Khaùm phaù naøy nhaän ñöôïc giaûi thöôûng Nobel Sinh lyù vaø Y hoïc naêm 1975. Naêm 1976, nhaø nghieân cöùu ngöôøi Phaùp Dominique Stehelin cuøng vôùi caùc ñoàng nghieäp ngöôøi Myõ Michel Bishop vaø Harold Varmus khaùm phaù moät ñieàu gaây söûng soát laø nhieãm saéc theå cuûa nhieàu ñoäng vaät, keå caû ngöôøi chöùa caùc gen coù theå chuyeån ñoåi Taï 2 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung thaønh caùc gen gaây u, nhôø vaäy xaùc ñònh treân 60 loaïi gen cuûa teá baøo coù theå chuyeån thaønh gen gaây ung thö. Kieán thöùc cuûa nhaân loaïi veà di truyeàn hoïc, veà cô cheá sinh hoïc phaân töû ñaõ tieán trieån nhanh trong nhöõng naêm gaàn ñaây.Vaøo giöõa theá kyû 20 caùc nhaø khoa hoïc môùi baét ñaàu giaûi quyeát nhöõng vaán ñeà phöùc taïp cuûa di truyeàn hoïc. James Watson vaø Franci Crick vôùi hai trang thoâng baùo ngaén goïn veà moâ hình phaân töû cuûa DNA treân taïp chí Nature ñaõ laøm ñaûo loän nhaän thöùc cuûa giôùi khoa hoïc ñöông thôøi. Trong lòch söû sinh hoïc ít coù moác nghieân cöùu naøo coù taùc ñoäng roäng raõi nhö maïch xoaén keùp DNA cuûa hoï. Moâ hình cuûa Watson vaø Crick ñem laïi yù nghóa môùi meû cho vieäc nghieân cöùu chuû ñeà di truyeàn hoïc vaø ung thö. Cuõng vaøo thôøi ñieåm naøy thuaät ngöõ khaùng theå ñôn doøng xuaát hieän. Kyõ naêng taïo caùc khaùng theå ñôn doøng ñaõ cho ra ñôøi moät coâng ngheä môùi aùp duïng phoå bieán trong vieäc chaån ñoaùn sôùm vaø ñieàu trò moät soá beänh ung thö. Nhaø baùc hoïc tìm ra caùc khaùng theå ñôn doøng ñöôïc trao giaûi thöôûng Nobel vaøo naêm 1981 laø Cesar Milstein. Chuùng ta phaûi thöøa nhaän raèng ñeán cuoái theá kyû 20, nhaân loaïi ñaõ coù nhöõng böôùc tieán vöôït baäc veà vieäc nghieân cöùu ung thö treân cô sôû di truyeàn hoïc, ñoàng thôøi tìm ra nhöõng lieäu phaùp ñieàu trò môùi maø muïc tieâu nhaèm vaøo vieäc tieâu dieät caùc teá baøo ung thö chuyeân hoùa. Tuy nhieân, nhöõng ñieàu naøy ñeán nay vaãn chöa laøm thay ñoåi söï thaät veà moät caên beänh nan y. Nhöng duø sao chuùng ta cuõng coù quyeàn hy voïng ñeán naêm 2010 hay laâu hôn nöõa baûn phaân loaïi veà gen con ngöôøi seõ ñöôïc hoaøn taát, ñoù seõ laø neàn taûng ñeå caùc nhaø khoa hoïc tìm ra caùc tín hieäu ñieàu khieån quaù trình taùi taïo khoái u vaø tìm ra caùc gen baûo veä cô theå choáng laïi caên beänh naøy. 1.2. NHÖÕNG ÑAËC TÍNH CUÛA UNG THÖ NGÖÔØI 1.2.1. Baûn chaát cuûa beänh ung thö vaø söï phaân bieät giöõa u laønh vôùiø u aùc tính Ung thö laø moät beänh lyù aùc tính. Vì sao ung thö laïi laøm cho ngöôøi ta thaät söï sôï haõi khi maéc phaûi? Ta coù theå hình dung teá baøo ung thö nhö moät sinh vaät phaùt trieån ngoaøi voøng kieåm soaùt. Maø caùi gì hoaëc ñieàu gì naèm ngoaøi voøng kieåm soaùt ñeàu ñaùng lo ngaïi. Trong phaân hoaù teá baøo bình thöôøng, caùc cô cheá kieåm soaùt ôû möùc teá baøo thöôøng haïn cheá sinh tröôûng vaø phaân baøo ôû nhöõng möùc xaùc ñònh. Nhöng ñoâi khi moät teá baøo thoaùt khoûi möùc kieåm soaùt naøy vaø nhaân baûn leân moät caùch thaùi quaù. Sinh tröôûng thaùi Taï 3 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung quaù coù theå daãn ñeán haäu quaû taïo ra khoái u, töùc laø moät khoái teá baøo baát thöôøng so vôùi nhöõng moâ chuaån möïc bình thöôøng. Coù phaûi taát caû khoái u ñeàu laø ung thö khoâng? caâu traû lôøi laø khoâng. Coù hai loaïi u. U laønh tính thöôøng goïi laø u laønh. Ñoù laø moät khoái teá baøo baát thöôøng vaãn giöõ laïi ôû vò trí goác nôi chuùng ñaõ phaùt sinh trong cô theå. Caùc u laønh cuõng coù theå gaây söï coá neáu chuùng sinh tröôûng lôùn cheøn eùp ôû moät soá cô quan bò khung xöông boïc kín nhö naõo hay phoåi. Nhöng thoâng thöôøng ôû caùc vò trí khoâng cheøn eùp caùc moâ khaùc ngöôøi ta coù theå duøng phaãu thuaät taïi choã caét boû hoaøn toaøn khoái u ra khoûi cô theå. Traùi haún vôùi u laønh laø caùc u aùc tính laø moät khoái moâ baát thöôøng coù theå phaùt trieån lan vaøo trong caùc moâ laân caän vaø thöôøng di caên vaøo nhöõng boä phaän ôû xa khaùc cuûa cô theå. Moät u aùc phaùt sinh töø moät teá baøo ung thö duy nhaát vaø dôøi choã ra khoûi moâ bình thöôøng noù ñaõ phaùt sinh. Neáu khoâng tieâu dieät hay caét boû, moät vaøi teá baøo ung thö ñoù seõ xaâm nhieãm vaøo trong caùc moâ bao quanh vaø khoái u goác seõ baønh tröôùng. Caùc teá baøo cuõng coù theå taùch khoûi khoái u, xaâm nhaäp vaøo heä tuaàn hoaøn (vaøo caùc maïch baïch huyeát vaø maïch maùu) vaø coù theå lan ñeán caùc vò trí môùi, taïo ra nhöõng khoái u môùi taïi nhöõng choã ñoù. Söï dôøi choã cuûa caùc teá baøo ung thö ra khoûi vò trí nguyeân thuûy cuûa chuùng ñöôïc goïi laø söï di caên (malignant progression). Hình 1: Söï di caên Taï 4 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Noùi chung, ñeå phaân bieät giöõa u laønh tính vaø u aùc tính coù theå döïa treân caùc ñaëc ñieåm bieät hoaù vaø maát bieät hoùa, tyû leä phaùt trieån, tính chaát xaâm nhaäp taïi choã vaø söï di caên. Thuaät ngöõ bieät hoùa vaø maát bieät hoùa aùp duïng cho caùc teá baøo bieåu moâ cuûa khoái u. Söï bieät hoùa ñeå chæ möùc ñoä phaùt trieån cuûa caùc teá baøo bieåu moâ gioáng caùc teá baøo bình thöôøng caû veà hình thöùc vaø chöùc naêng. U bieät hoùa cao laø u goàm nhöõng teá baøo gioáng caùc teá baøo cuûa moâ sinh ra u. Noùi chung caùc u laønh tính ñeàu bieät hoùa cao. Caùc u aùc tính xeáp töø bieät hoùa cao ñeán khoâng bieät hoùa. Caùc u aùc tính goàm nhöõng teá baøo khoâng bieät hoùa ñöôïc goïi laø maát bieät hoùa (anaplasia). Söï maát bieät hoùa ñöôïc coi laø daáu aán cuûa chuyeån daïng aùc tính. Söï maát bieät hoùa ñöôïc ñaùnh daáu bôûi moät soá thay ñoåi veà hình thaùi vaø chöùc naêng nhö caû teá baøo vaø nhaân teá baøo ñeàu bieåu hieän ña hình thaùi – thay ñoåi veà kích thöôùc vaø hình daïng. Caùc teá baøo coù theå lôùn hôn nhieàu laàn nhöõng teá baøo keá caän cuøng loaïi trong khi caùc teá baøo khaùc coù theå cöïc kyø nhoû, daïng nguyeân thuûy. Moät hình aûnh khaùc cuûa söï maát bieät hoùa laø söï taïo thaønh nhöõng teá baøo khoång loà, moät soá teá baøo coù moät nhaân ña daïng khoång loà duy nhaát vaø moät soá khaùc coù hai hay nhieàu nhaân. Trong teá baøo khoång loà ung thö, nhaân teá baøo taêng saéc vaø lôùn so vôùi teá baøo. Ngoaøi caùc baát thöôøng veà teá baøo hoïc moâ taû treân, söï phaân cöïc cuûa caùc teá baøo maát bieät hoùa bò roái loaïn roõ reät. Caùc daûi hoaëc caùc khoái lôùn teá baøo u phaùt trieån voâ toå chöùc. Maëc duø caùc teá baøo ñang phaùt trieån naøy ñoøi hoûi ñöôïc cung caáp maùu, nhöng do moâ ñeäm huyeát quaûn ngheøo naøn neân vuøng trung taâm u thöôøng bò hoaïi töû vì thieáu maùu. 1.2.2. Sinh saûn cuûa teá baøo ung thö 1.2.2.1. Söï baát thuôøng cuûa nhaân vaø caùc nhieãm saéc theå Trong caùc teá baøo ung thö coù theå bieåu hieän caùc daïng baát thöôøng cuûa phaân chia nhö khoâng coù thoi voâ saéc coù theå daãn ñeán cheát teá baøo hoaëc nhieàu nhaân chia nhoû. Nhaân chia vôùi nhieãm saéc theå cöïc coù ñaëc ñieåm laø coøn toàn taïi trong gian kyø, moät vaøi nhieãm saéc theå khoâng ñöôïc huy ñoäng ñeán gaàn moät hoaëc hai trung theå coù theå daãn ñeán cheát teá baøo hoaëc taïo thaønh hai nhaân coù soá nhieãm saéc theå khoâng ñeàu. Tuy nhieân nhöõng daáu aán ñaëc hieäu cuûa teá baøo ung thö thöôøng bieåu hieän ôû söï baát thöôøng nhieãm saéc theå. Taï 5 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Caùc phöông phaùp xeùt nghieäm gaàn ñaây coøn cho pheùp nhaän bieát nhöõng baát thöôøng nhieãm saéc theå cuûa caùc daïng u khaùc nhau. Ví duï nhö nhieãm saéc theå Ph1 quan saùt thaáy trong beänh baïch caàu loaïi tuûy maõn tính. Caùc u nguyeân baøo voõng maïc laø do söï thieáu huït moät phaàn nhieãm saéc theå 13. Phaàn lôùn caùc tröôøng hôïp u maøng naõo thieáu hoaøn toaøn hay moät phaàn nhieãm saéc theå 22. 1.2.2.2. Quan nieäm ñôn doøng Ngaøy nay ngöôøi ta cho raèng moät ung thö phaùt trieån töø moät teá baøo chuyeån daïng. Thöïc ra ngöôøi ta khoâng theå xaùc ñònh moät ung thö treân vi theå tröôùc khi noù ñaõ taïo thaønh nhieàu teá baøo, nhöng coù nhieàu baèng chöùng chöùng minh raèøng ung thö laø moät quaàn theå teá baøo ñoàng nhaát, moät doøng teá baøo. Ví duï nhö söï cheá tieát globulin mieãn dòch ñôn doøng trong caùc u töông baøo vaø trong caùc u lympho teá baøo B, taát caû caùc teá baøo u chæ cheá tieát moät daïng duy nhaát cuûa globulin mieãn dòch. Ngöôøi ta cuõng thaáy raèng hieän töôïng gheùp moät teá baøo duy nhaát coù theå coù hieäu quaû trong moät soá ung thö thöïc nghieäm (beänh baïch caàu chuoät). Trong quaù trình tieán trieån cuûa u, quaàn theå teá baøo ung thö chòu nhöõng ñoät bieán môùi. Söï tieán trieån doøng naøy bieåu hieän bôûi söï xuaát hieän nhöõng chuûng baát thöôøng hôn, coù tính chaát xaâm laán hôn vaø ñeà khaùng hôn vôùi caùc bieän phaùp ñieàu trò. 1.2.2.3. Thôøi gian nhaân ñoâi u Thôøi gian nhaân ñoâi u laø thôøi gian trung bình caàn thieát ñeå taêng gaáp ñoâi soá löôïng teá baøo ung thö. Ngöôøi ta coù theå ño treân nuoâi caáy hoaëc tính treân vivo töø khoái löôïng u. Thôøi gian nhaân ñoâi laø moät thaùng cho nhöõng u phoâi, hai ñeán ba thaùng cho nhöõng ung thö bieåu moâ daïng bieåu bì, boán ñeán saùu thaùng cho nhöõng ung thö bieåu moâ daïng tuyeán, boán ñeán möôøi hai thaùng cho nhöõng u tuûy. Coù moái lieân heä giöõa thôøi gian nhaân ñoâi vaø söï phaùt trieån cuûa u. Thôøi gian nhaân ñoâi ngaén u phaùt trieån nhanh, thôøi gian nhaân ñoâi daøi u phaùt trieån chaäm, khoâng coù thôøi gian nhaân ñoâi u ngöng phaùt trieån. Trong phaàn lôùn thôøi gian phaùt trieån khoái u, thôøi gian nhaân ñoâi luoân haèng ñònh vaø seõ caøng daøi hôn khi u ñaõ phaùt trieån lôùn. Thôøi gian nhaân ñoâi tröôùc heát phuï thuoäc vaøo heä soá taêng sinh, heä soá maát teá baøo. Heä soá taêng sinh bieåu loä tyû leä caùc teá baøo trong chu kyø. Heä soá maát teá baøo bieåu loä tyû leä Taï 6 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung phaàn traêm caùc teá baøo bò maát ñi do hoaïi töû hoaëc do bong. Cuõng caàn phaûi nhaán maïnh raèng ôû caùc moâ bình thöôøng söï maát teá baøo laø 100%, soá teá baøo sinh ra khoâng nhieàu hôn teá baøo maát ñi – ñoù laø söï caân baèng noäi moâ cuûa moâ. Trong ung thö heä soá taêng sinh teá baøo thöôøng taêng cao nhaát trong khi söï maát teá baøo cuõng traàm troïng nhaát. Trong caùc daïng ung thö, caùc u maát bieät hoùa nhaát cuõng laø caùc u coù toác ñoä phaùt trieån vaø heä soá taêng sinh cao nhaát. Trong caùc teá baøo ung thö thôøi gian trung bình cuûa moät chu kyø teá baøo laø moät ñeán ba ngaøy, pha S coù thôøi gian khaù haèng ñònh (trung bình 16 giôø) nhöng pha G1 hay thay ñoåi nhieàu hôn. Chu kyø cuûa teá baøo ung thö khoâng ngaén hôn chu kyø cuûa caùc teá baøo bình thöôøng, thaäm chí chaäm hôn do söï keùo daøi cuûa phaân baøo nguyeân nhieãm. Ví duï chu kyø cuûa caùc nguyeân baïch caàu cuûa beänh baïch caàu caáp laø 50-60 giôø, trong khi chu kyø cuûa caùc nguyeân baøo tuûy bình thöôøng laø 24 giôø. 1.2.3. Nguyeân nhaân gaây ra ung thö Ngaøy nay cuoäc chieán choáng ung thö treân theá giôùi ñöôïc tieán haønh toaøn dieän treân nhieàu maët. Nhöõng nghieân cöùu thöïc nghieäm vaø dòch teã ñaõ ñoùng goùp lôùn lao trong vieäc xaùc ñònh moät soá nguyeân nhaân chuû yeáu cuûa ung thö ôû ngöôøi. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ chöùng minh roõ raøng raèng söï phaùt trieån ung thö thöôøng laø keát quaû töø söï tieáp caän vôùi nhieàu yeáu toá ruûi ro trong moâi tröôøng soáng. Hieän nay, theo ñaùnh giaù cuûa IARC (International Agency for Resarch on Cancer1998) coù 75 taùc nhaân ñöôïc keát luaän gaây ung thö cho con ngöôøi. Nhoùm taùc nhaân gaây hö haïi veà di truyeàn vaø gaây chuyeån daïng u cuûa teá baøo thuoäc caùc loaïi sau ñaây: (1) chaát gaây ung thö hoaù hoïc, (2) naêng löôïng tia, (3) vi khuaån sinh ung thö, chuû yeáu laø caùc viruùt. Moãi nhoùm taùc nhaân coù ñaëc ñieåm rieâng, nhöng nhieàu taùc nhaân coù theå cuøng taùc ñoäng vaø laøm taêng hieäu quaû caùc taùc nhaân khaùc. Caùc taùc nhaân gaây ung thö laøm theá naøo ñeå gaây ñöôïc ung thö. Nhö chuùng ta ñaõ bieát haàu heát ung thö laø keát quaû töø nhieàu daïng thay ñoåi di truyeàn. Caùc thay ñoåi naøy laø keát quaû töø haøng chuïc naêm tieáp xuùc vôùi caùc taùc nhaân ung thö coù aûnh höôûng gaây ñoät bieán. Noùi chung khi tyû leä phaân baøo caøng cao thì xaùc suaát sinh ñoät bieán caøng cao do heä quaû töø deã sinh nhaàm laãn trong töï nhaân ñoâi vaø toå hôïp laïi DNA. Moät vaøi taùc nhaân gaây ung thö döôøng nhö coù caû hai taùc duïng ñoù. Chaúng haïn caùc hocmon gaây ra ung thö vuù vaø Taï 7 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung ung thö töû cung vöøa gaây ra taêng phaân baøo vöøa coù theå gaây ra caùc thay ñoåi di truyeàn seõ daãn ñeán ung thö. Nhöõng naêm gaàn ñaây caùc nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu vaø bieát ñöôïc nhieàu taäp tính hoaït ñoäng gaây beänh cuûa caùc teá baøo ung thö. Nhö vieäc nhieãm viruùt vieâm gan B keùo daøi coù theå sinh ung thö gan. Nhieãm viruùt u nhuù (papilloma) gaây ra u nhuù ôû boä phaän sinh duïc coù theå daãn ñeán ung thö coå töû cung. Viruùt gaây ung thö trôû thaønh moät daïng thöôøng truù trong caùc teá baøo vaät chuû, thöôøng do cheøn nhaân acid nucleic vaøo trong DNA cuûa caùc theå nhieãm saéc vaät chuû. Theo Zibbert, viruùt sau khi xaâm nhaäp teá baøo ñaõ laøm thay ñoåi ñaëc tính di truyeàn cuûa teá baøo gaây roái loaïn phaân baøo. Do ñoù teá baøo taêng saûn hoãn loaïn vaø mang nhöõng ñaëc tính di truyeàn môùi. ÔÛ beân trong teá baøo, viruùt ñaõ maát heát hình thaùi bình thöôøng neân khoâng ñöôïc phaùt hieän nöõa. Chaát maøu cuûa acid nucleic cuûa viruùt ñaõ hoaø nhaäp keát hôïp vôùi chaát maøu cuûa teá baøo, moät DNA ñöôïc hình thaønh mang tính chaát cuûa teá baøo ung thö. Teá baøo beänh ñoù tieáp tuïc nhaân leân maø khoâng caàn söï hieän dieän cuûa viruùt nöõa. Thoáng keâ caùc ca ung thö lieân quan ñeán viruùt chieám khoaûng 15% caùc daïng ung thö ngöôøi treân toaøn theá giôùi. Tuy nhieân coøn raát laâu chuùng ta môùi bieát heát ñöôïc caùc nhaân toá ñaõ goùp phaàn gaây ung thö. Caùc nhaø khoa hoïc ñang tieáp tuïc tìm kieám nhöõng taùc nhaân bí aån naøy baèng phöông phaùp dòch teã hoïc. 1.3. CÔ SÔÛ PHAÂN TÖÛ CUÛA UNG THÖ Taát caû sinh vaät soáng ñeàu ñöôïc caáu taïo töø teá baøo. Moät soá loaøi sinh vaät, ví duï nhö vi khuaån, coù theå toàn taïi nhö sinh vaät ñôn baøo. Nhöõng sinh vaät khaùc, bao goàm caû ñoäng vaät höõu nhuõ ñöôïc caáu taïo töø voâ soá teá baøo, taát caû teá baøo keát hôïp vôùi nhau ñeå taïo neân moät sinh vaät soáng. Nhieàu teá baøo caáu taïo thaønh moâ nhö moâ lieân keát, moâ cô, nhieàu moâ caáu taïo thaønh cô quan nhö gan, phoåi. Ngoaøi ra cô theå ngöôøi coøn phuï thuoäc vaøo nhöõng teá baøo nhoû chuyeân bieät, chuùng seõ caáu taïo neân nhöõng cô quan chuyeân bieät nhö tim hay phoåi. Nhö vaäy, söï hoaït ñoäng cuûa teá baøo giuùp duy trì söï soáng. Tuy nhieân trong tröôøng hôïp ung thö, söï thay ñoåi chöùc naêng vaø caáu truùc cuûa teá baøo laø nguyeân nhaân chính. 1.3.1. Caùc gen gaây ung thö (oncogen) Taï 8 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Theo quan ñieåm hieän nay ung thö ñöôïc xem laø beänh cuûa gen bôûi vì ngöôøi ta phaùt hieän ra haøng loaït caùc gen gaây ung thö (oncogen) vaø gen öùc cheá ung thö (antioncogen) coù trong teá baøo. Khi caùc gen naøy bò bieán dò thì deã daãn ñeán ung thö. Gaàn 50% caùc ung thö ñaõ ñöôïc nghieân cöùu, chaån ñoaùn baèng söï bieán dò cuûa moät gen laø gen p.53. P.53 laø moät antioncogen hay coøn goïi laø gen öùc cheá ung thö. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ chöùng minh raèng trong cô theå laønh maïnh cuûa con ngöôøi coù chöùa tieàn gen kích thích söï phaùt trieån (growth promoting protoocogen) hay coøn goïi laø tieàn gen gaây u. Ñoù laø gen caàn thieát cho vieäc haøi hoaø söï soáng. Vai troø chuaån möïc cuûa caùc tieàn gen gaây u trong teá baøo laø gì? Nhieàu tieàn gen gaây u maõ hoùa cho caùc nhaân toá loaïn sinh tröôûng – caùc protein kích thích phaân baøo hoaëc maõ hoùa cho caùc protein khaùc aûnh höôûng ñeán toång hôïp hay chöùc naêng cuûa caùc nhaân toá sinh tröôûng. Khi chuùng theå hieän chöùc naêng bình thöôøng, ñuùng löôïng phuø hôïp, vaøo ñuùng luùc caàn thieát thì caùc protein naøy kieåm soaùt phaân baøo vaø kieåm soaùt söï phaân hoùa ñuùng chuaån möïc. Ñeå moät tieàn gen gaây u chuyeån thaønh gen gaây u phaûi coù moät thay ñoåi hoaëc moät ñoät bieán xaûy ra trong DNA cuûa teá baøo. Coù theå laø do moät nhieãm saéc theå bò chuyeån ñoåi vò trí. Söï chuyeån vò xaûy ra khi caùc nhieãm saéc theå trao ñoåi laãn nhau caùc maûng nhoû cuûa chuùng. Thí duï söï bieán hình aùc tính trong beänh baïch caàu tuûy thì lieân quan ñeán söï chuyeån vò trí protooncogen töø vò trí bình thöôøng ôû theå nhieãm saéc 9 leân theå nhieãm saéc 22. Ñoù thöïc ra laø moät nhieãm saéc theå phoái hôïp goàm thaân laø nhieãm saéc theå soá 9, treân ñoù moät maûnh cuoái cuûa nhieãm saéc theå 22 gaén vaøo. Protooncogen myc trong ung thö lymphoma Burkitt laø do chuyeån vò trí theå nhieãm saéc 8 leân 14. ÔÛ moät tröôøng hôïp khaùc laø söï ñoät bieán treân DNA, moät nhaàm laãn trong töï nhaân ñoâi DNA hoaëc trong taùi toå hôïp phaùt sinh khi nhaân baûn caùc gen ñaõ ñöôïc sao maõ hay dòch maõ toaøn boä, haäu quaû laø quaù thöøa protein kích thích phaân baøo so vôùi möùc chuaån. Trong caùc tröôøng hôïp naøy möùc bieåu hieän gen chuaån bò thay ñoåi vaø teá baøo bò kích thích sinh soâi naåy nôû moät caùch tuøy tieän. Hieän nay caùc oncogen taïo ra caùc protein tham gia kieåm tra söï lôùn leân cuûa teá baøo coù theå ñöôïc phaân loaïi theo chöùc naêng nhö sau: Taï 9 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Nhoùm thöù nhaát laø gen maõ hoùa cho caùc yeáu toá taêng tröôûng nhö sis, int-2. Nhöõng oncogen yeáu toá taêng tröôûng naøy coù theå kích hoaït söï nhaân leân cuûa teá baøo nhöng khoâng ñuû khaû naêng gaây neân thay ñoåi veà kieåu hình.. Nhoùm thöù hai cuûa oncogen maõ hoùa cho caùc thuï theå cuûa yeáu toá taêng tröôûng nhieàu thuï theå trong soá ñoù gaén vôùi hoaït tính tyrosine kinase. Nhoùm thöù ba laø caùc thuï theå khoâng coù hoaït tính tyrosine kinase ñoù laø saûn phaåm gen mas. Nhoùm thöù tö laø caùc hoï protein gaén treân maøng nhö ras. Nhoùm thöù naêm laø nhöõng oncoprotein trong teá baøo chaát vôùi hoaït tính serine/threonine kinase goàm coù saûn phaåm raf, pim-1, mos vaø cot. Nhoùm thöù saùu goàm caùc oncogen maõ hoùa cho caùc yeáu toá ñieàu hoaø trong teá baøo chaát. Nhoùm thöù baûy, moät nhoùm oncogen lôùn maõ hoùa cho nhöõng yeáu toá phieân maõ ôû nhaân nhö myc, myb, fos, jun, rel. 1.3.2. Caùc gen öùc cheá ung thö (antioncogen) Trong khi caùc tieàn gen u maõ hoùa caùc protein khôûi ñoäng söï phaùt trieån teá baøo, thì caùc saûn phaåm cuûa caùc gen öùc cheá khoái u coù chöùc naêng laø ñieàu hoøa söï phaùt trieån teá baøo. Söï ñoät bieán hay maát gen öùc cheá khoái u coù theå gaây ra ung thö. Trong beänh böôùu nguyeân baøo voõng maïc, moät loaïi ung thö cuûa treû em mang tính di truyeàn, gaàn ñaây caùc nhaø khoa hoïc ñaõ khaùm phaù ra ñöôïc nguyeân nhaân laø do maát moät ñoaïn cuûa nhieãm saéc theå 13. Ñoaïn bò maát ñoù mang caùc gen kieàm cheá khoâng cho caùc oncogen cuûa ung thö naøy phaùt trieån. Theâm nhieàu baèng chöùng xaùc nhaän raèng baát kyø ñoät bieán naøo ngaên chaën gen trieät khoái u ñeàu goùp phaàn gaây loaïn phaùt phaân baøo, töùc khoâng kieåm soaùt noåi möùc phaân baøo chuaån möïc vaø coù theå sinh ra moät teá baøo ung thö. ÔÛ ung thö ñaïi traøng nhö ôû nhieàu daïng ung thö khaùc ôû ngöôøi, ngöôøi ta nhaän thaáy quaù trình di caên cuûa moät ung thö ñaïi traøng phaùt trieån töø töø qua ba chaëng. Daáu hieäu ñaàu tieân laø trong caùc teá baøo bình thöôøng cuûa bieåu moâ loùt ñaïi traøng xuaát hieän taàn soá phaân baøo baát thöôøng. Sau ñoù xuaát hieän moät u laønh (choài polip) trong vaùch ñaïi traøng. Vaø cuoái cuøng xuaát hieän moät khoái u aùc tính. Nhöõng thay ñoåi ôû möùc teá baøo naøy dieãn ra Taï 10 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung song song vôùi ba thay ñoåi ôû möùc ñoä DNA bao goàm söï hoaït hoùa cuûa moät gen gaây u trong teá baøo vaø söï voâ hieäu hoùa cuûa hai gen öùc cheá khoái u. 1.3.2.1. Gen Rb Gen laøm phaùt trieån böôùu nguyeân baøo voõng maïc (retinoblastoma) ôû ngöôøi ñöôïc goïi teân laø gen Rb (retinoblastoma supectability gene). Ñoät bieán ôû gen Rb laøm phaùt trieån daïng ung thö khaùc ôû ngöôøi nhö sacoâm xöông (osteosarrcom). Khaùc vôùi beänh retioblastoma do di truyeàn, nhöõng ñoät bieán cuûa Rb thuôøng xuaát hieän ôû teá baøo sinh döôõng hôn laø do di truyeàn töø boá meï. Retinoblastoma taïo ra do ñoät bieán hai laàn ôû phaïm vi gen Rb cuûa theå nhieãm saéc 13. Thoâng qua caùc nghieân cöùu ngöôøi ta bieát saûn phaåm protein cuûa gen Rb tham gia trong ñieàu hoøa taêng tröôûng teá baøo. 1.3.2.2. Gen p53 Gen naøy naèm treân nhaùnh ngaén cuûa theå nhieãm saéc 17. Protein p53 coù vai troø ngaên caûn söï lan traøn cuûa caùc teá baøo bò hö haïi veà di truyeàn. Protein p53 khu truù ôû trong nhaân teá baøo vaø khi taùc ñoäng, noù coù chöùc naêng ñaàu tieân laø kieåm soaùt söï phieân maõ caû caùc gen khaùc. Söï bieán ñoåi p53 xaûy ra ôû gaàn moät nöûa soá ung thö ôû ngöôøi. P53 ñöôïc huy ñoäng ñeå laøm ngöøng söï hö haïi DNA vaø hoã trôï cho vieäc söûa chöõa DNA baèng caùch gaây döøng ôû G1 vaø kích thích caùc gen DNA ñöôïc söûa chöõa. Moät teá baøo coù DNA bò hö haïi neáu khoâng ñöôïc söûa chöõa seõ ñöôïc p53 ñieàu khieån ñi vaøo cheát teá baøo theo chöông trình. Do caùc hoaït ñoäng naøy p53 ñaùng ñöôïc goïi laø “ngöôøi canh gaùc boä gen”. Neáu maát ñoàng hôïp töû cuûa gen p53, toån haïi p53 khoâng ñöôïc söûa chöõa, ñoät bieán trôû thaønh coá ñònh trong caùc teá baøo ñang phaân chia vaø teá baøo seõ chuyeån daïng sang aùc tính, ñaëc bieät laø ôû moâ lieân keát. Gen p53 ñaõ ñöôïc phaùt hieän gaàn 20 naêm nay vaø ñöôïc xem laø gen duy nhaát giöõ vai troø trung taâm trong cô cheá gaây beänh ung thö. 1.3.2.3. Gen p73 Taï 11 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Ñeán cuoái naêm 1977, caùc nhaø nghieân cöùu phaùt hieän ra gen p73, gen naøy maõ hoùa moät protein mang nhieàu ñaëc ñieåm töông töï nhö gen p53. Gen p73 coù moät vuøng gaén DNA gioáng moät vuøng töông öùng cuûa p53, noù coù theå gaây döøng chu kyø teá baøo vaø gaây cheát teá baøo theo chöông trình trong nhöõng ñieàu kieän thích hôïp. Nhieàu nghieân cöùu hieän nay ñang taäp trung vaøo gen hoï haøng cuûa p53 naøy. Gen p73 phoå bieán trong nhieàu loaïi u nhö u nguyeân baøo thaàn kinh, ung thö ñaïi traøng. 1.3.3. Gen ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình Chieáu xaï Bax Chemo’s p53 Apoptosis Bcl-2 Oncogens p21 E1A, tTAg, Gadd45 Chu trình teá baøo c-myc Sô ñoà 1: Hieän töôïng chöông trình hoùa söï cheát teá baøo Apoptosis – laø hieän töôïng chöông trình hoùa söï cheát cuûa teá baøo (programmed cell death – PCD) – hieän töôïng naøy trôû neân caàn thieát trong giai ñoaïn phaùt trieån naøo ñoù cuûa teá baøo. Ngöôøi ta cuõng quan saùt thaáy hieän töôïng naøy trong ung thö nhö gieát teá baøo ung thö baèng teá baøo NK (natural killers) hay baèng teá baøo ñoäc cuõng nhö teá baøo lymphocyt ñoäc phuû khaùng theå. Nhöng teá baøo ung thö deã ñi vaøo apoptosis laø khi gaây ra DNA hö haïi ñöôïc quyeát ñònh söï coù maët trong chuyeån daïng bieán dò cuûa gen p53 hoaëc söû duïng caùc thuoác ôû pha G1 hoaëc caùc tia ôû pha G2. Cô cheá ñieàu hoøa voøng teá baøo pha p53 chöa ñöôïc bieát chính xaùc nhöng coù leõ noù laø chaát ñieàu hoøa sao maõ cuûa caùc gen tham gia photphoryl hoùa nhieàu choã qua nhieàu enzym kinaza, ví duï kinaza cdk1 (cell division kinase) laøm photphoryl hoùa protein p53, p73 vò trí Ser-315. Khi ñöôïc photphoryl hoùa, p53 cuõng coù aûnh höôûng ñeán caùc protein bieán daïng cuûa caùc viruùt gaây ung thö loaïi DNA. Chính choã naøy p53 coù theå Taï 12 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung ñoùng vai troø chuû yeáu trong ñieàu hoøa lôùn leân, bieät hoùa vaø söï cheát teá baøo theo chöông trình ñònh saün. Söï bieåu hieän gen cuûa protein p53 ñöôïc ñieàu hoøa qua nhieàu khaùng nguyeân, trong ñoù khaùng nguyeân PCNA (proliferation cells nuclear antigen). Khaùng nguyeân naøy laø cofactor cuûa enzym polymeraza sao cheùp S. Bôûi vaäy khi giaûm hoaït tính p53 thì phong beá söï ñi vaøo pha S cuûa chu kyø phaân chia teá baøo. Cuoái cuøng, ngöôøi ta phaùt hieän protein kìm haõm hoaït tính caùc kinaza cdk khaùc nhau ñöôïc goïi laø CKI (cyclin dependent kinases inhibitors) vaø quan troïng nhaát trong chuùng laø p21 – saûn phaåm cuûa gen ôû ñænh 1 (p53 mediated inhibitor of cdk). Moät chaát öùc cheá kinaza cdk khaùc nhau laø protein p16 INK 1 (Inhinitor of cdkS), gen maõ hoùa noù khu truù trong nhieàu doøng teá baøo ung thö. Gen naøy kìm haõm nhieàu ung thö mang teân MTS 1 (multiple tumor suppressor 1) hay CDK 4 I (CDK 4 inhibitor). Kieán thöùc coù lieân quan tôùi cô cheá apoptosis teá baøo ung thö raát caàn trong nghieân cöùu ñieàu trò ung thö. Cuõng caàn nhôù raèng gen p53 coù theå hôïp taùc vôùi gen Rb trong caûm öùng apoptosis vaø bieán hình ung thö. Hieåu bieát veà gen p53 vaø gen Rb bình thöôøng, ngöôøi ta coù theå taùch doøng (cloning) chuùng ñeå duøng trong ñieàu trò ung thö, ñoù laø moät trong nhöõng vaán ñeà haáp daãn cuûa sinh hoïc phaân töû. Protein p.53 Kích thích toång hôïp p.21 (öùc cheá cdk) Phong beá Sao cheùp AND Kích thích gen öùc cheá Kìm haõm GTP Kìm haõm gen ñieàu hoøa taêng tröôûng döông tính taêng tröôûng teá baøo Laøm ngöøng sinh saûn teá baøo ôû giai ñoaïn G Sô ñoà 2: Vai troø cuûa Protein p.53 Taï 13 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Ngaøy nay ñaõ xaùc ñònh ñöôïc raèng caùc gen ñeà phoøng hay gaây cheát teá baøo theo chöông trình cuõng tham gia taïo nhöõng bieán ñoåi quan troïng trong söï caân baèng ung thö. Moät nhoùm lôùn caùc gen ñieàu hoøa cheát teá baøo theo chöông trình ñaõ ñöôïc xaùc ñònh, caùc gen naøy ñöôïc ghi nhôù baèng caùc nhoùm ba chöõ baét ñaàu baèng chöõ b. Gen choáng cheát teá baøo theo chöông trình laàn ñaàu tieân ñaõ xaùc ñònh, bcl-2 laø moät thaønh phaàn cuûa moät nhoùm lôùn protein homodime vaø heterodime hoùa, moät soá protein naøy öùc cheá teá baøo cheát theo chöông trình (nhö chính bcl-2 vaø bcl-xL) trong khi caùc gen khaùc (nhö bax, bad, vaø bcl-xS) taïo ñieàu kieän cho teá baøo cheát theo chöông trình. Vieäc phaùt hieän ra gen bcl-2, moät gen prototyp trong loaïi naøy baét ñaàu vôùi nhaän xeùt laø khoaûng 85% caùc u lympho teá baøo B cuûa loaïi nang coù mang moät chuyeån ñoaïn ñieån hình t(14:18)(q22:q21). Caàn nhaéc laïi raèng 14q32 laø vò trí caùc gen chuoãi naëng cuûa globulin mieãn dòch cuõng lieân quan ñeán u lympho Burkitt. Vieäc xeáp caïnh vò trí hoaït ñoäng phieân maõ vôùi bcl-2 (khu truù ôû 18q21) gaây boäc loä quaù möùc bcl-2. Theo nhöõng cô cheá chöa bieát roõ, vieäc boäc loä quaù möùc bcl-2 baûo veä caùc lympho baøo khoûi bò cheát theo chöông trình vaø cho pheùp chuùng soáng laâu daøi, vì vaäy gaây neân söï tích luõy quaù möùc cuûa lympho baøo B, gaây beänh haïch vaø xaâm nhaäp tuûy xöông. Vì caùc u lympho boäc loä quaù möùc bcl-2 phaàn lôùn phaùt sinh laø do giaûm cheát teá baøo theo chöông trình hôn laø do buøng noå taêng sinh teá baøo, noù coù xu höôùng laønh tính (phaùt trieån chaäm) so vôùi phaàn lôùn caùc u lympho khaùc. Chöùng minh cho vai troø cuûa bcl-2 trong taïo u lympho laø nhaän xeùt raèng chuoät chuyeån gen vôùi bcl-2 phaùt sinh u lympho teá baøo B. Khoâng chæ chöùc naêng cuûa bcl-2 laø baát thöôøng maø söï khu truù cuûa noù cuõng khaùc vôùi haàu heát caùc gen ung thö khaùc. Noù naèm ôû laù ngoaøi cuûa maøng ty theå, löôùi noäi nguyeân sinh vaø maøng nhaân. Söï ñònh vò ty theå cuûa gen bcl-2 vaø caùc thaønh vieân khaùc cuûa hoï bcl-2 cuõng bieåu hieän chöùc naêng cuûa caùc gen naøy. Cô sôû sinh hoùa cuûa hoaït ñoäng bcl-2 chöa ñöôïc hoaøn toaøn hieåu bieát roõ. Cheát teá baøo theo chöông trình laø ñieåm cuoái cuøng cuûa chuoãi caùc söï kieän phaân töû gaây neân bôûi nhieàu kích thích vaø veà sau daãn ñeán söï hoaït hoùa caùc men thuyû phaân protein gaây cheát teá baøo (men caspase). Caùc thaønh vieân cuûa hoï bcl-2 aûnh höôûng moät caùch chính xaùc tôùi söï hoaït hoaù cuûa caùc caspase nhö theá naøo ñang ñöôïc khaûo saùt töôøng taän. Trong nhieàu moâ hình cheát teá baøo theo chöông trình, vieäc giaûi phoùng cytochrom C khoûi ty theå laø böôùc quan troïng trong chuoãi caùc söï kieän daãn ñeán cheát teá baøo theo Taï 14 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung chöông trình. Moät chöùc naêng cuûa cytochrom C ñuôïc giaûi phoùng hình nhö laø hoã trôï cho söï hoaït hoaù men caspase 9 phaân huûy protein. Khu truù moät caùch chieán löôïc ôû maøng ngoaøi ty theå bcl-2 vaø yeáu toá töông ñoàng cuûa noù ñöôïc cho laø coù vai troø ñieàu hoaø söï ñi ra cuûa cytochrom khoûi nhieãm saéc theå vaøo trong baøo töông teá baøo. Söï ñi ra cuûa cytochrom C naøy ñöôïc ñieàu hoaø moät caùch chính xaùc nhö theá naøo thì chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng coù moät soá baèng chöùng laø bax, moät thaønh vieân tröôùc cheát teá baøo theo chöông trình cuûa hoï bcl-2 taïo thaønh moät keânh trong maøng nhieãm saéc theå cho pheùp söï ñi ra cuûa cytochrom C (vaø vì vaäy daãn ñeán cheát teá baøo theo chöông trình), trong khi bcl-2 phong toûa hoaït ñoäng taïo keânh cuûa bax. Caùc thaønh phaàn tröôùc cheát teá baøo theo chöông trình vaø choáng cheát teá baøo theo chöông trình cuûa hoï bcl-2 taùc ñoäng nhö moät caùi bieán trôû trong ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình. Tyû leä cuûa caùc chaát choáng cheát (bcl-2, bclXL) vôùi chaát gaây cheát (bax, bcl-xS, bad, bid) seõ quyeát ñònh moät teá baøo ñaùp öùng vôùi moät kích thích cheát teá baøo theo chöông trình nhö theá naøo. Caùi bieán trôû naøy seõ hoaït ñoäng ít nhaát moät phaàn do söï dime hoùa caïnh tranh giöõa caùc thaønh phaàn khaùc nhau cuûa caùc nhoùm chaát. Vì vaäy trong khi caùc homodime cuûa bcl-2 taïo ñieàu kieän cho söï soáng soùt cuûa teá baøo (coù leõ do söï thay theá bax taïo keânh töø maøng ty theå), caùc homodime bax taïo thuaän lôïi cho cheát teá baøo theo chöông trình. Cuoái cuøng maëc duø hoï bcl-2 cuûa caùc gen bcl-2 ñoùng vai troø quan troïng trong ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình, ít nhaát coù hai gen keát hôïp vôùi ung thö khaùc cuõng lieân quan ñeán cheát teá baøo theo chöông trình laø gen p53 vaø protooncogen c-myc. Cô cheá phaân töû cuûa cheát teá baøo theo chöông trình gaây neân do hai böôùc caét ngang cuûa ñöôøng bcl-2. Gen c-myc gaây cheát teá baøo theo chöông trình khi caùc teá baøo bò ñieàu khieån bôûi hoaït hoùa c-myc, nhöng söï phaùt trieån ñöôïc giôùi haïn bôûi khaû naêng giôùi haïn cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng. Khi ñoái maët vôùi caùc tín hieäu nhö vaäy, teá baøo ñöôïc laäp chöông trình cheát bôûi ñieàu hoaø taêng p53 vaø caùc tín hieäu chöa ñöôïc xaùc ñònh khaùc. Bieåu loä quaù möùc cuûa bcl-2 coù theå giaûi thoaùt cho teá baøo khoâng bò cheát theo chöông trình gaây neân do c-myc. Vì vaäy hình nhö myc vaø bcl-2 coù theå hôïp taùc trong taïo u - c-myc kích thích sinh saûn vaø bcl-2 ngaên caûn cheát teá baøo ngay caû khi caùc yeáu toá phaùt trieån trôû neân bò haïn cheá. Ñaây laø moät trong nhieàu ví duï trong ñoù hai hay nhieàu gen ung thö hôïp taùc ñeå gaây phaùt sinh ung thö. Taï 15 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung 1.4. MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO UNG THÖ 1.4.1. Lòch söû phaùt trieån nuoâi caáy cuûa teá baøo ung thö Khoa hoïc veà nuoâi caáy moâ vaø teá baøo ñaõ phaùt trieån moät caùch vöõng chaéc trong suoát theá kyû 20. Töø nhöõng naêm 1885, Wilhelm Roux ghi nhaän raèng phoâi gaø coù theå phaùt trieån ôû dung dòch muoái sinh lyù trong vaøi ngaøy. Nhieàu thöû nghieäm tröôùc ñoù cuõng chöùng minh raèng moâ cuûa caùc loaøi ñoäng vaät löôõng cö coù theå taùi sinh trong quaù trình nuoâi caáy. Naêm 1887 Arnold cho raèng caùc lymphoâ baøo cuûa eách cuõng coù theå soáng trong dung dòch muoái sinh lyù. Ngay sau ñoù vaøo 1998 Ljunggren chöùng minh teá baøo da cuûa ngöôøi coù theå phaùt trieån neáu ñöôïc nuoâi caáy trong dung dòch asetic. Maëc duø ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu tröôùc nhöng ngöôøi ñöôïc xem laø cha ñeû cuûa phöông phaùp nuoâi caáy moâ laø Ross Harrison. Harrison laáy moâ töø phoâi eách ñöa vaøo haïch baïch huyeát thì caùc maûnh moâ khoâng chæ coù khaû naêng soáng soùt maø coøn phaùt trieån thaønh caùc maïng löôùi. Caùc thí nghieäm treân böôùc ñaàu ñaõ taïo neân laøn soùng chuù yù veà nuoâi caáy moâ in vitro, ñoàng thôøi söï thuùc ñaåy cuûa y hoïc buoäc ngöôøi ta quan taâm ñeán caùc loaøi vaät oån nhieät vaø coù quaù trình phaùt trieån bình thöôøng vaø beänh lyù gaàn gioáng ngöôøi. Naêm 1943, Wilton Earle - ngöôøi ñaàu tieân tieán haønh thí nghieäm veà doøng teá baøo lieân tuïc ôû loaøi gaëm nhaám töø moät teá baøo taùch rôøi. Naêm 1951, Geogre Gey thieát laäp doøng teá baøo ung thö töø coå töû cung ngöôøi (Hela). Naêm 1961, Hayflick vaø Moorhead ñaõ thöïc hieän nhöõng nghieân cöùu veà teá baøo bình thöôøng coù ñôøi soáng xaùc ñònh. 1.4.2. Moät soá phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø khoái u 1.4.2.1. Phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø khoái u cöùng hay khoái u di caên Hieän nay ñeå coù theå thu nguoàn maãu ung thö, ñaëc bieät laø töø caùc khoái u cöùng hay khoái u di caên töø cô theå beänh nhaân bò ung thö ñeàu phaûi ñöôïc tieán haønh phaãu thuaät taïi caùc beänh vieän. Nguoàn maãu sau khi thu seõ ñöôïc giöõ trong bình hoaëc loï chöùa saün moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp (nhö RPMI 1640, DMEM …), ñoàng thôøi phaûi ñöôïc giöõ Taï 16 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung trong ñieàu kieän laïnh nhö öôùp ñaù, hoaëc toát nhaát laø ñöôïc giöõ trong nitô loûng vì ñieàu naøy seõ giuùp duy trì ñöôïc ñaëc tính teá baøo. Quaù trình thu maãu vaø xöû lyù maãu phaûi ñöôïc tieán haønh nhanh choùng. Maãu sau khi thu seõ ñöôïc tieán haønh xöû lyù taïi phoøng thí nghieäm. Quaù trình xöû lyù maãu phaûi ñöôïc thao taùc trong ñieàu kieän voâ truøng. Sau khi löïa choïn phaàn moâ coøn soáng vaø loaïi boû phaàn moâ hö hoaëc cheát, phaàn moâ soáng coøn laïi seõ ñöôïc röûa qua nhieàu laàn baèng dung dòch muoái sinh lyù coù chöùa khaùng sinh hoaëc dung dòch HBSS – Hank’s balanced salt solution ñeå loaïi boû bôùt maùu. Sau ñoù caét khoái moâ ra thaønh töøng maûnh nhoû (1-2 mm3), thöôøng ñöôïc tieán haønh treân ñóa petri. Sau khi theâm vaøo ñóa petri moät ít dung dòch nuoâi caáy (1 – 2ml), duøng pipet hoaëc pastette ñeå chuyeån caùc maûnh moâ töø ñóa petri vaøo bình nuoâi caáy, ñeå trong tuû nuoâi khoaûng töø 2 – 3 giôø, ñieàu naøy seõ giuùp cho söï baùm cuûa teá baøo vaøo bình nuoâi caáy toát hôn. Theâm vaøo 5 – 10ml, ñeå yeân bình nuoâi caáy cho ñeán töø 72 – 96 giôø. Sau nhieàu ngaøy nuoâi caáy, teá baøo phaùt trieån baùm dính vaøo thaønh bình vaø khi ñeán maät ñoä caàn thieát seõ ñöôïc tieán haønh caáy chuyeàn. Ñaây laø moät trong nhöõng phöông phaùp ít laøm toån thöông ñeán teá baøo nhaát, thôøi gian thao taùc ngaén, ñoàng thôøi deã daøng thao taùc. Nhöng ñieàu caàn löu yù laø thao taùc phaûi chuaån, nhöõng maãu moâ phaûi ñöôïc caét nhoû, quaù trình thí nghieäm phaûi ñöôïc tieán haønh trong ñieàu kieän voâ truøng tuyeät ñoái ñeå traùnh söï nhieãm. 1.4.2.2. Phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø maãu dòch cuûa cô theå Phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo töø nhöõng maãu dòch cuûa cô theå nhö: dòch maøng buïng, dòch maøng phoåi… Caùc maãu dòch ñöôïc thu taïi beänh vieän vaø ñem veà xöû lyù taïi phoøng thí nghieäm voâ truøng, tuøy theo maãu dòch laáy vôùi theå tích khaùc nhau. Ñem maãu dòch ñi ly taâm, khoaûng 3000g/ 20 phuùt. Loaïi boû dung dòch noåi, huyeàn phuø phaàn caën vôùi dung dòch muoái sinh lyù PBS. Neáu maãu chöùa soá löôïng teá baøo maùu nhieàu ta coù theå loaïi boû baèng phöông phaùp ly taâm vôùi dung dòch Ficoll. Khoaûng 10ml dung dòch teá baøo huyeàn phuø vôùi PBS hoaëc HBSS cho vaøo dung dòch Ficoll, ly taâm khoaûng 1000g/ 20 – 30 phuùt. Caùc teá baøo hieän dieän trong phaàn dung dòch ñeäm, ñem ly taâm khoaûng 600g/ 5 phuùt. Taï 17 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Quaù trình naøy laäp laïi cho ñeán khi thu ñöôïc heát phaàn teá baøo coøn laïi. Toaøn boä phaàn teá baøo thu ñöôïc seõ ñöôïc huyeàn phuø vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy vaø chuyeån vaøo ñóa nuoâi. 1.4.2.3. Phöông phaùp taùch teá baøo baèng enzym Söû duïng enzym ñeå taùch teá baøo töø nhöõng moâ soáng laø moät trong nhöõng phöông phaùp phoå bieán nhaát. Hieän nay moät soá enzym ñöôïc söû duïng trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, dipase, vaø papain … tuøy thuoäc vaøo maãu moâ ñeå choïn enzym vaø noàng ñoä enzym thích hôïp nhaèm coù theå taùch ñöôïc teá baøo vaø ñoàng thôøi khoâng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa chuùng. Chaúng haïn trypsin laø moät enzym ñöôïc söû duïng phoå bieán trong vieäc taùc teá baøo ñoäng vaät vôùi hai quy trình: (1) Quy trình trypsin aám - Caét nhoû khoái moâ thaønh nhöõng maûnh nhoû khoaûng 2 – 3mm3. - Theâm dung dòch trypsin vaøo (1g khoái moâ/ 10ml trypsin), noàng ñoä trypsin thöôøng ñöôïc söû duïng laø 0,25% (hoaëc coù theå laø 0,05%, 0,015%), hoaëc coù theå theâm vaøo chaát neàn EDTA (0,01% -0,02%),. - Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC. Ñeå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo caàn thieát thì thôøi gian khuaáy coù theå töø 15 – 45 phuùt. - Ñem ñi ly taâm, 600g/ 5 phuùt, loaïi boû phaàn noåi, theâm moâi tröôøng vaøo chuyeån teá baøo vaøo bình nuoâi caáy. - Quaù trình naøy laäp laïi cho ñeán khi thu ñöôïc heát phaàn teá baøo coøn laïi. (2) Quy trình trypsin laïnh Coù theå uû caùc maûnh moâ nhoû trong dung dòch trypsin ôû noàng ñoä thích hôïp, taïi nhieät ñoä khoaûng 4oC, ñieàu naøy seõ giuùp cho vieäc taùch teá baøo deã daøng vaø ít aûnh höôûng ñeán teá baøo. Sau 6 – 8 giôø, giaûi ñoâng khoaûng 30 phuùt ôû nhieät 37oC. Sau khi ly taâm loaïi boû phaàn noåi, theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. 1.4.3. Nhöõng kyõ thuaät caàn thieát cho vieäc nuoâi caáy teá baøo Ngaøy nay vieäc nuoâi caáy teá baøo ñaõ ñöôïc thöïc hieän roäng khaép treân theá giôùi. Hôn 50 naêm keå töø laàn ñaàu tieân coâng boá söï xuaát hieän doøng teá baøo ung thö coå töû cung ôû ngöôøi (Hela), ñeán nay caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ thieát laäp khoaûng 3.000 doøng teá baøo Taï 18 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung ung thö vaø coù 1000 doøng ñöôïc söû duïng thöôøng xuyeân, phaàn lôùn coù nguoàn goác töø ung thö ôû ngöôøi. Ñaây laø nguoàn maãu caàn thieát cho caùc phaân tích sinh hoùa cuûa teá baøo ung thö. Ñieàu naøy môû ra cô hoäi cho caùc nhaø khoa hoïc coù ñieàu kieän nghieân cöùu, tìm hieåu saâu hôn veà caùc ñaëc tính sinh hoïc ñoàng thôøi xaùc ñònh vaø moâ taû ñaëc ñieåm cuûa teá baøo ung thö. Vôùi muïc ñích söû duïng caùc doøng teá baøo naøy ñeå nghieân cöùu hoaït tính cuûa caùc hoaït chaát khaùng ung thö trong ñieàu kieän in vitro, saûn xuaát vaccin ñieàu trò. Maëc duø nhöõng döõ lieäu coù ñöôïc töø caùc phoøng thí nghieäm vaãn caàn phaûi ñöôïc xem xeùt moät caùch thaän troïng, nhöng vai troø thöïc tieãn cuûa vieäc nuoâi caáy cuûa caùc doøng teá baøo ung thö trong nghieân cöùu vaø ñieàu trò beänh ung thö ñaõ ñöôïc thöøa nhaän. 1.4.3.1. Moâi tröôøng nuoâi caáy Hieän nay ngöôøi ta söû duïng moâi tröôøng nuoâi caáy toång hôïp ñaõ ñöôïc phaùt trieån töø nhöõng naêm 1950. Caùc chaát cô baûn coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy bao goàm amino acid, carbohydrat, Vitamin, vaø muoái. Huyeát thanh vaø caùc thaønh phaàn khaùc nhö yeáu toá taêng tröôûng hocmon ñöôïc theâm vaøo moâi tröôøng cô baûn ñeå cung caáp nhöõng chaát caàn thieát cho teá baøo phaùt trieån. Moâi tröôøng nuoâi caáy ñaàu tieân laø moâi tröôøng BME (Eagle’s basal medium), ñaây laø moâi tröôøng do Harry Eagle thieát laäp coù theå söû duïng cho caû teá baøo bình thöôøng vaø teá baøo khoái u. Moâi tröôøng phaùt trieån tieáp theo sau ñöôïc goïi laø moâi tröôøng toái thieåu MEM (Eagle’s minium essential medium) cuõng do Harry Eagle thaønh laäp, MEM naøy ñöôïc taêng cöôøng theâm haøm löôïng amino acid. Trong khi ñoù thì moâi tröôøng DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) do Dulbecco caûi tieán, trong ñoù caùc thaønh phaàn cuûa amino acid vaø Vitamin taêng gaáp 4 laàn, glucose taêng 4,5 laàn. Moâi tröôøng IMDM (Iscove’s modified Dulbecco medium) do Iscove thieát laäp treân cô sôû caûi tieán moâi tröôøng DMEM. Moâi tröôøng naøy chöùa selenium, amino acid, vitamin, sodium pyruvate, dung dòch ñeäm HEPES. Moâi tröôøng GMEM (Glasgow minium essential medium) laø söï bieán ñoåi khaùc cuûa moâi tröôøng Eagle duøng ñeå nghieân cöùu caùc yeáu toá gaây aûnh höôûng ñeán teá baøo. Moâi tröôøng naøy coù chöùa amino acid vaø vitamin cao gaáp hai laàn so vôùi moâi tröôøng Eagle. Taï 19 Ngoïc Tuyeát Minh Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Naêm 1950, Morgan vaø ñoàng söï ñaõ cho bieát moâi tröôøng coù theå hoå trôï cho caùc moâ phaùt trieån, ñoù laø moâi tröôøng 199, chöùa nhieàu thaønh phaàn coù theå tìm thaáy ôû moâi tröôøng Eagle vaø coù theå söû duïng cho nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau. Moät moâi tröôøng khaùc ít phöùc taïp hôn laø CMRL 1066 ñöôïc thieát laäp taïi Connaught Medical Research Institue, ñaây laø moâi tröôøng ñaàu tieân khoâng söû duïng huyeát thanh nhöng coù boå sung theâm moät vaøi chaát hoã trôï gaàn gioáng huyeát thanh. Moät moâi tröôøng khaùc khoâng huyeát thanh ñöôïc goïi laø moâi tröôøng Waymouth duøng ñeå nuoâi caáy teá baøo L929 ôû chuoät, nhöng moâi tröôøng naøy cuõng ñöôïc chöùng minh laø coù theå söû duïng trong nuoâi caáy caùc doøng teá baøo khaùc. Naêm 1959, McCoy moâ taû coâng thöùc cô baûn ñeå taïo ra moâi tröôøng hoã trôï cho muïc tieâu nuoâi caáy sô caáp. Moâi tröôøng RPMI 1640 do Moore vaø ñoàng söï thieát laäp taïi Park Memorial Institue, ñöôïc söû duïng phoå bieán cho nhieàu doøng teá baøo khaùc nhau vaø cuõng ñöôïc caùc phoøng thí nghieäm choïn löïa ñeå nuoâi caáy teá baøo vaø moâ baïch huyeát. Moâi tröôøng coù theå ñöôïc cung caáp töø caùc nguoàn thöông maïi vôùi caùc coâng thöùc khaùc nhau, nhö moâi tröôøng coù noàng ñoä bình thöôøng (coù theå söû duïng töø 9 – 12 thaùng), hoaëc moâi tröôøng coù noàng ñoä 10X (coù theå söû duïng trong voøng 12 – 24 thaùng), hoaëc moâi tröôøng coù noàng ñoä ñaäm ñaëc (coù theå söû duïng töø 2 – 3 naêm). 1.4.3.2. Huyeát thanh Maëc duø moâi tröôøng coù chöùa nhieàu chaát boå döôõng caàn thieát cho söï phaùt trieån, nhöng huyeát thanh laø yeáu toá hoã trôï cho khaû naêng soáng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo trong nuoâi caáy. Huyeát thanh kích thích söï phuïc hoài caùc toån thöông cuûa teá baøo khi caáy chuyeàn vaø caùc protein trong huyeát thanh laøm baát hoaït trypsin traùnh caùc enzym gaây toån thöông teá baøo. Huyeát thanh coù tính khaùng oxy hoùa maïnh, ñoàng thôøi chuùng coøn coù taùc duïng caûi thieän tính dính cuûa teá baøo leân beà maët bình nuoâi. Huyeát thanh bao goàm hocmon, caùc nhaân toá taêng tröôûng, lipid, caùc protein vaän chuyeån vaø caùc chaát keát dính. Trong caùc nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ung thö, huyeát thanh beâ vaø huyeát thanh thai boø ñöôïc söû duïng roäng raõi, ngoaøi ra cuõng theå söû duïng huyeát thanh ngöôøi vaø ngöïa. Hieän nay, tröø nhöõng doøng teá baøo ñöôïc thuaàn hoùa vôùi moâi tröôøng toång hôïp hoaøn toaøn, ña soá ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng coù boå sung töø 5 – 20% huyeát thanh laø toát Taï 20 Ngoïc Tuyeát Minh
- Xem thêm -