Thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối saccharomyces carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên

  • Số trang: 71 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 36 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

1 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đề tài này Trước hết tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu - Trường Đại học Nha Trang, Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác Quốc tế, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến, Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về kinh phí và cơ sở vật chất cho tôi thực hiện đề tài này. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội Phó giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và Cử nhân Ngô Anh Tiến đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cám ơn: TS. Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS.TS. Trần Thị Luyến, PGS.TS. Lương Đức Phẩm - Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: cô Ths. Khúc Thị An, các quý thầy cô giáo phòng Thí nghiệm Hóa sinh – Vi sinh, phòng Thí nghiệm Công nghệ Chế biến - Khoa Chế biến và Viện Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Sinh viên Bùi Thị Phượng 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 2 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS).............................................. 2 1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men ................................................................................. 2 1.1.2. Đặc tính sinh lý tế bào nấm men ............................................................................. 6 1.2. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY THU SINH KHỐI VI SINH VẬT................................................................................................................................ 12 1.2.1. Khái niệm về protein đơn bào ................................................................................. 14 1.2.2. Giới thiệu về ứng dụng của sinh khối vi sinh vật .................................................... 14 1.3. GIỚI THIỆU MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN DÙNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TĂNG SINH S.CARLSBERGENSIS ............................................................ 16 1.3.1. Đậu tương.............................................................................................................. 16 1.3.2. Cám gạo ................................................................................................................ 18 1.3.3. Khoai tây ................................................................................................................ 19 1.3.4. Bột ngô .................................................................................................................. 19 1.3.5. Giá đậu xanh........................................................................................................... 20 1.3.6. Bắp cải ................................................................................................................... 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................................... 22 2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................... 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................. 22 2.3.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật.................................................................... 22 2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy nấm men....................................................................... 23 3 2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.............................................................................. 23 2.3.2.2. Phương pháp hoạt hóa S.carlsbergensis từ đông khô............................................ 25 2.3.2.3. Thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa S.carlsbergensis bằng môi trường Hansen................................................................................................... 28 2.3.2.4. Thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối bằng MTTN ................... 29 2.3.2.5. Phương pháp giữ giống và cấy chuyền ................................................................. 33 2.3.2.6. Phương pháp nhân giống, lên men và thu sinh khối.............................................. 35 2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................................................................................. 36 2.5. CÁC DỤNG CỤ THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 36 2.5.1. Các dụng cụ thiết bị chủ yếu ................................................................................... 36 2.5.2. Các loại hóa chất..................................................................................................... 36 2.6. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................... 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 37 3.1. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO HOẠT HÓA S.CARLSBERGENSIS BẰNG MÔI TRƯỜNG HANSEN.................................................................................... 37 3.1.1. Xác định thời gian hoạt hóa cho S.carlsbergensis.................................................... 37 3.1.2. Xác định pH thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis..................................... 38 3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis ............................. 39 3.2. XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI TĂNG SINH KHỐI BẰNG MTTN ....................................................................................................... 40 3.2.1. Xác định môi trường nuôi tăng sinh S.carlsbergensis.............................................. 40 3.2.2. Xác định tỷ lệ cơ chất pha MT6 cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis..................... 41 3.2.3. Xác định tỷ lệ đường Saccharose bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis ............................................................................................................. 42 3.2.4. Xác định tỷ lệ dịch tự thủy phân nấm men bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis ............................................................................................................. 43 3.2.5. Xác định tỷ lệ một số khoáng bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44 3.2.5.1. Xác định hàm lượng MgSO4 bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44 3.2.5.2. Xác định hàm lượng K2HPO4 bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis ............................................................................................................. 45 3.2.6. Xác định thời gian nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis........................................ 46 4 3.2.7. Xác định pH nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis................................................... 47 3.3. THỬ NGHIỆM LÀM KHÔ SINH KHỐI NẤM MEN............................................... 48 3.4. ĐỀ XUẤT NUÔI THU SINH KHỐI S.CARLSBERGENSIS ...................................... 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 55 PHỤ LỤC 5 DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG 1 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nấm men 2 Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid trong đậu tương tách dầu 16 3 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong chất béo đậu tương 17 4 Bảng 1.4. Hàm lượng chất vô cơ trong đậu tương 17 5 Bảng 1.5. Hàm lượng vitamin trong đậu tương 18 6 Bảng 1.6. Bảng hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cải bắp 21 7 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của men sau sấy 48 8 Bảng 3.2. Bảng hàm lượng protein hòa tan của S.carlsbergensis 53 9 Bảng 3.3. Bảng biểu hiện lượng sinh khối thu hồi của 53 S.carlsbergensis 7 6 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG 1 Hình 1.1. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men 2 2 Hình 1.2. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 3 3 Hình 1.3. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 6 4 Hình 2.1. Sơ đồ chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men 24 5 Hình 3.1. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 37 6 Hình 3.2. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH nuôi cấy 38 7 Hình 3.3. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo nhiệt độ nuôi cấy 39 8 Hình 3.4. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo môi trường nuôi cấy 40 9 Hình 3.5. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy 41 10 Hình 3.6. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ đường saccharose 42 11 Hình 3.7. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cao nấm men bổ sung 43 12 Hình 3.8. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng MgSO4 bổ sung 44 13 Hình 3.9. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng K2HPO4bổ sung 45 14 Hình 3.10. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 47 15 Hình 3.11. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH của môi trường nuôi 48 16 Hình 3.12. Hình ảnh Saccharomyces carlsbergensis nhuộm tiêu bản sống nuôi trên môi trường Hansen 52 17 Hình 3.13. Hình ảnh Saccharomyces carlsbergensis nhuộm tiêu bản sống nuôi trên môi trường nghiên cứu 52 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MT: môi trường MTTN: môi trường tự nhiên MT1: môi trường nước chiết bột ngô MT2: môi trường nước chiết cám gạo MT3: môi trường nước chiết bắp cải MT4: môi trường nước chiết khoai tây MT5: môi trường nước chiết bột đậu tương MT6: môi trường nước chiết giá đậu xanh v/p: vòng/phút 1 MỞ ĐẦU Nấm men là một trong số những vi sinh vật dùng trong sản xuất sinh khối protein (SCP – Single cell protein) do tế bào rất giàu protein và có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, dễ tách thu sinh khối sau khi nuôi sinh khối. Việc nuôi sinh khối vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng hiện nay thường dùng bằng môi trường nuôi nhân tạo hoặc một số nguyên liệu thông thường như rỉ đường, bã rượu…Để góp tìm hiểu khả năng sử dụng môi trường tự nhiên trong việc nuôi sản xuất sinh khối nấm men để sản xuất sinh khối nấm men dùng trong chăn nuôi chúng tôi tiến hành: “Thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối Saccharomyces carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên”. Nội dung của đề tài 1) Nghiên cứu tìm các điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa chủng S.carlsbergensis. 2) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi để thu nhận sinh khối nấm men S.carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên. 3) Thu nhận sinh khối nấm men và đánh giá sơ bộ sinh khối thu nhận. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm phong phú thêm về môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu hồi sinh khối nói riêng và cho việc ứng dụng nuôi sinh khối nấm men (S.carlsbergensis) nói riêng. Từ đó thu nhận sinh khối nấm men để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay nuôi trồng thủy sản hay sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thủy phân sản xuất bột đạm, hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm. Do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu, vận dụng kiến thức đã học vào thực hành, năng lực và thời gian có hạn nên em không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài được hoàn thiện hơn. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS) Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) chỉ là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi (budding). Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). 1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men Nấm men loài Saccharomyces carlsbergensis thuộc giới Eumycophyta (nấm), lớp Ascomycetes, bộ Endomycetes, họ Saccharomycetaceae, giống Saccharomyces, loài carlsbergensis. − Hình dạng tế bào nấm men [8] Hình dạng tế bào của nấm men S.carlsbergensis chủ yếu là hình cầu. Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của Saccharomyces carlsbergensis − Kích thước tế bào nấm men. Tế bào nấm men S.carlsbergensis thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 ÷ 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình 3 + Chiều dài: 9 ÷ 10 µ m + Chiều rộng: 2 ÷ 7 µ m Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. − Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Tế bào nấm men S.carlsbergensis cũng như nhiều loại tế bào nấm men khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: N= nhân; M= ty thể; Va= không bào; ER= mạng lưới nội chất; Ves= bào nang Hình 1.2. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men [17] Vỏ tế bào Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Thành phần hóa học của vỏ tế bào gồm có các phức chất protein – polysacarit, phosphate và lipit. Vỏ tế bào dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% khối lượng tế bào. Màng tế bào chất Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày không quá 0,1nm dính chặt với tế bào chất. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ 4 bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu trú một số enzyme và cơ quan tử của tế bào (như roboxom). Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của màng. Mạng lưới nội chất (dictyosome) Trong tế bào chất của nấm men còn chứa một hệ thống màng hai lớp, được gọi là mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng có kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và rồi có thể từ đây tạo thành không bào. Mạng lưới này còn được gọi là thể golgi hay bộ máy golgi. Nhân tế bào: nhân là cấu tử bất biến của tế bào nấm men Nhân của tế bào nấm men có vỏ màng, hạch nhân (thể nhiễm sắc – karyokon) và chất nhân (karyoplasma). Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các quy trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài, cũng như giữa nhân với tế bào chất. Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2 µ m. Phần lớn nhân có dạng hình cầu hoặc elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể thay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào. Kính thước nhân của tế bào nấm men không đồng nhất ở các trạng thái sinh lý khác nhau. Ở tế bào nấm men đang sinh trưởng nhân rất giàu acid nucleic và vùng sinh sản được hoạt hóa (nơi sẽ mọc chồi hoặc phân cắt tế bào). Thành phần hóa học cơ bản của nhân là acid dezoxinucleic (AND) có vai trò truyền thông tin từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nhân còn có protein nhưng không liên kết với các acid nucleic. Quá trình sinh tổng hợp protein và đặc điểm các protein này được tiến hành theo lệnh của AND nhờ các acid ribonucleic truyền đạt và vận chuyển (mARN và tARN). Hàm lượng AND trong tế bào bất kỳ là ổn định nghiêm ngặt và không phụ thuộc vào các điều kiện của môi trường bên ngoài, vào dinh dưỡng cũng như các yếu tố khác. 5 Ty thể (Mitochondria hay Chondrixom) Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố đều trong tế bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Chiều dài của sợi ty thể là 0,2 ÷ 7,5 µ m. Hình dạng của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết thành chuỗi. Những chất dinh dưỡng thấm vào nội bào được hấp thụ và tích lũy bởi ty thể sẽ nhanh chóng thành dạng đậm đặc nhờ các enzyme tương ứng tham gia. Các phản ứng năng lượng quan trọng – quá trình phosphosyl hóa có oxy tham gia và các phản ứng của chu trình Krebs xảy ra hoàn toàn trong ty thể. Ty thể của nấm men có cấu tạo chủ yếu từ khoảng 30% chất béo và 60 ÷ 70% protein. Trong số protein này có khoảng 25 ÷ 75% ở dạng protein cấu trúc. Trong ty thể có chứa các enzyme thực hiện các phản ứng oxy hóa trong chu trình Krebs, chuyển điện tử qua chuỗi hô hấp và quá trình phosphoryl hóa để thực hiên chức năng cung cấp năng lượng sinh học và vật liệu tham gia vào các cơ chế phức tạp tái tạo ADN, phiên mã và dịch mã các thông tin di truyền vào sinh tổng hợp phospholipid của sterin, vào hoạt hóa các acid béo... Không bào (vacuole) Không bào là một cơ quan nội bào có dạng hang (hốc) chứa đầy dịch bào và được tách ra từ tế bào chất thành màng không bào. Trong dịch bào ngoài các chất điện ly hòa tan trong nước còn có các hợp chất dạng keo như protein, chất béo, hydratcacbon và các enzyme chứa nguyên tử riêng biệt hoặc muối. Không bào có chứa các enzyme thủy phân, enzyme oxy hóa – khử, các polyphosphat, lipit, các hợp chất trung gian của tế bào có phân tử lượng thấp và các ion kim loại. Các quá trình oxy hóa – khử xảy ra trong dịch bào. Hình dạng và kích thước không bào thay đổi liên tục, chuyển dịch và tiếp xúc với tế bào chất. Một tế bào nấm men có thể có một hoặc một vài không bào ở trung tâm. Không bào chứa các ti thể vùi rất đa dạng, có thể là các chất ở dạng hòa tan, ở dạng tinh thể hay ở dạng hạt hoặc giọt. Không bào của nấm men trưởng thành thường lớn hơn khi ở tế bào trẻ. Tuy nhiên, ở một thời điểm của vòng đời khi nẩy chồi mới bắt đầu thì hình như không bào được chia thành nhiều không bào nhỏ và 6 một số trong đó được chuyển sang tế bào con. Sau đó các không bào còn lại có xu hướng tái hợp thành một không bào duy nhất. 1.1.2. Đặc tính sinh lý tế bào nấm men * Sự sinh sản của nấm men S.carlsbergensis: hầu hết các tế bào nấm men S.carlsbergensis khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi. Các tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu vỏ sang tế bào con, mà ở chỗ các mấu chồi sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ tế bào và tích tụ ở đây để chuyển sang cho tế bào con. Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian. Hình 1.3. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men [17] * Thành phần hóa học của tế bào nấm men [8] Thành phần sinh khối khô của tế bào nấm men nhìn chung bao gồm: − Nước: 75 ÷ 85% − Chất khô: 15 ÷ 25%. Trong đó chất khoáng chiếm 2 ÷ 14% hàm lượng chất khô. Thành phần hóa học của tế bào nấm men nếu tính theo các nguyên tố cấu thành sẽ là (% theo trị số trung bình): 7 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nấm men Các chất Thành phần (% chất khô) Cacbon 47 Hydro 65 Nito Photpho 5 ÷ 10 1.6 ÷ 3.5 Hàm lượng các nguyên tố không phải đa lượng Canxi 0.3 ÷ 0.8 Kali 0.5 ÷ 2.5 Magiê 0.1 ÷ 0.4 Natri 0.06 ÷ 0.2 Các nguyên tố vi lượng (mg/kg) • Sắt 90 ÷ 350 Đồng 20 ÷ 135 Kẽm 100 ÷ 160 Mo 15 ÷ 65 Protein: nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô) và khảng 45% protein hoàn chỉnh. Protein của nấm men chứa không ít hơn 20 amino acid và có tất cả các amino acid không thay thế. • Chất béo: chất béo trong tế bào nấm men có các acid oleic, linoelic, palmitric. Trong chất béo có tới 30 ÷ 40% phosphatit. • Tro: trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P2O5 khoảng 25 ÷ 60, CaO 1 ÷ 8, MgO 4 ÷ 6, SiO2 1 ÷ 2, Fe2O3 0.05 ÷ 0.7. • Phospho: trong tế bào nấm men thấy ortho-, pyro- và metaphosphat ở dạng hữu cơ và vô cơ. 8 * Dinh dưỡng nấm men Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của nấm men. Trong môi trường có thể chia thành 4 nhóm thành phần chủ yếu là: nguồn dinh dưỡng cacbon; nguồn nitơ dinh dưỡng; các nguồn khoáng đa lượng, trung lượng và vi lượng; nguồn các chất sinh trưởng. − Dinh dưỡng cacbon Nấm men S.carlsbergensis không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulose. Vì vậy, S.carlsbergensis không sử dụng được trực tiếp tinh bột cũng như cellulose. Nên nguồn cacbon dinh dưỡng chủ yếu là các loại đường như: mật rỉ đường, saccharose, maltose, glucose… − Dinh dưỡng nitơ Nguồn nitơ cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitơ của tế bào là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Nấm men S.carlsbergensis không có men ngoại bào để phân giải protein, nên phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Đạm hữu cơ thường dùng là amino acid, pepton, amid từ dịch thủy phân các loại khô dầu (đậu tương, lạc, bông, hướng dương) và thịt, cá, nước chiết nấm men và cao men, nước chiết ngô và cao ngô…Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat… − Các các nguồn khoáng đa lượng, trung lượng và vi lượng. Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men + Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. Nồng độ các nguồn phospho quá cao cũng làm cho vi sinh vật phát triển kém và giảm hiệu suất sinh tổng hợp. Trong phòng thí nghiệm vi sinh người ta thường dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. + Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số amino acid, albumin, vitamin và enzyme. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. + Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. 9 + Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. + Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. + Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê. − Nguồn các chất sinh trưởng gồm các vitamin, các amino acid, peptit... Trong thực tế sản xuất người ta có thể dùng nguồn chất sinh trưởng là cao ngô, cao nấm men, dịch tự thủy phân, dịch chiết từ rau quả, giá đỗ, dịch thủy phân từ protein... * Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men Nấm men S.carlsbergensis hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản là: − Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này. − Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permease hoạt hóa. Permease là một protein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permease lại tiếp tục vận chuyển tiếp. * Quá trình sinh trưởng và phát triển Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men S.carlsbergensis tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết ở trong môi trường giảm tới mức thấp nhất. Khi đó sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và ngừng hẳn. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: 10 + Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch. + Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy… Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai đoạn: N Hình 1.4. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men • Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều. • Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men. • Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều. • Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết. • Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng tế bào nấm men giảm dần. * Các hình thức hô hấp của nấm men Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy ý. Chúng có thể sống ở điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí. Chính vì thế chúng có hai kiểu hô hấp khác nhau, tùy thuộc vào điều kiện có đủ oxy cung cấp cho chúng hay không. Vì vậy, khi nuôi cấy nấm men ở điều kiện tĩnh, có nghĩa là không sục khí, thì thời gian đầu nấm men sinh trưởng ở điều kiện khí và lượng oxy hòa tan cạn dần nấm men chuyển sang hô hấp kỵ khí. 11 Hô hấp hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 674 cal Hô hấp kị khí: C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal * Những nhân tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men Các yếu tố ảnh hưởng ở đây là: nhiệt độ, oxy hòa tan hay độ hiếu khí, pH môi trường, thời gian nuôi, thành phần môi trường, các sản phẩm tạo ra trong môi trường nuôi và các điều kiện khác của môi trường nuôi cấy. • Nhiệt độ Một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men là nhiệt độ. Đối với sinh trưởng nấm men S.carlsbergensis nhiệt độ tối thích vào khoảng 24 ÷ 360C. Khi nhiệt độ thấp thì sinh trưởng kém. • Oxy hòa tan – độ hiếu khí Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxy hòa tan trong môi trường, đơn vị tính là mg O2/lít môi trường. Ở nhiệt độ càng cao lượng oxy hòa tan trong dịch càng thấp. Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong môi trường có khuấy trộn thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn. Do đó tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn. • pH của môi trường pH của môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng tới đời sống của nấm men. pH quá cao hoặc quá thấp đều gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và sinh trưởng của nấm men. pH thích hợp cho S.carlsbergensis phát triển là: 4.2 ÷ 6.2. • Thời gian nuôi cấy Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi chất dinh dưỡng cần thiết trong môi trường giảm tới mức thấp nhất. Khi đó sự sinh trưởng và phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia nữa, nhưng sự tăng sinh khối không đáng kể. Thời gian thích hợp để nuôi cấy tăng sinh cho S.carlsbergensis là 24 ÷ 36 giờ. 12 1.2. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY THU SINH KHỐI VI SINH VẬT 1.2.1. Khái niệm về protein đơn bào Protein đơn bào là một thuật ngữ được gọi theo quy ước dùng để chỉ vật chất tế bào vi sinh vật được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật. Thuật ngữ này không hoàn toàn chính xác, vì thông thường sản phẩm được tạo ra không phải là một protein thuần khiết mà là các tế bào đã được xử lý thuộc nhiều loại vi sinh vật khác nhau, cả đơn bào lẫn đa bào, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo. • So với sản xuất các protein truyền thống, sản xuất SCP có những ưu thế sau: − Tốc độ sản xuất cao − Hàm lượng protein cao (30 ÷ 80% tính theo trọng lượng khô) − Có thể dùng các nguồn cacbon khác nhau − Các chủng có năng suất cao và thành phần tốt: dễ kiếm, dễ chọn − Diện tích sử dụng không lớn, cho sản lượng cao − Không phụ thuộc vào mùa vụ, khí hậu • Các bước của một quá trình sản xuất SCP bao gồm: − Chuẩn bị nguồn cacbon − Chuẩn bị môi trường thích hợp chứa nguồn cacbon và các nguồn nitơ, photpho, và các chất dinh dưỡng khác − Ngăn ngừa sự nhiễm tạp môi trường hoặc thiết bị sản xuất − Cấy vi sinh vật mong muốn − Tách sinh khối tế bào vi sinh vật khỏi môi trường nuôi cấy − Xử lý để thu được sinh khối tinh Trong đó cần chú ý những vấn đề sau: Nuôi cấy: lên men diễn ra dưới điều kiện vô trùng hoặc điều kiện sạch cần phải có các biện pháp để trách tạp nhiễm ở các điểm sau: 13 − Môi trường, thiết bị: đun nóng hoặc lọc các thành phần môi trường và khử trùng các thiết bị lên men. − Thông khí (các quá trình sản xuất SCP cần thông khí mạnh). − Hệ thống làm lạnh (loại bỏ nhiệt sinh ra trong quá trình sinh vật phát triển). Tuyển chọn vi sinh vật Một vi sinh vật được sử dụng cho mục đích sản xuất SCP làm nguồn protein cho người hoặc động vật cần phải có một số đặc điểm cơ bản: − Không gây bệnh cho động thực vật và người. − Có giá trị dinh dưỡng cao. − Được chấp nhận như là một loại thực phẩm hoặc thức ăn gia súc. − Không chứa các chất độc. − Giá thành sản xuất thấp, giá thành sản xuất phụ thuộc vào: + Tốc độ sinh trưởng, sản lượng, hàm lượng protein + Có đòi hỏi các chất dinh dưỡng bổ sung hay không + Có ưu thế phát triển chọn lọc trên môi trường sản xuất + Dễ tách và làm khô Hệ vi sinh vật dùng nuôi cấy trong sản xuất SCP − Vi khuẩn: Lactobacillus fermentus, Bacillus subtilis… − Tảo: Chlorella, Scenedesmus, Spirulina… − Nấm men: Saccharomyces, Candida, Torlopsis… − Nấm sợi: Aspergilus oryzae, Trichoderma reesei… − Nấm ăn: nấm mỡ, nấm hương, mộc nhĩ…
- Xem thêm -