Tài liệu Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THÀNH LUÂN THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN KHÁNG CHẤT DIỆT CỎ GLYPHOSATE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.014 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên - 2014 i LỜI CAM ĐOAN . Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thành Luân XÁC NHẬN CỦA TRƢỞNG KHOA CHUYÊN MÔN XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Văn Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành KS Hồ Mạnh Tường, cán bộ nghiên cứu , Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm của đề tài. & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, ngày 16 tháng 04 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thành Luân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ......................................................................................................... ii Mục lục .............................................................................................................iii Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................. v Danh mục các bảng........................................................................................... vi Danh mục các hình .......................................................................................... vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 2.1. Chất diệt cỏ và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp ............................... 3 2.1.1 Cỏ dại và cách phòng trừ .......................................................................... 3 2.1.2. Các loại thuốc diệt cỏ đang sử dụng ........................................................ 4 2.2. Chất diệt cỏ glyphosate .............................................................................. 8 2.2.1 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của glyphosate ............................................ 8 2.2.2. Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate.......................................... 10 2.3. EPSPS và ứng dụng trong tạo cây trồng kháng glyphosate ..................... 13 2.3.1. Cây trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ.............................................. 13 2.3.2 EPSPS ..................................................................................................... 18 2.3.3. Ứng dụng EPSPS trong tạo cây chuyển gen ......................................... 19 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 22 3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 22 3.1.1. Thực vật ................................................................................................. 22 3.1.2. Chủng vi khuẩn ...................................................................................... 22 3.1.3. Các vector .............................................................................................. 22 3.1.4. Hóa chất ................................................................................................. 22 3.1.5. Máy móc và thiết bị ............................................................................... 23 3.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc............... 23 .tumefaciens CV58................... 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv yển gen. ..................................................................... 30 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 34 4.1.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc............... 34 4.1.2. Kết quả chuyển cấu trúc pBI121/EPSPS vào cây thuốc lá ................... 42 4.1.3. Phân tích . ....................................................... 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 49 5.1. Kết luận..................................................................................................... 49 5. 2. Kiến nghị ................................................................................................. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 50 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase bp Cặp bazơ S3P shikimate phosphate-3 ESP 5 enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate cs cộng sự DEPC Diethy pyrocarbonate dNTP Deoxynucleotide Kb Kilo bazơ LB Luria Bertani PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long BAP 6-benzyladenine PVDF Polyvinylidene fluoride WT isopropylthio-β-galactoside RNAi wild type SP signal peptide gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) OD Optical density Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân bố 1 số loại cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 14 2.2 Thống kê cây trồng chuyển gen được chấp nhận tại Mỹ 20 3.1 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn 24 3.2 Thành phần phản ứng lai SP-EPSPS-Cmyc vào vector pBI121 25 3.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 27 3.4 Thành phần phản ứng PCR với pUC18- F và pUC18- R 28 3.5 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 31 3.6 Thành phần chạy phản ứng PCR với EPSPS-F và CYMC-R 32 4.1 Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Sơ đồ vector pBI121 22 4.1 Trình tự đoạn gen EPSPS theo NCBI 34 4.2 Trình tự đoạn gen mã hóa cho protein của EPSPS 35 4.3 Trình tự đoạn SP từ Dã yên thảo 35 4.4 Trình tự cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 36 4.5 Trình tự Protein biểu hiện của EPSPS 37 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pBluescriptII 37 4.7 Kết quả cắt vector pBI121 bằng XbaI/SacI 38 4.8 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang plasmid 39 4.9 Kết quả điện di phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng 40 XbaI/SacI và PCR 4.10 Kết quả PCR pBI121/EPSPS trong A. tumefaciens 42 4.11 Mảnh lá cảm ứng trên môi trường GM sau 2 ngày 43 4.12 Mảnh lá sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày trên môi trường GM 43 4.13 Chồi mọc lên trên môi trường MS + BAP + kanamycin + 44 cefortaxim 4.14 Các chồi tái sinh chuẩn bị chuyển sang môi trường ra rễ 44 4.15 Cây hoàn chỉnh chuẩn bị trồng ngoài môi trường 45 4.16 46 4.17 Kết quả lai Western blot 47 4.18 Kết quả kiểm tra các dòng thuốc lá mang gen EPSPS kháng 48 glyphosate Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cỏ dại luôn là một vấn đề lớn với cây trồng. Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để phát triển mà còn là nơi cư trú cho côn trùng và các loại sâu bệnh gây hại, làm giảm sút chất lượng mùa màng, đem theo hạt giống cỏ dại trộn lẫn với hạt giống cây trồng. Theo phương pháp truyền thống cỏ dại thường được kiểm soát bằng cách: cầy sới, nhổ cỏ, phun thuốc diệt cỏ, hay kết hợp tất cả những tập quán này. Nhưng phương pháp này chỉ áp dụng được trên diện tích rất nhỏ. Biện pháp diệt cỏ hiệu quả cho diện tích canh tác lớn được đưa ra là phun thuốc diệt cỏ một lần trên diện tích lớn. Thuốc diệt cỏ tác động vào một số enzym chủ yếu trong quá trình trao đổi chất của cây, làm rối loạn quá trình tổng hợp hữu cơ của cây và cuối cùng là tiêu diệt cỏ dại. Loại thuốc diệt cỏ hay được sử dụng phổ biến ở Việt Nam là glyphosate và glufosinate. Hai loại thuốc diệt cỏ này rất hữu ích trong việc kiểm soát cỏ dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi và không tổn hại lâu trong môi trường. Chúng có hiệu quả cao nhất và an toàn nhất trong số những hoá chất dùng trong nông nghiệp. Tuy nhiên, hoạt tính tác động lên cỏ dại cũng tác động giống hệt lên cây trồng, kết quả là tiêu diệt cả cỏ dại và cây trồng. EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp các amino acid ng thơm 2 dạng: EPSPS I tồn tại ở thực vật và vi khuẩn, dạng này nó bị ức chế bởi glyphosate. Dạng EPSPS II chỉ có ở một số vi khuẩn như Pseudomonas sp. strain PG2982, Agrobacterium tumefaciens sp. strain CP4 và Staphylococcus aureus… Trong đó EPSPSII từ Agrobacterium tumefaciens sp. strain CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao và đã được nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng. Để giải quyết vấn đề Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 phòng trừ được cỏ dại và đảm bảo được năng suất chất lượng cây trồng, việc chọn tạo được giống cây trồng mang mang gen EPSPS từ A.tumefacien sp. CP4, có khả năng chống chịu được chất diệt cỏ glyphosate là một trong các hướng đi quan tâm nhất hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate.” Đề tài được thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học quốc gia Việt Nam. 1.2. Mục tiêu của đề tài Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Thiết kế vector chuyển gen - Xác định và sửa đổi trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu hiện trong thực vật. - Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate. - Chuyển cấu trúc EPSPS vào vi khuẩn A. tumefaciens CV58 - Biến nạp cấu trúc EPSPS vào cây thuốc lá. - Chọn lọc các dòng thuốc lá chuyển gen. 1.3.3. Phân tích - Kiểm tra cấu trúc gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen - Kiểm tra biểu hiện protein tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển gen - Đánh giá khả năng kháng glyphosate của cây thuốc lá chuyển gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Chất diệt cỏ và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp 2.1.1 Cỏ dại và cách phòng trừ Cỏ dại có rất nhiều loài với nhiều đặc tính rất khác nhau, tuy nhiên chúng vẫn có những đặc điểm giống nhau. Dựa vào những đặc tính này, chúng ta có thể phân loại cỏ dại theo nhiều cách (theo chu kỳ sinh trưởng, theo hình thái, theo đặc điểm thực vật). Phân loại theo chu kỳ sinh trưởng: Theo cách phân loại này ta thấy có hai nhóm cỏ: cỏ hàng năm và cỏ lâu năm. Cỏ hàng năm: là các loại cỏ hoàn thành vòng đời (từ hạt đến nảy mầm ra hoa tạo hạt) trong một hoặc hai mùa canh tác trong một năm. Các loại cỏ này thường chết vào mùa khô sau khi hoàn thành vòng đời của chúng. Cỏ lâu năm: là những loại cỏ sống lâu hơn một năm. Loại cỏ này rất khó diệt vì có thân ngầm hoặc thân bò trên mặt đất, có bộ rễ, củ phát triển sâu, khả năng sinh sản vô tính mạnh. Phân loại theo hình thái: Theo kiểu phân loại hình thái, ta có cỏ lá hẹp (còn gọi là cỏ một lá mầm) và cỏ lá rộng (còn gọi là cỏ hai lá mầm). Cỏ một lá mầm có những đặc tính chung như: lá hẹp, dày, mọc xiên, mặt lá có lông, rễ thường là rễ chùm, ăn nông, đỉnh sinh trưởng được bọc kín trong bẹ lá. Tuy nhiên, trong nhóm này cũng có một số loại cỏ có đặc tính hơi khác như cỏ cói lác lá hẹp nhưng mềm, mỏng và trơn. Cỏ hai lá mầm thường có lá rộng, nằm ngang, mỏng và mềm; rễ thường là rễ cọc, ăn sâu, đỉnh sinh trưởng để lộ ra ngoài. Phân loại theo đặc điểm thực vật: Nhóm cỏ hoà bản: cỏ có bản lá hẹp, dài, gân phụ song song với gân chính chạy dài từ đầu lá tới cổ lá. Thân: thường tròn và bọng ruột, lá mọc cách, đính trên thân theo hai hàng. Rễ: thường là rễ chùm, ăn nông. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 Nhóm cỏ chác lác: lá hẹp nhưng ngắn hơn cỏ hoà bản, thân thường đặc ruột có góc cạnh tam giác, lá đính trên thân theo ba hàng kiểu xoắn ốc. Nhóm cỏ lá rộng: lá rộng, nằm ngang, mọc đối, mặt lá ít lông, gân lá sắp xếp theo nhiều kiểu hình khác nhau. Cỏ dại từ xưa tới nay đều là vấn đề nhức nhối trong canh tác nông nghiệp. Cỏ dại làm giảm năng suất và phẩm chất của cây trồng: do có bộ rễ phát triển rất mạnh, phần lớn được phân bố ở lớp đất mặt nên dễ dàng cạnh tranh với cây trồng về dinh dưỡng, ánh sáng và nước làm cho cây trồng không đủ điều kiện sinh sống nên sinh trưởng và phát triển kém, cho năng suất thấp, phẩm chất nông sản giảm. Cỏ dại là ký chủ của sâu bệnh: Các cây cỏ dại cùng họ có những đặc điểm giống cây trồng là những ký chủ phụ rất tốt cho sâu bệnh. Cỏ dại làm tăng chi phí sản xuất: như tốn công làm cỏ, diệt cỏ bằng hoá chất … Người nông dân có thể phòng trừ cỏ dại bằng một số phương pháp Biện pháp phòng: Không để cỏ tạo hạt trên ruộng, sử dụng giống không lẩn hạt cỏ, vệ sinh nông cụ sạch cỏ trước khi sử dụng, dùng phân hữu cơ đã hoai ủ, dùng lưới chắn hạt cỏ khi cho nước vào ruộng… Biện pháp trừ: có thể nhổ cỏ bằng tay, làm đất, sử dụng nước thích hợp vào dùng thuốc hoá học. Hiện nay, việc sử dụng thuốc hoá học để diệt trừ cỏ được coi là biện pháp hữu hiệu nhất vì nó tiết kiệm được công lao động, có thể sử dụng nhanh chóng trên diện rộng và được sử dụng ở nhiều thời điểm khác nhau, không cực nhọc, vất vả như các biệp pháp làm cỏ khác. 2.1.2. Các loại thuốc diệt cỏ đang sử dụng Thuốc diệt cỏ tuỳ theo loại khác nhau có thể tác động đến cỏ dại theo nhiều cách khác nhau. Người ta phân loại theo kiểu tác dộng của thuốc trừ cỏ như: Thuốc diệt cỏ có tác động chọn lọc và thuốc diệt cỏ có tác động không chọn lọc: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 Thuốc diệt cỏ có tác động chọn lọc có nghĩa là thuốc diệt cỏ khi sử dụng đúng theo khuyến cáo sẽ chỉ diệt trừ cỏ dại mà không gây hại cho cây trồng. Thuốc diệt cỏ có tác động không chọn lọc được sử dụng ở nơi không trồng trọt, những thuốc này gây hại cho mọi loài thực vật có mặt ở nơi phun thuốc và thuốc tiếp xúc với thuốc. Thuốc diệt cỏ tiếp xúc và thuốc diệt cỏ nội hấp: Thuốc diệt cỏ tiếp xúc chỉ gây hại cho các bộ phận của cây tiếp xúc với thuốc. Thuốc chỉ có tác dụng với cỏ hàng năm, không có thân ngầm trong đất. Ví dụ các thuốc trừ cỏ Propanil, Gramoxone… Thuốc diệt cỏ nội hấp (lưu dẫn) có thể dùng bón, tưới vào đất hoặc phun lên lá. Sau khi xâm nhập vào lá, rễ thuốc dịch chuyển đến khắp các bộ phận trong thực vật, thuốc được dùng để trừ cỏ hàng niên và lưu niên. Thuốc diệt cỏ phun lên lá và thuốc diệt cỏ phun hoặc bón, tưới vào đất: Thuốc diệt cỏ phun lên lá là những thuốc trừ cỏ chỉ có thể xâm nhập vào lá cỏ để gây hại cho cỏ (thuốc này không có khả năng xâm nhập vào rễ cỏ). Những thuốc này được dùng phun vào lúc cỏ đã mọc, còn non. Ví dụ thuốc trừ cỏ Onecide, Propanil… Những thuốc diệt cỏ phun hoặc bón vào đất chỉ có thể xâm nhập vào bên trong cỏ dại qua mầm hoặc bộ rễ của cỏ. Những thuốc này có loại được dùng phun trên đất mới cày bừa xong hoặc vừa gieo xong, khi cỏ còn chưa xuất hiện trên mặt ruộng. Ví dụ: thuốc trừ cỏ Sirius. Ngoài ra còn có những loại thuốc diệt cỏ vừa có khả năng xâm nhập vào lá, vừa xâm nhập vào rễ cỏ. Những thuốc này có thể dùng phun lên ruộng khi cỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 sắp mọc hoặc cỏ mới mọc (mới ra 1-3 lá). Ví dụ; các thuốc trừ cỏ Afalon, Ronstar v.v… Thuốc diệt cỏ tiền nảy mầm và hậu nảy mầm: Thuốc diệt cỏ tiền nảy mầm là loại thuốc diệt cỏ được dùng sớm, ngay sau khi gieo, khi cỏ chưa mọc trên ruộng. Ví dụ thuốc trừ cỏ Simazine, Sofit. Thuốc diệt cỏ hậu nảy mầm là loại thuốc được dùng muộn hơn, khi cỏ đã mọc, ở giai đoạn non. Ví dụ các thuốc trừ cỏ Afalon, Whip S, Oneside, … Thuốc diệt cỏ hoà bản và thuốc diệt cỏ lá rộng: Thuốc diệt cỏ hoà bản chỉ có tác dụng diệt những cỏ họ hoà bản (lá hẹp, gân lá, song song như cỏ lồng vực, cỏ mần trầu, …). Thuốc diệt cỏ lá rộng là thuốc chỉ có tác dụng diệt được cỏ lá rộng bản, gân lá hình chân vịt như cỏ dền gai, rau sam, ... Hầu hết những thuốc diệt cỏ đang được sử dụng ở nước ta đều là những hợp chất hữu cơ tổng hợp. Những thuốc diệt cỏ thông dụng trong sản xuất nông nghiệp hiện nay thường ít độc hơn với người và gia súc so với thuốc trừ sâu, thuốc trừ bệnh. Tuy nhiên không ngoại trừ có một số ít thuốc diệt cỏ có độ độc thấp như thuốc Paraquat. Một số loại thuốc trừ cỏ hay được sử dụng: Duall 720ND: là loại thuốc trừ cỏ miễn mọc mầm, có thể áp dụng cho tất cả các loại cây màu trồng từ hạt và hom như lạc, đậu nành, đậu xanh, ngô, các loại rau, khoai lang, bông vải. Duall 720EC diệt trừ hữu hiệu nhiều loại cỏ thuộc cả ba nhóm cỏ hòa thảo, cói lác và cỏ lá rộng như cỏ lồng vực, cỏ cháo, cỏ đuôi phụng, rau mương.... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 Glyphosate 48CS: Trên thị trường có nhiều tên thương mại khác nhau như Carphosate, Nufarm, Lyphoxym, Herosate... Đây là loại thuốc diệt cỏ không chọn lọc dùng để diệt cỏ cho các loại cây trồng không làm đất (thường ở Đồng bằng sông Cửu Long) như đậu nành, đậu xanh, ngô. Thuốc được dùng trước khi xuống giống 7-10 ngày để diệt những cây cỏ đã mọc sẵn trên ruộng, glyphosate diệt được hầu hết các loại cỏ trên ruộng, kể cả những loại cỏ khó diệt như cỏ cú, cỏ chỉ, cỏ lông tây, cỏ tranh, lúa mọc lẫn trên ruộng màu... Thuốc này cũng có thể dùng để diệt cho các loại cây trồng theo hàng có khoảng cách rộng như dưa hấu, bắp, mía, nhưng chú ý là dùng tấm cao su che cây trồng lại. Nabu 12,5EC: là loại thuốc diệt cỏ hậu mọc mầm, dùng để diệt cỏ cho những cây trồng cạn hai lá mầm như những cây họ đậu, bông vải; không dùng cho bắp. Nabu có tính nội hấp cao, có thể diệt trừ những loài cỏ hòa thảo trên ruộng cây trồng cạn, kể cả lúa non mọc lẫn trên ruộng. Thời gian phun thuốc là từ 10 đến 15 ngày sau khi gieo trồng, khi cỏ có từ 2 đến 4 lá. Whips 7.5EW: là loại thuốc đặc hiệu để trừ các loài cỏ thuộc nhóm hòa thảo như cỏ lồng vực, cỏ đuôi phụng, cỏ gà,... không có tác dụng đối với những loài cỏ thuộc nhóm lá rộng và nhóm cỏ cói lác. Whips 7.5EC trừ cỏ trên ruộng lúa cũng tốt nhưng cần chú ý tuân thủ về liều lượng, thời gian áp dụng và chế độ nước. Trên cây hoa màu, thuốc Whips dùng để trừ cỏ, các cây 2 lá mầm như những cây họ Đậu. Thuốc 2,4D: có tác dụng rất tốt đối với các loài cỏ thuộc nhóm cỏ lác và cỏ lá rộng, giá thành rất rẻ so với hai loại thuốc khác trên cùng đơn vị diện tích. Thuốc dùng để diệt cỏ cho những cây trồng một lá mầm như bắp, mía, nhưng không dùng được cho các cây họ Đậu, cây 2 lá mầm. Với sự ra đời của nhiều thế hệ thuốc trừ cỏ từ tiền nảy mầm đến thuốc trừ cỏ hậu nảy mầm đã tạo bước đột phá làm giảm chi phí sản xuất và cho phép nông dân canh tác với diện tích lớn Thuốc cỏ chọn lọc có loại tiền nảy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 mầm phun trước hay ngay khi xuống giống nhằm diệt các hạt cỏ dại nhưng không diệt hạt giống cây trồng. Ngược lại thuốc cỏ hậu nảy mầm diệt cỏ dại đã lớn nhưng không diệt cây trồng. Các loại thuốc trừ cỏ hiện nay có nhược điểm khi sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tránh gây thiệt hại đến cây trồng, nó chỉ hiệu quả đối với một số loại cỏ nhất định, có loại chỉ diệt cỏ lá rộng không diệt cỏ lá hẹp và ngược lại. Ngay đối với họ hòa bản, các loại thuốc trừ cỏ loại này phải chừa cây lúa ra. Việc sử dụng thuốc cỏ chọn lọc gặp trở ngại hiệu quả không cao, phun nhiều lần, kết hợp nhiều loại thuốc trừ cỏ khác nhau và đôi khi ảnh hưởng dưới cây trồng. Các loại thuốc diệt cỏ phổ rộng, có thể sử dụng để tiêu diệt được nhiều loại cỏ được phát triển, có thể kiểm soát cỏ dại một cách hiệu quả và do vậy tăng năng suất cây trồng, linh hoạt - có thể kiểm soát cỏ dại sau khi cây trồng phát triển, giảm số lần phun thuốc diệt cỏ sử dụng trong vụ gieo trồng, giảm nhiên liệu cần sử dụng (vì cần phun thuốc ít hơn). Sử dụng các thành phần độc tố thấp và không để lại chất kích hoạt trong đất. Không cần sử dụng các hệ thống làm đất (cày bừa) hay cách làm đất truyền thống, có lợi cho cấu trúc đất trồng và các vi sinh vật trong đất. 2.2. Chất diệt cỏ glyphosate 2.2.1 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của glyphosate Glyphosate (N - (phosphonomethyl) glycin) là thuốc diệt cỏ phổ rộng hệ thống sử dụng để diệt cỏ dại, đặc biệt là các loại cỏ lá rộng hàng năm và cỏ để cạnh tranh với các cây trồng thương mại phát triển trên toàn cầu. Thuốc diệt cỏ glyphosate được phát hiện là một loại thuốc diệt cỏ bởi nhà hóa học E. John Franz vào năm 1970, trong khi làm việc cho công ty Monsanto. Franz nhận được huân chương công nghệ quốc gia vào năm 1987 và huy chương Perkin về hóa học ứng dụng vào năm 1990 cho khám phá của ông. Monsanto đưa thuốc diệt cỏ glyphosate ra thị trường vào những năm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 9 1970 dưới tên thương mại Roundup, công ty Monsanto của Mỹ được cấp bằng sáng chế có thời hạn tới năm 2000 về việc sử dụng Roundup vào mục đích thương mại [26, 36]. Công thức phân tử của glyphosate: C 3 H 8 NO P 5 Glyphosate là một chất tương tự aminophosphonic của amino acid tự nhiên: glycine. Phương thức hoạt động: ức chế một enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp các amino acid thơm: tyrosine, tryptophan và phenylalanine. Cơ chế hoạt động này chỉ có tác dụng khi cây cỏ phát triển, không có tác dụng sử dụng trước hoặc sau khi cỏ dại xuất hiện [39]. Glyphosate tiêu diệt cỏ dại nhờ enzyme ức chế 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), xúc tác phản ứng của shikimate phosphate-3 (S3P) và phosphoenolpyruvate để tạo thành 5 enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate (ESP). ESP sau đó hình thành dephosphorylated chorismate, một tiền chất cần thiết cho các amino acid. Các amino acid được sử dụng trong tổng hợp protein và để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp như folate, ubiquinones và naphthoquinone [39]. Nghiên cứu tinh thể của glyphosate và EPSPS cho thấy glyphosate hoạt động bằng cách chiếm các vị trí liên kết của phosphoenolpyruvate, tương tự một trạng thái trung gian của các cơ chất enzyme ternary phức tạp [36]. Enzyme ức chế glyphosate EPSPS, chỉ được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. EPSPS không tìm thấy ở động vật có vú, mà thay vào đó ở các loài này sản sinh các amino acid thơm từ chế độ ăn uống của chúng [32, 39]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 Glyphosate cũng đã được chứng minh là gây ức chế các enzyme thực vật khác, và cũng đã được tìm thấy gây ảnh hưởng đến các enzyme động vật. Glyphosate được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ (EPA) xếp loại Độc tính cấp III (bao gồm cấp I đến IV, cấp IV là ít nguy hiểm nhất) qua tiếp xúc với miệng và hô hấp. Do đó, giống như với các thuốc diệt cỏ khác, EPA yêu cầu các sản phẩm có chứa glyphosate trên thị trường phải có một nhãn cảnh báo mức độ độc tính và trang bị quần áo bảo hộ tới người sử dụng. Glyphosate không tích tụ lâu dài mà bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường. 2.2.2. Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate Glyphosate được các chuyên gia gọi là chất diệt cỏ “gần như lý tưởng”, do phổ rộng và có độc tính thấp so với các thuốc diệt cỏ khác, glyphosate đã nhanh chóng được nông dân đưa vào sử dụng rộng rãi. Thuốc diệt cỏ glyphosate được sử dụng nhiều hơn khi Monsanto giới thiệu cây trồng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate, tạo điều kiện cho nông dân tiêu diệt cỏ dại mà không giết chết cây trồng của họ. Trong năm 2007, thuốc diệt cỏ glyphosate được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực nông nghiệp Mỹ, với 180 đến 185 triệu bảng (82.000 đến 84.000 tấn) được sử dụng [26]. Trong khi glyphosate đã được sự chấp thuận của cơ quan quản lý trên toàn thế giới và được sử dụng rộng rãi, những lo ngại về ảnh hưởng của nó đối với con người và môi trường vẫn tồn tại. Glyphosate là thuốc diệt cỏ có khả năng giết chết nhiều loại thực vật, bao gồm các loại cỏ, cây lá rộng và cây thân gỗ. Tuy nhiên, glyphosate lại có tác dụng tương đối yếu trên một số loài cỏ ba lá [26]. Tính theo khối lượng, nó là một trong các loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất. Nó thường được sử dụng cho mục đích nông nghiệp, làm vườn và lâm nghiệp (bao gồm cả quy mô gia đình sử dụng). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 Ở nhiều thành phố, glyphosate được rải dọc theo các vỉa hè và đường phố, cũng như các đường nứt ở giữa vỉa hè nơi cỏ dại thường mọc, để ngăn chặn tối đa việc cỏ dại hay các loại thực vật có thể hình thành tại đây, tiết kiệm chi phí thuê nhân công xử lý. Sử dụng cây trồng chuyển gen nói chung và cây trồng chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate nói riêng cũng kèm theo đó một vài tác động tiêu cực. Tuy nhiên hiện nay, khi áp dụng phương pháp kiểm soát cỏ dại này, những lợi ích mang lại lớn hơn rất nhiều so với tác động tiêu cực. Đầu tiên phải kể đến tác động tích cực trong việc hạn chế các loại thuốc diệt cỏ trên diện tích sử dụng, thay vì dùng nhiều loại thuốc cho nhiều loại cỏ, kết hợp với cây trồng GR (kháng thuốc diệt cỏ glyphosate) thì chỉ cần dùng đơn thuần glyphosate. Loại bỏ được rất nhiều loại thuốc diệt cỏ ảnh hưởng mạnh tới môi trường. Glyphosate cũng là một loại hóa chất độc hại mặc dù độc tính thấp hơn so với aspirin, một số thành phần trong công thức của thuốc diệt cỏ glyphosate có mức độ độc tính đối với sinh vật là cao hơn bản thân glyphosate. Khi sử dụng glyphosate và cây trồng GR thì khả năng phải sử dụng thêm các loại thuốc trừ sâu là ít hơn hẳn [26]. Trong điều kiện bề mặt và nước ngầm bị ô nhiễm, thuốc diệt cỏ glyphosate tốt hơn hầu hết các chất diệt cỏ mà nó thay thế. Mặc dù các loại thuốc diệt cỏ đều hạn chế sử dụng trong điều kiện ngập nước, mưa ướt. Tuy nhiên, glyphosate không di chuyển được trong đất vì sự thấm hút bề mặt mạnh mẽ của các khoáng sản hữu cơ trong đất, làm glyphosate tan rã ra nhanh hơn so với hầu hết các chất diệt cỏ mà nó thay thế. Nhiên liệu sử dụng để quản lý cỏ dại được tiết kiệm đáng kể khi sử dụng cây trồng GR [39]. Bennett đã ước tính rằng sẽ tiết kiệm được 50% nhiên liệu hoá thạch trong việc trồng củ cải đường ở châu Âu bằng cách chuyển đổi sang cây trồng GR [26]. Nghiên cứu của Brookes và Barfoot cũng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 12 thấy rằng cây trồng GR sử dụng trong năm 2005 giảm lượng khí thải carbon trên toàn thế giới tương đương với việc loại bỏ 4 triệu xe ô tô gia đình [36]. Thiệt hại lớn nhất do glyphosate mang lại là sự thiệt hại về độ màu mỡ của đất. Đất được xử lý cỏ dại bằng glyphosate và cây trồng GR làm cho khả năng canh tác của đất giảm xuống đáng kể, đặc biệt là đậu tương và bông. Hiện nay người ta e ngại rằng cây trồng GR có thể nảy sinh ra những vấn đề về cỏ dại, các cây trồng GR sẽ trở thành một loại cỏ dại hoặc gen GR thất thoát, hòa nhập với các loài bản địa, tạo ra sự lai giống có tác dụng không mong muốn trong nông nghiệp hoặc môi trường. Tuy nhiên các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, gen kháng glyphosate không có lợi thế khi không tiến hành phun glyphosate, vì vậy khả năng chuyển gen kháng glyphosate vào tự nhiên là khó xảy ra. Một vấn đề cần lưu ý nữa là việc kiểm soát mức độ gen chuyển của cây trồng chuyển gen GR, cần phải duy trì sự hiện diện của gen chuyển tại một giới hạn quy định của thị trường, có thị trường đòi hỏi giới hạn chuyển gen thấp hoặc không chấp nhận sử dụng cây trồng chuyển gen. Để kiểm soát được vấn đề này cần kiểm soát được sự thụ phấn chéo, đối với cây trồng tự thụ như đậu tương, sự thụ phấn chéo xảy ra ít, tuy nhiên với ngô, củ cải đường và cải dầu. Chỉ cần một mức độ nhỏ cũng có thể xảy ra việc lạc dòng gen. Một thử nghiệm trên cỏ Agrostis stolonifera L ở Oregon [26] sau ba năm trồng thử nghiệm, khoảng 62% cỏ Agrostis stolonifera hoang dã trong vùng phụ cận sở hữu đặc điểm GR, chỉ ra rằng lạc dòng gen một khi xảy ra, nó có thể là rất khó khăn hoặc không thể loại bỏ từ quần thể hoang dã. Một mối quan tâm lớn hơn là khả năng lạc dòng gen từ cây trồng GR cho thân cỏ. Mặc dù gen GR không có lợi thế trong các hệ sinh thái tự nhiên, nơi glyphosate không được sử dụng, khi kết hợp với việc truyền đạt các đặc tính gen chuyển sẽ cải thiện trong một hệ sinh thái tự nhiên (ví dụ, kháng côn trùng hoặc kháng hạn), đặc điểm GR sẽ cải thiện khả năng chuyển gen của một gen vào loài tiếp nhận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/