Tài liệu Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút prrs trong tế bào thực vật

Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- Lê Thi ̣ Thanh THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 1 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- Lê Thi ̣ Thanh THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Tường Vân PGS. TS. Võ Thị Thương Lan Hà Nội – 2013 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 2 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987. Sau đó xuất hiện ở nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)…. Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới. Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn. Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trƣờng. Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ đƣợc thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát đƣơ ̣c và lây lan ngày càng rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam. Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn đƣợc sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y. Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu. Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, còn vắcxin nhƣợc độc ta ̣o ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại. Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 3 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm PRRSV dạng này nhƣng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút. Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắ cxin ăn đƣ ợc (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại. Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn. So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ; an toàn; đặc biệt vắcxin ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, đƣợc tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định thƣ giữa hai nƣớc Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 4 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS) 1.1.1. Giới thiệu chung Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mầm bệnh khác do đó làm ốm và chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59]. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa [61]. Bệnh đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ở châu Âu vào những năm 1990, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu. Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59]. Thời gian đầu do chƣa xác định đƣợc nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác nhau [59, 60]:  Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS)  Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED)  Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS)  Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS) Năm 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã nhất trí đă ̣t tên cho căn bê ̣nh này là “H ội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7]. Kể từ đó, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 5 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ. Đến nay, bệnh đã bùng phát và lây lan khắp các tỉnh thành trên cả nƣớc [28]. 1.1.2. Triệu chứng bệnh Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các lứa tuổi và thƣờng biểu hiện ở hai trạng thái: sinh sản và hô hấp [28, 61, 62]:  Rối loạn sinh sản: tăng số lƣợng lợn con sinh ra bi ̣ch ết hoặc chết trong bào thai (25-35%), lợn con sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa ở lợn nái nuôi con làm tăng thêm tỉ lê ̣ lợn con chết trƣớc cai sữa.  Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi rất nặng. 1.2. VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập đƣợc vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau đó là Mỹ, Đức [59, 61]. Đến nay, các thông tin về loại vi rút này đã đƣợc nghiên cứu khá rõ. Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuô ̣c chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có genom là ARN sợi đơn dƣơng [18]. 1.2.1. Đặc điểm hình thái PRRSV là vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đƣờng kính virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đƣờng kính từ 30 – 35 nm. Đồng thời, PRRSV là vi rút ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, mang những đặc điểm chung của chi Arterivirus [18, 60, 61]. Hình 1.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi rút PRRS gây bê ̣nh lơ ̣n tai xanh [61]. 1.2.2. Cấu trúc di truyền Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 6 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn dƣơng, có kích thƣớc khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7. Trong đó ORF1a và 1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc nhƣ replicase, polymerase tham gia vào quá trình nhân bản của vi rút. Các ORF 2-7 mã hóa cho 6 protein cấu trúc bao gồm 4 phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phân tử protein mạng lƣới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1.2). Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]. Dựa vào phân tích cấu trúc gen ngƣời ta xác tính đƣợc 2 nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là vi rút Lelystad) gồm 4 phân nhóm (subtype) đã đƣợc xác định. Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62]. Gần đây, một biến thể của nhóm II có độc lực cao hơn đã xuất hiện gây nhiều tổn thất ở châu Á [28, 61]. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhƣng các nghiên cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn về bộ gen (mức độ tƣơng đồng chỉ 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng nhƣ độc lực vi rút [7, 42]. Điều này có nghĩa là vắcxin đƣợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 7 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ngƣời ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 nhóm phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axít amin của các khung đọc mở (ORFs).Tƣơng đồng về trình tự axít amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) [7, 54]. Phân tích trình tự cho thấy các vi rút đang tiến hoá. Giải trình tự một phần hoặc từng gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng và cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá của các chủng vi rút là do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong các gen. Ví dụ gen m có độ dài 522 bp ở nhóm LV và 525 bp ở nhóm VR-2332 [9, 54]. Ngoài ra, trong một nhóm PRRSV cũng có sự khác nhau giữa các phân nhóm. Ví dụ: Tổng độ dài hệ gen của chủng vi rút nhóm VR-2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) là 15451 bp, trong đó phần mã hoá cho 7 khung đọc mở là 15071 bp. Trong khi hệ gen của vi rút PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm PRRS mới phân lập gần đây có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc nhóm VR-232 lại có độ dài là 15353 bp, trong đó phần mã hoá cho 7 khung đọc mở là 14981 bp [26, 28, 54]. Về mặt độc lực, vi rút gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRSV tồn tại dƣới 2 dạng: dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn và dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm và chết nhiều lợn [54]. 1.2.3. Cơ chế phát sinh bệnh Đến nay cơ chế gây bệnh của PRRSV vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ ràng. Các nghiên cứu chỉ thấy rằng vi rút PRRSV có ái lực đặc biệt với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phổi, gây tổn thƣơng đáp ứng miễn dịch tế bào, phá hủy các bề mặt màng nhày [54, 60]. Sau khi xâm nhập, vi rút sẽ sao chép bên trong đại thực bào phổi và các mô lympho để tạo ra nhiều vi rút mới, đồng thời phá vỡ các tế bào đóng vai trò gây đáp ứng miễn dịch này. Các vi rút mới tồn tại lâu dài ở đại thực bào phổi và đại thực bào amiđan. Kháng nguyên PRRSV có thể đƣợc phát hiện ở các đại Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 8 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm thực bào của các mô, tế bào khác bao gồm cả mô cơ [54, 60]. Hình 1.3 cho thấy sự thay đổi hình thái của đại thực bào trƣớc và sau khi nhiễm PRRSV. A B Hình 1.3: Hình thái của đại thực bào khi bị nhiễm PRRSV. A: đại thực bào bình thƣờng; B: đại thực bào bị phá hủy [54]. Một khi hơn 40% đại thực bào bị phá hủy, PRRSV hầu nhƣ đã loại bỏ hệ thống bảo vệ của cơ thể [54]. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho những vi khuẩn và vi rút khác gây bệnh. Điển hình của trƣờng hợp này là sự gia tăng nghiêm trọng viêm phổi. Ngoài ra, lợn mắc bệnh PRRS thƣờng bị bội nhiễm với các bệnh nhƣ dịch tả lợn, tụ huyết trùng, phó thƣơng hàn, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Steptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli .... Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân chính gây chết nhiều ở lợn mắc bệnh PRRS [7, 18, 54]. 1.2.4. Đặc tính sinh miễn dịch Trong những nghiên cứu phát triển vắcxin chống lại PRRSV đã đƣợc ghi nhận trong hai thập kỷ qua, việc thiết kế vắcxin tiểu đơn vị, việc tạo ra đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể là đặc biệt quan tro ̣ng vì c ả hai cơ chế này đều liên quan đến việc bảo vệ chống lại vi rút. Trong quá trình lây nhiễm, lợn thƣờng sản xuất kháng thể đặc hiệu đối với protein N. Mặc dù protein N là protein cấu trúc phổ biến nhất và có tính kháng nguyên cao , nhƣng mố i liên quan giƣ̃a kháng th ể kháng protein này với đáp ứng miễn dịch bảo vệ lại không chă ̣t chẽ . Vì thế protein N chỉ dùng để chuẩn đoán sƣ̣ có mă ̣t của PRRSV mà không dùng làmắcxin v tiểu đơn vị [15]. Trong thành phần cấu tạo của vi rút PRRS, cả 6 phân tử protein cấu trúc đều có khả năng trung hoà kháng thể (bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 9 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm màng (M) và 1 protein vỏ nhân virut (N)) nhƣng hoạt động trung hoà chỉ xảy ra mạnh với các protein GP5, M và GP3 [18, 19, 23, 26, 54]. Do vậy, các protein này thƣờng đƣơ ̣c dùng nhƣ mục tiêu hàng đầu để thiết kế vắcxin tiể u đơn vi ̣chố ng lại sƣ̣ xâm nhiễ m của PRRSV . GP5 đƣơ ̣c biế t nhƣ yế u tố kích thích vi ệc sản sinh kháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể [19, 23, 39]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cho thấy GP5 luôn luôn liêt kết với protein mạng lƣới M [32, 34, 55]. Bên ca ̣nh đó , ngƣời ta cũng tim ̀ thấ y glycoprotein vỏ GP 3 trong các mảnh vỡ cũng nhƣ các tế bào bị nhiễm vi rút , loại protein này cũng kić h thić h sinh ra kháng thể trung hòa ở mức cao [54]. 1.3. TÌNH HÌNH BỆNH LỢN TAI XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.3.1. Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới Mặc dù giữa những năm 1980 đã có những báo cáo về bệnh song vẫn chƣa xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh. Năm 1987 bệnh đƣợc ghi nhận ở Mỹ với những triệu chứng lâm sàng về sinh sản kết hợp với hô hấp. Năm 1990 hội chứng tƣơng tự đã xuất hiện tại châu Âu, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu [61, 62]. Đến năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn về kinh tế cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới [61, 62]. Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh lợn tai xanh lƣu hành [59, 62]. Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [59]. Ở Mỹ, ngƣời ta đã đánh giá thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn. Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 10 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm trƣờng [59, 62]. Ở Đức, trong năm đầu tiên của dịch bệnh khoảng 2 triệu lợn đã bị chết [59, 62]. Các nƣớc ở châu Á có tỷ lệ bệnh lợn tai xanh lƣu hành rất cao, ví dụ: ở Trung Quốc là 80%, Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94% và Hàn Quốc là 67,4% - 73,1% [59]. Tại Trung Quốc, theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007 cho thấy kể từ năm 2006, đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yếu là vi rút PRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy [28]. Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng vi rút PRRS gây bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của vi rút (thiếu hụt 30 axít amin trong gen vùng NSP2) [28]. Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan [28]. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch lợn tai xanh, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vắc xin đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [28, 34]. Tại Hồng Kông và Đài Loan cũng đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lợn ở Hồng Kông đã phát hiện nhiễm cả hai chủng nêu trên [28]. Dịch lợn tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 – 2007 [59]. Các báo cáo cho thấy vi rút gây bệnh lợn tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó số vi rút thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, các vi rút thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58% [59]. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành vi rút gây bệnh lợn tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ là những chủng vi rút cổ điển độc lực thấp [26, 28]. Tháng 9/2007, Nga đã báo cáo chính thức có dịch lợn tai xanh do chủng vi rút PRRS thể độc lực cao gây ra [59]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 11 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là một trong những nguyên nhân chính gây ra nhiều tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn của nhiều quốc gia trên thế giới. 1.3.2. Tình hình bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay sau đó [28]. Tuy nhiên từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nƣớc trong khu vực [59, 62]. Từ tháng 3/2007, bệnh xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phƣơng, gây tổn thất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi, cụ thể nhƣ sau:  Năm 2007: dịch đã xuất hiện tại 324 xã, thuộc 65 huyện của 18 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số lợn chết và phải tiêu huỷ là 20.366 con [1].  Năm 2008: dịch xuất hiện tại 956 xã, phƣờng, thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con [2].  Năm 2009: dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố: Bến Tre, Bình Dƣơng, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hƣng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ [3].  Năm 2010: dịch đã xuất hiện tại 1.978 xã, phƣờng, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con [4]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 12 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm  Năm 2011: dịch lợn tai xanh xảy ra hai đợt, tuy nhiên số ổ dịch cũng nhƣ số lợn mắc bệnh, số lợn bị tiêu hủy giảm rất nhiều (gần 20 lần cả về phạm vi, quy mô dịch và số lƣợng gia súc phải tiêu hủy) so với năm 2010 [5]. Cụ thể: + Đợt 1: Tổng số lợn mắc bệnh là 14.759 con trong đó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong đó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn thịt và 7.581 con lợn con [5]. + Đợt 2: Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con trên tổng đàn 46.328 con của các tỉnh có dịch; tổng số lợn phải tiêu hủy là 12.361con [5].  Năm 2012: dịch xảy ra tại 453 xã/phƣờng, thị trấn của 95 quận/huyện thuộc 28 tỉnh. Tổng số lợn mắc bệnh là 90.688, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761 con [6]. Bảng 1.1. Thống kế tình hình dịch lợn tai xanh tại Việt Nam năm 2007–2012 [1, 2, 3, 4, 5, 6] Năm Số tỉnh có dịch Số huyện có dịch Số xã, phường có dịch Số lợn mắc bệnh Số lợn chết, tiêu hủy Năm 2007 18 65 324 70.577 20.366 Năm 2008 26 103 956 309.586 300.906 Năm 2009 13 26 69 7.030 5.847 Năm 2010 49 286 1.978 812.947 442.699 Năm 2011 15 49 264 42.317 26.519 Năm 2012 28 95 453 90.688 51.761 Kết quả phân tích cấu trúc gen của vi rút PRRS gây bệnh tại Việt Nam cho thấy các vi rút này thuộc chủng Bắc Mỹ [28], trong đó tất cả các mẫu vi rút đều có mức tƣơng đồng cao so với vi rút PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc ( 9999,7%) [18, 28]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 13 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Từ những thông tin nêu trên có thể thấy rằng những thiệt hại mà Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn gây ra là vô cùng to lớn. Bệnh không chỉ gây thiệt hại nặng nề về kinh tế mà qua thực tiễn ở Việt Nam cho thấy nó còn để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng khác về môi trƣờng và an sinh xã hội, nhất là đối với các vùng nông thôn, nơi ngƣời dân phải sống chủ yếu dựa vào chăn nuôi lợn. 1.4. PHÕNG CHỐNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH LỢN TAI XANH Trƣớc những diễn biến phức tạp và thiệt hại to lớn mà Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp đã gây ra trên đàn lợn của nhiều quốc gia trên thế giới, cho đến nay nhiều vấn đề liên quan đến dịch bệnh này đã đƣợc nghiên cứu và dần sáng tỏ. Đặc biệt là các vấn đề về nguyên nhân, cơ chế gây bệnh, triệu chứng, bệnh tích và các phƣơng pháp chẩn đoán, phòng ngừa dịch bệnh. Các biện pháp khống chế bệnh đã đƣợc áp dụng ở nhiều nƣớc nhƣng vẫn chƣa đem lại hiệu quả nhƣ mong muốn. Một số nƣớc phát triển có ngành chăn nuôi lợn công nghiệp với quy mô lớn, áp dụng kỹ thuật tiên tiến kiểm soát chặt chẽ con giống và có chƣơng trình khống chế để thanh toán bệnh lợn tai xanh, kết quả là đã hạn chế đƣợc thiệt hại sau hàng thập kỷ, nhƣng bệnh vẫn tồn tại và lƣu hành trong các đàn lợn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế [54]. Hiện nay vẫn chƣa có thuốc đặc trị bệnh lợn tai xanh, mà để hạn chế thiệt hại do bệnh thƣờng sử dụng một số thuốc kháng sinh nhƣ: Tylosin, Enrofloxacine... nhằm điều trị các bệnh kế phát và tăng cƣờng sức đề kháng cho lợn bằng các loại thuốc trợ lực (B.comlex, vitamin...) kết hợp các thuốc điều trị triệu chứng nhƣ: hạ sốt, chống ỉa chảy, ho, viêm phổi... [61]. Tuy nhiên hiệu quả đạt đƣợc không cao. Do đó, phƣơng pháp phòng bệnh đƣợc đặt lên hàng đầu. Để phòng chống bệnh lợn tai xanh độc lực cao, biện pháp vẫn đƣợc sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y. Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu. Vắcxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, còn vắcxin nhƣợc độc ta ̣o ra m ức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại [18, 21, 24, 38]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 14 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống PRRSV dạng này nhƣng với giá thành khá cao (40.000 đồng/liều) mà hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút [18]. Cho đến nay, thế giới duy nhất có Trung Quốc sản xuất đƣợc vắcxin chống vi rút PRRS độc lực cao [18], tuy nhiên họ vẫn chƣa có giấy phép để xuất khẩu loại vắ cxin trên. 1.5. VẮCXIN THỰC VẬT –THẾ HỆ VẮCXIN MỚI 1.5.1. Ƣu điểm của vắcxin thực vật Việc sản xuất protein tái tổ hợp trên quy mô lớn dựa trên những ứng dụng của công nghệ sinh học đã tạo nên cuộc cách mạng trong việc phòng và chống bệnh trên ngƣời và động vật. Một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả và rẻ tiền vẫn đang là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu và sản xuất. Hệ thống biểu hiện trong thực vật đang đƣợc phát triển nhằm thay thế hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật hay vi sinh vật do có nhiều ƣu thế về giá thành, chất lƣợng protein cũng nhƣ quy mô sản xuất. Cụ thể nhƣ sau [18, 25, 38]:  Tế bào thực vật có khả năng tiến hành quá trình biến đổi sau dịch mã nhƣ các sinh vật nhân chuẩn bậc cao, đảm bảo vắcxin có hoạt tính đối với ngƣời và động vật.  Vắcxin đƣợc tạo ra trong điều kiện môi trƣờng thân thiện, độ an toàn sinh học cao và ổn định.  Tế bào thực vật không mang các mầm bệnh của động vật và ngƣời nên không có khả năng tái tổ hợp với vi rút độc của động vật. Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị, đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn. Đây là một xu thế phát triển mới của công nghệ sinh học. Nhiều gen mã hóa cho các kháng nguyên vi khuẩn, vi rút đã đƣợc chuyển vào thực vật và biểu hiện với hiệu quả cao. Các thực vật chuyển gen biểu hiện kháng nguyên quan tâm đƣợc sử dụng trực tiếp làm vắcxin Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 15 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm cho ngƣời hoặc động vật qua đƣờng ăn uống. So với các loại vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có các ƣu điểm vƣợt trội nhƣ sau [18, 21, 24, 38]:  Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ dàng bảo quản và sử dụng.  Có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá), nấu chín (hạt, củ).  An toàn: vì vắcxin đƣợc sản xuất trong thực vật là vắcxin tiểu đơn vị, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mà không cần đến toàn bộ hệ gen của vi rút nhƣ vắcxin giảm độc lực hay bất hoạt. Do đó, vắcxin dạng này không thể gây b ệnh cho ngƣời và động vật, đồng thời cũng tránh đƣợc nguy cơ nhiễm mầm bệnh khác nhƣ vắcxin sản xuất trong tế bào động vật.  “Vắcxin ăn đƣợc” kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm. Trong thực tế, hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua lớp màng nhầy của đƣờng tiêu hóa, hô hấp và đƣờng tiết niệu. Đây là nhƣ̃ng nơi t ập trung các mô có kh ả năng đáp ứng miễn dịch tố t nhấ t của cơ thể, nhƣ là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại những vi sinh vật đó. Phát triển vắcxin trong thực vật đánh dấu một bƣớc ngoặt quan trọng trên con đƣờng tìm ra phƣơng thức sản xuất vắcxin dựa vào nguồn nguyên liệu có sẵn, rẻ tiền và điều này rất có ý nghĩa đối với các nƣớc đang phát triển. Rất nhiều quy trình sản xuất vắcxin trong thực vật đã đƣợc hình thành nhƣ dùng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, thực vật chuyển gen tạm thời, thực vật nhiễm vi rút và nuôi cấy tế bào thực vật… [18]. Trong quá trình sản xuất vắcxin thực vật, các cây trồng cho củ, hạt và quả làm thức ăn cho ngƣời và động vật thƣờng đƣợc chọn để biểu hiện vắcxin vì dễ sử dụng và bảo quản. Bênh cạnh việc tạo cây trồng biến đổi gen thì việc sản xuất vắcxin trong tế bào thực vật đƣợc nuôi cấy in vitro cũng có nhiều hứa hẹn và có ƣu điểm hơn so với việc sử dụng cây trồng ngoài tự nhiên nhƣ khả năng tạo ra các chất với độ an toàn sinh học cao, ổn định, không phụ thuộc mùa vụ, điều kiện môi trƣờng và không có nguy cơ nhiễm bệnh từ bên ngoài [18]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 16 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Nuôi cấy tế bào có nhiều dạng khác nhau nhƣ nuôi cấy rễ phụ, khối mô chồi, tế bào cố định và tế bào huyền phù. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi sẽ chỉ tập trung vào cải tạo và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào dạng huyền phù vì dạng nuôi cấy này có tính khả thi cao nhất trong việc tạo ra quy trình sản xuất có thể điều khiển đƣợc và việc chuyển lên quy mô lớn có thể tiến hành tƣơng đối dễ dàng. Trong nhiều trƣờng hợp, việc sản xuất vắcxin thực vật gặp phải trở ngại lớn khi phải đối mặt với hiện tƣợng dung nạp đƣờng miệng. Tức là hệ miễn dịch màng nhầy của đƣờng tiêu hóa đƣợc thiết kế không gây đáp ứng miễn dịch với thức ăn nó tiếp xúc hàng ngày. Nhƣ vậy, một số loại kháng sinh thực vật sau khi vào đƣờng tiêu hóa sẽ không đƣợc hệ miễn dịch màng nhầy nhận ra nên "lờ đi". Ngƣợc lại, một số "thức ăn" lạ có thể gây phản ứng tức thời hoặc lâu dài do dung nạp đƣờng miệng không tồn tại với chúng. LTB (Labile Toxin B subunit - độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli) thƣờng gây đáp ứng miễn dịch với cơ thể ở mức cao. Chính vì vậy, chúng thƣờng đƣợc sử dụng làm tá chất cho việc chuyển tải kháng nguyên qua đƣờng miệng [20, 31, 37]. 1.5.2. Sử dụng tế bào thuốc lá siêu sinh trƣởng BY – 2 làm hệ thống biểu hiện Tế bào huyền phù đã đƣợc tạo ra từ nhiều loài thực vật khác nhau nhƣ Arabidopsis thaliana, Taxus cuspidate, Catharanthus roseus và các cây trồng quan trọng khác nhƣ thuốc lá, cỏ ba lá, lúa, cà chua và đậu tƣơng …[18]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY-2 làm hệ thống biểu hiện. Tế bào thuốc lá BY-2 là dòng tế bào siêu sinh trƣởng, đƣợc các nhà khoa học Nhật Bản chọn lọc từ nuôi cấ y mô lõi của thân cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow No. 2 vào năm 1968. BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng khoảng 100 lần trong vòng một tuần. Một đặc điểm ƣu việt khác nữa là BY-2 đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium [18]. Do vậy, tế bào BY-2 là dòng tế bào thực vật đang đƣợc dùng rộng rãi nhất cho việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 17 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 1.6. CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens [12, 17] Các vi khuẩn đất A. tumefaciens và một số loài họ hàng của chúng có khả năng chuyển một phần nhỏ ADN vào tế bào thực vật, qua đó kích thích tạo khối u. Khối u tạo thành là không gian sống, đồng thời là nơi tổng hợp một số chất dinh dƣỡng có lợi cho vi khuẩn (opine). Nhƣ vậy, A. tumefaciens đã thực hiện “kỹ thuật gen” với mục đích tạo ra “cây biến đổi” gen có lợi cho nó. Khả năng chuyển ADN của A. tumefaciens đƣợc ứng dụng trong công nghệ gen hiện đại [12, 17]. Việc sử dụng A. tumefaciens bắt đầu từ năm 1970, khi ngƣời ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thƣơng, đƣợc gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.4). Trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn với kích thƣớc khoảng 200-800 kb. Từ những thí nghiệm trên những chủng A. tumefaciens không độc (không có plasmid này), ngƣời ta đã khẳng định plasmid nói trên là cần thiết cho việc tạo khối u. Do vậy, chúng đƣợc gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid) [12, 17]. Hình 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và khối u. a: Vi khuẩn A. tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử; b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên [12]. Ti-Plasmid gồm bốn vùng A, B, C, D. Trong đó, vùng A luôn luôn đƣợc chuyển sang tế bào thực vật nên có tên là T-DNA (Transferred DNA). T-DNA mang 2 hệ gen: Một hệ gen gây khối u cho thực vật có chứa ít nhất 3 gen tổng hợp các phytohormone là auxin và cytokinin, do đó có liên quan đến việc tạo ra và duy trì sự Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 18 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm phân chia tế bào liên tục không phụ thuộc vào sự sinh trƣởng của cây; hệ gen thứ hai mã hóa cho một số enzyme điều khiển tổng hợp các dẫn xuất của amino acid hay đƣờng gọi là opine. Vùng B là vùng tái bản mang điểm khởi đầu sao chép (oriT). Vùng C liên quan đến sự tiếp hợp. Vùng D có tên gọi là vùng độc (virulence region) có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực vật. Ngoài ra, mỗi Ti-plasmid còn chứa các gen nằm ngoài vùng T-DNA mã hóa cho các enzyme phân giải opine cung cấp nguồn carbon và nitơ cho vi khuẩn [12, 17]. Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [12]. Vùng T-DNA có kích thƣớc khoảng 10 kb – 20 kb, nằm giữa 2 trình tự lặp lại gồm 25 bp gọi là bờ trái (left border – LB) và bờ phải (right border – RB). LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hƣớng cho sự chuyển ADN. Sự mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá trình chuyển T-DNA bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hƣớng này rất quan trọng, nếu thiếu yếu tố này việc chuyển gen sẽ không xảy ra hoặc không hiệu quả. Hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Vùng này có kích thƣớc khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon: các virA, B, D và G cần thiết cho việc tạo độc tính; còn vir C và E liên quan đến việc tạo thành khối u. Nhìn chung, gen virA biểu hiện ở mọi điều kiện; gen virC biểu hiện ở khắp các tế bào sinh dƣỡng nhƣng biểu hiện mạnh ở dịch chiết từ các Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 19 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm mô bị thƣơng tổn. Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt của các hợp chất phenol đƣợc tiết ra từ các vết thƣơng tổn của cây. Từ vết thƣơng cây thuốc lá ngƣời ta đã tinh chế và xác định các hợp chất này là acetosyringone và α-hydroxyacetosyringone. Chất này vừa có tác dụng làm lành vết thƣơng vừa có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò nhƣ một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào hệ gen thực vật. Ý nghĩa của gen vir trong quá trình chuyển gen đƣợc giải thích nhƣ sau: Gen virA mã hóa cho một protein màng, là chất nhận hợp chất phenol ở tế bào cây bị thƣơng. Sự nhận biết chất này dẫn đến sự hoạt hóa sản phẩm gen virG, đến lƣợt nó lại kích thích sự sao chép và sự biểu hiện của tất cả gen vir. Sự hoạt hóa của protein thuộc gen virG có thể do sự vận chuyển những nhóm phosphate. Hai protein đƣợc mã hóa từ gen virD2 và virE2 quan trọng đối với việc chuyển T-DNA. Protein virD2 là một endonuclease, cắt sợi đơn đặc hiệu ở bờ phải và trái của T-DNA, Protein virE2 gắn lập tức vào sợi đơn và ngăn cản sự gắn lại với Ti-plasmid (Hình 1.6). Sau đó, bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn còn lại trong Tiplasmid xuất hiện lại một T-DNA hoàn chỉnh. Ngoài ra, một protein virD2 gắn vào đầu 5’ của T-DNA sợi đơn đã đƣợc cắt ra bằng liên kết đồng hóa trị. Bằng cách này tạo ra một phức hệ DNA-protein và đƣợc chuyển vào tế bào thực vật. Cơ chế của quá trình này vẫn chƣa đƣợc làm rõ, nhƣng có thể là 11 protein đƣợc mã hóa từ gen virB tạo nên một lỗ hổng, qua lỗ này phức hệ DNA-protein đƣợc vận chuyển vào thực vật. Khi đến tế bào thực vật phức hệ này đi vào nhân tế bào. Protein virD2 và virE2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nhân và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của tế bào thực vật. Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp đƣợc quan sát là đặc hiệu, bao gồm những trình tự rất ngắn 5-10 bp. Quá trình kết hợp đƣợc thực hiện nhờ các enzyme thực vật, có thể có sự tham gia của protein virD2 [7, 12, 17]. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 20