Tài liệu Thiết kế vector baculor virus mang gen ha của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus like particle

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I T R Ư Ờ N G Đ Ạ• I H Ọ• C K H O A H Ọ• C T ự• N H IÊ N Đ à o T h ị N h ư H oa THIÉT KẾ VECTOR BACULOR VIRUS MANG GEN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHỤC v ụ CHO VIỆC PHÁT TRIỀN VACCINE THÉ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS LIKE PARTICLE C h u y ên ngàn h : V i sinh vật học M ã số: 60.4 2 .4 0 LU Ậ N V Ă N T H Ạ C SỸ K H O A H Ọ C N G Ư Ờ I HƯ ỚNG DẢN K H O A HỌC: TS ĐỒ NG VÃN QUYÊN H à N ộ i - N ă m 2012 LÒI CẢM ON Trước hết, tôi xin bậy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tói Tố. Dồng Văn Quyền , ngưòi đã tận tỉnh chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ vả dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, vả hoàn thành luận văn, giúp tôi có được nhiều kiến thức, kinh nghiệm quỷ báu. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được (A) và hình ảnh mô phỏng r __ câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet). 1.1.2. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt m ang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1.2). Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn định và có tính bảo thủ cao. Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [1,6]. > Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2. 4 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa P B 1 . PB2. PA ha NP X NA 3 M1 I M2 I NS2 41 NS1 Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A /H 5N 1. > Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B 1. P B 1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein P B 1 - F2 được m ã hóa bởi m ột khung đọc mở khác của phân đoạn 2. > Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA. PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao. > Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề m ặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA I và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Vùng nổi giữa HA I và HA2 là m ột số am ino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide. Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus. > Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP). Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển 5 Đào Thị N hư Hoa Luận > văn thạc • s ĩ sinh học • RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững. > Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus. Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm. > Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M I và M2 được dịch m ã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng m ột phân đoạn RNA. Protein M I là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là 11 kDa. Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ. > Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc. Phân đoạn này có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus. Protein NS1 có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin. Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở. NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới. 1.1.3. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 1.1.3.1. Hem agglutinin (HA) HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể 6 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân. Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị H A I và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm. Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần H A I và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HP AI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (Hình 1.3). Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ [3,4]. Hình 1.3: Mô hình cấu trúc phân tử HA Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3). Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau. Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự 7 Luận văn thạc s ĩ sinh học •________ •__________ » Đào Thị N hu Hoa nhiên, vị trí amino axít 226 và 228 của tiểu phần HAI quyết định khả năng liên kết của protein HA với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào chủ. Sự thay đổi các amino axít trên làm thay đổi thụ thể đặc trưng của virus, giúp virus vượt qua rào cản loài và thích ứng với một loại vật chủ mới. Protein HA của virus cúm gia cầm chứa gốc Glutamine 226 và Glycine 228 hình thành nên một dạng hốc hẹp phù hợp để gắn thụ thể axít sialic dạng a2,3- Trong khi đó, chủng virus gây bệnh ở người chứa Leucine 226 và Serine 228 hình thành nên m ột dạng hổc rộng để thích hợp với axít sialic dạng a2,6. Do đó, đột biến điểm trên HA có thể chuyển đổi đặc tính gắn thích hợp sang axít sialic dạng a2,6. Đây chính là điều kiện cần để chúng tiến hóa thành một chủng có khả năng gây nên dịch cúm ở người [39]. ỉ . 1.3.2. Neurom inidase (NA) Protein neuram inidase còn gọi là sialidase là một protein có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type N A [4,6]. Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề m ặt capsid hạt virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu phần dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một m ặt phẳng, và phần kị nước gẳn vào vỏ capsid. Protein NA có vai trò là một enzym cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi m àng tế bào vật chủ, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. M ặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn. Ngoài ra, N A còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuram inic acid làm tan loãng m àng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không 8 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thi N hư Hoa đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ. Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [4], N hư vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhàm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người. M en neuraminidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus. Nó có một đầu gồm 4 bán đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị nước gẳn vào bên trong m àng virus. Đây là gen mã hóa tổng họp protein NA, kháng nguyên bề m ặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 5 0 .103 Dal. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp [4,6], 1.1.3.3. M atrix protein ( M l) của virus cúm Protein nền M I là thành phần chính của virion virut, nó bao quanh vRNP, liên kết vRNP với vỏ virut và kênh ion. M I là một protein khá bền vững gồm 252 amino acid. Nó có hai vùng hình cầu (từ acid amin 1 đến 164 và từ 165 đến 252) liên kết với nhau qua một vùng nhạy cảm với protease. c ấ u trúc của protein M I chủ yếu là dạng xoắn. Protein M l không chỉ là thành phần cấu trúc cần thiết của virion mà còn đóng vai trò quan trọng trong chu trinh sống virut: 9 Đào Thị N hư Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học > Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân. M l là yếu tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này. Sau khi virut đi vào endosome dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virut và phức hợp M l-vR N P bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân. Ngược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M I và NS2 sẽ đi vào nhân và kết họp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân. Sự tương tác của M I với RNP đã được nghiên cứu khá rõ. Hai domain trong M I bám vào RNA được xác định ở hai vùng dộc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger motif, ở vị trí amino acid 148 tới 162) và một chuỗi am ino acid RKLKR (ở vị trí amino acid 101 tới 105). Điều hoà sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi M l . > Tương tác với protein vỏ của virut: HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi. Huy động các thành phần của virut tới vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi. M l là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virut. Phân tử M I liên kết với vRNP, m àng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glycoprotein bề mặt HA và NA, các phân tử M 1 khác thì tạo thành một lớp dưới lớp vỏ bọc của virut. Liên kết của M I với m àng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kị nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ. Huy động các thành phần tế bào chủ cho việc hoàn thành nảy chổi và giải phóng virut. Tỉ lệ M l/N P của phân tử virut ảnh hưởng đến hình thái của virion và sự lan truyền của virut khi được giải phóng. 1.1.4. Tình hình dịch bệnh H5N1 Sự bùng phát của các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao gần đây và khả năng lây lan của loại virus chết người này sang người, đang làm tăng thêm mối lo ngại về một trận đại dịch cúm mới có thể tái hiện như đại dịch cúm lịch sử H IN I xảy ra vào năm 1918 tại Tây Ban Nha giết chết hơn 50 triệu người trên toàn thế giới. Theo thông báo mới nhất của tổ chức Y tế thế giới (W HO), tính đến thời điểm hiện tại, cúm gia cầm đã lan tràn trên 100 quốc gia. Tại các nước Đông Nam Á, cúm H 5 N 1 đã và đang gây tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi. Hàng trăm triệu gia 10 Đào Thi Như Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học súc, gia cầm bị chết hoặc bị thiêu hủy do nhiễm virus này. Điều đặc biệt nguy hiểm là các chủng virus cúm gia cầm này đã có biến đổi lớn về mặt di truyền, tăng khả năng lây nhiễm và gây tử vong cho người. Các số liệu thống kê gần đây cho thấy, đã có hơn 400 ca lây nhiễm trên người và tỷ lệ tử vong lên đến hơn 60%, cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ tử vong 2.5-5% của dịch cúm lịch sử Tây Ban Nha năm 1918 [7, 8, 23, 46, 48]. Năm 1997, 18 người đầu tiên được phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 và 6 người trong số đó đã tử vong [46]. Đợt dịch tái diễn vào năm 2003 làm 4 người nhiễm bệnh và cả 4 người sau đó tử vong. Trong giai đoạn từ năm 2003-2005, cúm A/H5N1 bùng phát trên diện rộng ở 9 nước châu Á làm 19 ca nhiễm ở Thái Lan, 91 ca ở Việt Nam, 7 ca ở Indonesia và 4 ca ở Campuchia giết chết 62 người [54]. Đến năm 2009, số trường hợp lây nhiễm H5N1 đã lên đến 417 người và làm tử vong 257 người trong số đó [24]. Theo thông báo của Tổ chức thú y quổc tế (OIE), đến tháng 03 năm 2010, bảy tỉnh thành tại Việt Nam công bố cúm gia cầm tái suất hiện làm chết hom 6 nghìn và làm tiêu hủy hơn 14 nghìn gia cầm. Số trường hợp nhiễm và tử vong do H 5N 1 vẫn không ngừng gia tăng. Ca tử vong gần đây nhất liên quan đến H5N1 được ghi nhận tại Việt Nam là một bệnh nhân nữ, phát hiện vào tháng 2 năm 2010 [24]. 1.2. Vaccine phòng chống cúm 1.2.1. Đại cưong về vaccine M ỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi vì vi rút cúm A/H5N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xạ mặt trời, tia cực tím và các chất tẩy rửa thông thường (xà phòng, chất tẩy Natri hypochlorite 0,05%, cồn ethanol 70% ...). Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch. Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H5N1 có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh. Ngoài ra còn ảnh hưởng nặng nề tới nền kinh tế mỗi quốc gia 11 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Tlti N hư Hoa và đặc biệt là người nông dân, môi trường sinh thái bị ô nhiễm ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A, cơ chế hoạt động của thuốc dựa trên chu trình hoạt động của virus cúm. Cụ thể là: > Amantadine và Rimantadine : Đây là hai loại thuốc cản trở sự hoạt động của kênh ion M 2. Dan tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vở ngoài của virus. vRNP không được đưa vào nhân cài xen vào gemone của tế bào chủ. Ở nồng độ nhỏ Amantadine gây hiệu quả cao với virus cúm A song kém hiệu quả với virus cúm B và c ( do sự khác biệt về kênh ion). Am antadine còn hoạt động như một bazơ yếu, trung hòa H+ trong endosome và bộ máy golgi. Trong hai loại thuổc này thì Rimantadine được sử dụng phổ biến hốn vì gây ít tác dụng phụ. Tuy nhiên thực tế chúng đều gây tác đông phụ tới hệ thần kinh đồng thời cũng xuất hiện những chủng cúm kháng thuốc. Sự kháng thuốc này chủ yếu liên quan tới các đột biến xảy ra trong trình tự nucleotid mã hóa cho kênh M2. > Leptomycine B: Cơ chế của loại thuốc này là ngăn cản sự vận chuyển vRNP ra khỏi nhân tế bào. > Zanamivir (Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir): hai loại này có cấu hình không gian tương tự như NA. Do vậy chúng ngăn cản sự liên kết của NA với các thụ thể sialic acid, cản trở quá trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm virus. Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây lan của dịch cúm. Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà L an,... Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc. Việt Nam đang trong giai đoạn tập duyệt sản xuất vaccine để phòng cúm H5N1. Các vắc-xin ngừa bệnh cúm mùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H5N1 mới. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới. 12 Đào Thị N hư Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học 1.2.2. Vaccine truyền thống - Vaccine bất hoạt: Vaccine này được tạo ra từ các chủng virus ngoài tự nhiên, đã bị làm bất hoạt bằng các tác nhân lý hóa khác nhau và không còn khả năng nhân lên trong vật chủ. Hiện nay, phương pháp tạo vaccine này được sử dụng phổ biến nhất là nuôi virus trong trứng rồi làm bất hoạt bằng các tác nhân vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia tử ngoại, hay các tác nhân hóa học như: các loại thuổc nhuộm, axít, formol. Loại vaccine này có ưu điểm dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an toàn cao. Tuy nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, cần tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm, lượng vaccine tiêm mỗi lần nhiều và hiệu quả không cao [2]. - Vaccine giảm độc lực: Là loại vaccine đã được làm nhược độc hoặc vô độc nhưng vẫn bảo toàn tính kháng nguyên. Thường vaccine được tạo từ các loại virus đã bị làm mất các gen quy định tính độc, do đó không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn còn khả năng gây đáp ứng m iễn dịch. Vaccine này có khả năng sinh đáp ứng m iễn dịch nhanh chóng và tốt hơn vaccine bất hoạt, tác dụng bảo vệ phòng bệnh hiệu quả, không phải tiêm nhắc nhiều lần. Theo một số nghiên cứu, loại vaccine này có khả năng bảo vệ chéo giữa các chủng virus cúm A khác nhau. Tuy nhiên, mức độ an toàn của loại vaccine này thấp hơn so với vaccine bất hoạt do có khả năng biến đổi thành kiểu hoang dại và gây bệnh ở vật chủ [2]. 1.2.3. Vaccine thế hệ mói: - Vaccine tái tổ hợp: Các gen m ã hóa cho kháng nguyên virus có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch bảo hộ được đưa vào các hệ biểu hiện khác nhau như: vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật hay virus để tổng hợp. Các kháng nguyên sau khi tổng họp ra có thể được sử dụng làm vaccine. Vaccine TrovacAIV - H5 của hãng M erial (Pháp), được tạo ra từ gen H5 của chủng A/Turkey/IrelDNA/83 (H5N2) là một ví dụ về loại vaccine 13 Đào Thi•___ N hư Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học I __________ •_______________ • tái tổ hợp. Loại vaccine này được sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi và có khả năng bảo vệ trong hơn 20 tuần, hiện được sử dụng rất rỗng rãi. Tại Việt Nam, vaccine TrovacAIV-H5 được áp dụng tiêm phòng cúm cho gà từ năm 2006 [2]. - Vaccine DNA: Gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào một vector biểu hiện cùng với một prom oter mạnh có khả năng biểu hiện tốt trong tế bào vật chủ. Khi biến nạp thành công vào vật chủ, protein kháng nguyên sẽ được tổng hợp ra từ gen m ã hóa cho kháng nguyên và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein đó. Vaccine DNA rất gọn nhẹ, an toàn, phương thức gây miễn dịch đơn giản do chỉ chứa D NA thuần khiết nên bền với nhiệt độ [2], - V accine virus nhược độc nhân tạo sản xuất bằng kĩ thuật di truyền ngược: Phương pháp này được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồm nhiều phân đoạn nhỏ. Các phân đoạn được lắp ghép tạo thành virus với đầy đủ hệ gen. Trong đó, các gen kháng nguyên H5 có vùng độc được biến đổi bằng kỹ thuật gen. Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (W HO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay đó là NIBRG - 14 (NIBSC), VN/04xPR8 - rg (SJCRH) và VNH5N1 - PR8/CDC - rg (CDC) [2]. - Vaccine dưới đơn vị: Là loại vaccine chỉ sử dụng một phần của hạt virus để kích thích đáp ứng miễn dịch. Do các kháng nguyên đã được tinh chế khi sử dụng làm vaccine nên có độ an toàn cao, không gây các phản ứng phụ. Quy trình sản xuất lượng lớn vaccine dưới đơn vị khá đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiền [2]. 1.3. H ạt giả virus - VLPs 1.3.1. Phương pháp tạo VLPs Để tạo ra các VLPs, người ta thường sử dụng các protein có tính sinh miễn dịch cao của virus gây bệnh, thông thường là các protein bề mặt. Các gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus sẽ được thiết kế vào baculovirus 14 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa transfer vector. Các vector này sau đó được đồng chuyển nạp (co-transfect) với DNA của baculovirus đã được xử lý với enzyme Bsu36 I để loại bỏ đầu c của ORF 1269, promoter polyhedrin và polyhedrin ORF. Việc xử lý với Bsu36 I đã loại bỏ các thành phần quan trọng cho sự tổng họp và nhân lên của baculovirus trong tế bào chủ. Cách duy nhất để DNA của baculovirus có thể tổng hợp lên virus khi được đưa vào trong tế bào nuôi cấy là chúng phải được bổ sung lại vùng bị loại bỏ này. Do đó khi đồng chuyển nạp với baculovirus transfer vector, các vùng thiết yếu (ORF 1629) sẽ được bổ sung từ vector này bằng cơ chế tái tổ hợp trình tự tương đồng tạo lên các virus tái tổ họp biểu hiện ra protein cần nghiên cứu (gen o f interest - GOI) (Hình 1.4). pM 3 C ir c u la r B sc-N -B lu «* DNA Ssu361 pPH ß*u3e I fi R e s t r ic t w ith B s u 36 I R e c o m b in a t io n p «0 3 R e c o m b in a n t A c M N P V D N A PE TL P p h Piea* Hình 1.4: Sơ đồ tái tổ hợp giữa DNA của baculovirus và baculovirus transfer vector để tạo VLPs. 1.3.2. Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs Có nhiều hệ thống biểu hiện để sản xuất VLPs bao gồm: các dòng tế bào động vật có vú; tế bào côn trùng; các chủng nấm men khác nhau như Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, Escherichia coli và vi khuẩn khác. V accine VLP theo đường miệng (vaccine HBV, vaccine virus N orw alk) đã được tạo 15