Tài liệu Thiết kế cặp mồi chuyên biệt nhận diện nấm xanh metarhizium anisopliae var. acridum bằng kỹ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ CẶP MỒI CHUYÊN BIỆT NHẬN DIỆN NẤM XANH METARHIZIUM ANISOPLIAE VAR. ACRIDUM BẰNG KỸ THUẬT PCR CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI SINH VIÊN THỰC HIỆN TRƢƠNG KHÁNH ANH CƠ MSSV: 3082497 LỚP: CNSHTT K34 Cần Thơ, Tháng 5/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Trần Thị Xuân Mai Trƣơng Khánh Anh Cơ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… …………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ chân thành và nhiệt tình từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nhân đây, tôi xin gửi những lời tri ân sâu sắc và chân thành đến: Cha mẹ, anh chị em và gia đình đã luôn quan tâm, thăm hỏi và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô Trần Thị Xuân Mai, người đã tận tình hướng dẫn tôi cả về mặt lý thuyết lẫn thực hành, giúp tôi hoàn thiện kiến thức chuyên môn và hoàn thành tốt luận văn. Cô Nguyễn Thị Liên và Cô Nguyễn Thị Pha đã quan tâm và chỉ dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm. Thầy Nguyễn Đắc Khoa và các anh chị cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện những thí nghiệm tại phòng. Thầy Trần Nguyên Tuấn và Đội Văn nghệ Đoàn Viện đã hết lòng hỗ trợ, động viên, chăm sóc tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Toàn thể Ban Lãnh đạo, cán bộ Viện NC&PT Công nghệ sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt 5 năm tôi học tập và rèn luyện tại Viện. Tất cả các bạn lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K34, các bạn trong phòng thí nghiệm Công nghệ gen Thực vật đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Trương Khánh Anh Cơ Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Nấm xanh Metarhizium anisopliae là một trong những nguồn sinh vật có tiềm năng to lớn trong việc phát triển các biện pháp sinh học diệt trừ côn trùng gây hại. Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về độc tính, hiệu lực cũng như phổ côn trùng ký chủ của loài nấm này nhằm phát triển rộng rãi tính ứng dụng của chúng vào sản xuất nông nghiệp. Một số tỉnh thành trong nước cũng đã áp dụng quy trình tự sản xuất chế phẩm sinh học Metarhizium anisopliae đến các nông hộ, hợp tác xã. Tuy nhiên, quá trình kiểm tra chất lượng sản phẩm vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế về mặt kỹ thuật. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu thiết kế các cặp mồi chuyên biệt cho nấm Metarhizium anisopliae, cụ thể là dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum, dựa trên trình tự vùng ITS – rDNA, nhằm mục đích phát hiện nhanh dòng nấm này bằng kỹ thuật PCR, rút ngắn thời gian kiểm tra sản phẩm sinh học. Kết quả cho thấy 2 cặp mồi được thiết kế là đặc hiệu với nấm Metarhizium anisopliae var. acridum, với sản phẩm khuếch đại lần lượt là 530bp với cặp mồi MacITS 1F và Mac-ITS 535R, và 130bp với cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 134R. Trong đó, cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 134R có độ chuyên biệt cao hơn so với cặp mồi còn lại. Dựa vào các cặp mồi này, xác định được có 6/8 mẫu nấm nghiên cứu thuộc dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum, trong đó có 1/3 mẫu nấm nghiên cứu đã phân lập được từ nấm ký sinh trên rầy nâu tại Sóc Trăng. Đồng thời nghiên cứu cũng đã tìm ra quy trình trích DNA tối ưu cho nấm sợi, đặc biệt là Metarhizium anisopliae. Từ khóa: Chế phẩm sinh học, ITS – rDNA, Metarhizium anisopliae var. acridum, Mồi chuyên biệt. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG .................................................................................................. LỜI CẢM TẠ............................................................................................................... TÓM LƢỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. vi TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................................... vii CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ............................................................................................................... 2 CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3 2.1. Hiện trạng sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học ở nƣớc ta ....................... 3 2.2. Một số đặc điểm của nấm xanh Metarhizium anisopliae ................................... 5 2.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 5 2.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa..................................................................... 7 2.2.3. Phổ côn trùng ký chủ và tác động của nấm xanh Metarhizium anisopliae lên côn trùng ................................................................................................................ 7 2.2.3.1. Phổ côn trùng ký chủ của nấm ................................................... 7 2.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Metarhizium anisopliae lên côn trùng 8 2.2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Metarhizium anisopliae . 9 2.3. Sơ lƣợc về vùng gen ITS – rDNA ..................................................................... 11 2.4. Mồi và thiết kế mồi ........................................................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa đoạn mồi ............................................................................. 13 2.4.2. Một số quy tắc trong thiết kế mồi .......................................................... 13 2.4.3. Các phần mềm thiết kế mồi ................................................................... 14 2.5. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 15 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.5.1. Khái niệm chung ................................................................................... 15 2.5.2. Nguyên lý .............................................................................................. 15 2.5.3. Các chu kỳ của phản ứng PCR .............................................................. 15 2.5.4. Các thành phần tham gia phản ứng ........................................................ 16 2.6. Kỹ thuật điện di................................................................................................. 17 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 19 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 19 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 19 3.2.1. Dụng cụ ................................................................................................. 19 3.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 19 3.2.3. Hóa chất ................................................................................................ 19 3.2.4. Vật liệu.................................................................................................. 20 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 21 3.3.1. Thiết kế các đoạn mồi PCR ................................................................... 21 3.3.2. Thu thập và phân lập mẫu nấm Metarhizium anisopliae ........................ 21 3.3.3. Quy trình CTAB li trích DNA nấm mốc (Van Burik, 1998) .................. 22 3.3.4. Quy trình trích DNA thực vật ................................................................ 23 3.3.5. Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng chỉ số OD .................................... 24 3.3.6. Phản ứng PCR ....................................................................................... 25 3.3.7. Phân tích sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel agarose ................ 26 3.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 26 3.4.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho nấm Metarhizium anisopliae var. acridum ... 26 3.4.2. Phân lập và nhận diện nấm Metarhizium anisopliae từ mẫu côn trùng ... 27 3.4.3. Cải thiện quy trình trích DNA nấm Metarhizium anisopliae .................. 27 3.4.4. Nhận diện nấm Metarhizium anisopliae var. acridum và kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phản ứng PCR .............................................................................. 27 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 28 4.1. Thiết kế các đoạn mồi ....................................................................................... 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 4.2. Một số đặc điểm của mẫu nấm phân lập ......................................................... 30 4.3. Cải thiện quy trình trích DNA nấm Metarhizium anisopliae .......................... 31 4.4. Kết quả kiểm tra mẫu nấm Metarhizium anisopliae bằng phƣơng pháp PCR33 4.4.1. Kết quả PCR mẫu nấm Metarhizium anisopliae với cặp mồi Mac-ITS 56F và Mac-ITS 476R ............................................................................................... 33 4.4.2. Kết quả PCR mẫu nấm Metarhizium anisopliae với cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 535R ...................................................................................................... 34 4.4.3. Kết quả PCR mẫu nấm Metarhizium anisopliae với cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 134R ...................................................................................................... 35 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 37 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 37 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 38 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... Bảng: Chỉ số OD mẫu nấm Metarhizium anisopliae Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Hiệu quả của chế phẩm M. anisopliae đối với các loại sâu hại tại huyện Ô Môn (Cần Thơ) .......................................................................................................... 10 Bảng 2: Mối liên hệ giữa nồng độ gel và kích thước DNA ......................................... 18 Bảng 3: Danh sách mẫu nấm Metarhizium anisopliae dùng trong thí nghiệm ............ 20 Bảng 4: Trình tự các cặp mồi dùng để phát hiện nấm Metarhizium anisopliae var. acridum ..................................................................................................................... 21 Bảng 5: Trình tự các cặp mồi thiết kế......................................................................... 28 Bảng 6: Tên và Accession number của các trình tự ITS – rDNA nấm Metarhizium anisopliae var. acridum và var. anisopliae ................................................................. 28 Bảng 7: Chỉ số OD mẫu DNA nấm Metarhizium anisopliae ...................................... 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Quy trình chung nhân giống chế phẩm sinh học nấm Metarhizium anisopliae . 4 Hình 2: Hình thái bên ngoài của nấm Metarhizium anisopliae ..................................... 6 Hình 3: Rầy nâu bị bao phủ bởi nấm Metarhizium anisopliae ...................................... 6 Hình 4: Vùng gen ITS – rDNA của sinh vật nhân thật ............................................... 12 Hình 5: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR.................................................................... 16 Hình 6: Kết quả so sánh giữa trình tự ITS – rDNA của hai dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum và var. anisopliae ................................................................. 29 Hình 7: Kết quả kiểm tra cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 134R với vùng gen khuếch đại từ nucleotide 1 đến 134 ........................................................................................ 29 Hình 8: Kết quả kiểm tra cặp mồi Mac-ITS 1F và Mac-ITS 535R với vùng gen khuếch đại từ nucleotide 1 đến 535 ........................................................................................ 30 Hình 9: Mẫu nấm Metarhizium anisopliae ST1, ST2 và ST3 sau 1 tuần cấy .............. 31 Hình 10: Mẫu nấm Metarhizium anisopliae Vĩnh Long sau 1 tuần cấy ...................... 31 Hình 11: Kết quả PCR với cặp mồi 56F và 476R các mẫu nấm M. anisopliae ........... 33 Hình 12: Kết quả PCR với cặp mồi 1F và 535R các mẫu nấm M. anisopliae ............. 34 Hình 13: Kết quả PCR với cặp mồi 1F và 134R các mẫu nấm M. anisopliae ............. 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribosenucleic acid dNTP Deoxyribosenucleotide triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Ethylenediamine tetra-acetic acid ITS Internal transcribed spacer NCBI National Center of Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleic acid SDS Sodium doecyl sulphate TBE Tris – Borate – EDTA TE Tris - EDTA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, nền nông nghiệp nước ta đang đi vào quá trình thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp canh tác khác nhằm nâng cao năng suất và sản lượng. Những phương pháp trên đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến độ dinh dưỡng và hệ sinh thái của đất, tích tụ các dư lượng thuốc hóa học độc hại trong đất lẫn sản phẩm nông nghiệp, từ đó ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học được đặc biệt chú ý khi phương pháp hóa học sau thời gian dài nắm vai trò chủ đạo trong công tác bảo vệ thực vật đã bộc lộ nhiều hạn chế. Lợi dụng vào lực lượng thiên địch rất phong phú, đa dạng và sẵn có trong tự nhiên, các nhà khoa học đã sử dụng các loài thiên địch này để kiềm hãm sự phát triển của côn trùng gây hại. Đây là biện pháp đạt hiệu quả rất lớn, phát tán nhanh, chỉ gây hại trên côn trùng có hại mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây trồng cũng như không gây ô nhiễm môi trường và an toàn cho người tiêu dùng sản phẩm. Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay có nguồn gốc rất đa dạng, từ thảo mộc, vi khuẩn, vi nấm, đến virus hay một số loài tuyến trùng. Trong số đó, đáng chú ý nhất là ngành nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm xanh Metarhizium anisopliae, một trong những nguồn thiên địch hữu hiệu nhất, có khả năng ký sinh phổ rộng trên nhiều loại côn trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Đặc biệt, biện pháp sử dụng chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae để phòng trừ rầy nâu trên ruộng lúa là biện pháp khá phổ biến và ngày càng được nhân rộng nhờ tính khả thi và hiệu quả phòng trừ cao. Chế phẩm nấm xanh Metarhizium anisopliae không gây ảnh hưởng xấu tới con người, gia súc và môi trường, có hiệu lực bền lâu và kéo dài tới hàng tháng sau khi phun (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Nghệ An). Ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long, đã có khá nhiều nghiên cứu về khả năng diệt trừ rầy gây hại của nấm Metarhizium anisopliae cũng như các nghiên cứu phân lập các dòng nấm này để sản xuất chế phẩm sinh học. Bên cạnh đó, công tác thử nghiệm sản xuất chế phẩm Metarhizium anisopliae cũng đã được triển khai rộng rãi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ đến bà con nông dân. Tuy nhiên, việc xác định dòng nấm có trong sản phẩm tốn nhiều tiền bạc, công sức cũng như thời gian để đưa đến kết quả cuối cùng do quá trình phân tích phức tạp. Thêm vào đó, việc đánh giá chính xác dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum cũng gặp nhiều khó khăn do sự tương đồng khá lớn về mặt hình thái giữa các dòng trong cùng loài Metarhizium sp.. Từ đó, ý tưởng đề tài “Thiết kế cặp mồi chuyên biệt để nhận diện nấm Metarhizium anisopliae var. acridum bằng kỹ thuật PCR” được đưa ra nhằm định danh nấm Metarhizium anisopliae var. acridum bằng kỹ thuật PCR, rút ngắn thời gian phân tích cũng như giảm bớt tài chính cho việc định danh bằng phương pháp cổ điển. 1.2. Mục tiêu - Cải thiện quy trình trích DNA từ nấm mốc, cụ thể là nấm Metarhizium anisopliae. - Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhận biết dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum và đánh giá được độ đặc hiệu của mồi. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Hiện trạng sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học ở nƣớc ta Ở Việt Nam, nghiên cứu các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật ở nước ta đã được đề cập và tiến hành trong nhiều năm gần đây khi mà vấn đề ngộ độc thực phẩm và nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật đã lên đến mức báo động. Những nghiên cứu ban đầu cho thấy nước ta có một hệ vi sinh vật đối kháng bệnh cây và vi sinh vật gây bệnh côn trùng phong phú cả về số lượng lẫn chủng loại (Nguyễn Văn Tuất, 2004). Đến nay, các cơ quan nghiên cứu khoa học như Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Vi sinh vật ứng dụng, Viện Di truyền nông nghiệp… đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nhiều loại chế phẩm sinh học kết hợp với các kỹ thuật canh tác vào sản xuất nông nghiệp tại khắp các vùng miền trên đất nước. Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm với các tính năng khác nhau như: phòng trừ sâu bệnh hại cây; sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng; hay dùng cho công tác cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp. Trong đó, chế phẩm dùng cho việc phòng trừ côn trùng, sâu bệnh hại cây trồng được đặc biệt quan tâm phát triển, ứng dụng sớm nhất và phổ biến khá rộng rãi. Đáng kể nhất là chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) được nghiên cứu trong khoảng 35 năm nay đã có nhiều kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng. Bên cạnh các chế phẩm có nguồn gốc vi sinh, chế phẩm sinh học nguồn gốc từ vi nấm cũng đang được chú ý ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung như nấm men Streptomyces avermitilis, Streptomyces hygroscopius, hay dòng nấm đối kháng Trichoderma. Một trong những nguồn nấm được quan tâm nhất hiện nay là Metarhizium và Beauveria, thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn, với khả năng ký sinh trên phổ rộng các loài côn trùng gây hại mùa màng nhưng không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Hiện tại, ngoài các cơ quan nghiên cứu khoa học, các công ty thuốc bảo vệ thực vật, Sở Khoa học và Công nghệ của một số tỉnh thành cũng đã đầu tư không ít vào lĩnh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ vực này, thậm chí mở các lớp tập huấn nhằm đưa kĩ thuật sản xuất đến với các nông hộ nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân với quy trình khá đơn giản và tiện lợi (Hình 1). Năm 2006 – 2007, Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long đã phối hợp với Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Sóc Trăng thực hiện đề tài “Xây dựng mô hình phòng trừ sâu hại lúa bằng chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassian trong thâm canh lúa chất lượng cao”, sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Ometar và Bemetent do Nguyễn Thị Lộc – Bộ môn Phòng trừ sinh học sản xuất (Trung tâm ứng dụng khoa học và công nghệ Sóc Trăng). Năm 2012, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học & Kỹ thuật tỉnh Bình Định cũng đã sản xuất thành công và chuyển giao cho các hộ gia đình công nghệ sản xuất chế phẩm Metarhizium sp. (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định). Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp và ứng dụng công nghệ CARTA vừa nghiên cứu, cải tiến chế phẩm nấm xanh Metarhizium dùng để rải gốc và phun xịt, có hiệu lực chỉ trong khoảng 7 – 10 ngày sau khi dùng. Công ty DNTN Việt Linh cũng đã đưa ra thị trường sản phẩm M&B gồm hai loại nấm Metarhizium và Beauveria với hiệu suất trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả đạt 70 – 90%. Hình 1: Quy trình chung nhân giống chế phẩm sinh học nấm Metarhizium anisopliae (Nguồn: http://sta.soctrang.gov.vn) Tuy nhiên, quy trình sản xuất của các vùng vẫn chưa đồng bộ cũng như khó xác định độ chính xác của sản phẩm thu được. Thông thường, để kiểm tra sản phẩm thu được có chính xác là loài nấm Metarhizium hay không, nhà nghiên cứu và nông dân phải phun xịt chế phẩm trên đồng ruộng, chờ một thời gian cho nấm tác động lên côn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ trùng. Sau đó, thu mẫu côn trùng nhiễm nấm về phòng thí nghiệm, cấy ròng và tăng sinh khối nấm. Khi nấm phát triển hoàn toàn, sản sinh bào tử để quan sát cấu trúc hình thái sợi nấm và bào tử mới xác định được dòng nấm đã sản xuất. Tổng thời gian kiểm định dòng nấm theo phương pháp cổ truyền này mất ít nhất 1 tuần để cho kết quả, tiêu tốn nhiều thời gian và chi phí. Từ đó, nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đã nghiên cứu thiết kế các cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng nấm Metarhizium thông qua kỹ thuật PCR, giúp rút gọn thời gian cũng như hạ thấp kinh phí cho việc kiểm định các loại chế phẩm sinh học này. 2.2. Một số đặc điểm của nấm xanh Metarhizium anisopliae Nấm xanh Metarhizium anisopliae do Elie Metchnikoff, một nhà vi sinh vật học người Nga, phát hiện năm 1878 khi dùng môi trường bã bia để nuôi cấy những loài vi sinh vật có khả năng phòng chống bọ cánh cứng Anislopia austriaca gây hại lúa mì. Trong số những sinh vật đó có một loài nấm xanh được đặt tên là Entomophthora anisopliae, sau được đổi thành Metarhizium anisopliae (Lord, 2005; Trần Nhật Nam, 2007). Nấm Metarhizium anisopliae thuộc Ngành Ascomycota, Lớp Sordariomycetes, Bộ Hypocreales, Họ Clavicipitaceae, Chi Metarhizium. Nấm có bào tử màu xanh lục nên nước ta còn gọi là nấm lục cương. 2.2.1. Đặc điểm hình thái Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn, trong chứa nhiều giọt mỡ, đường kính khoảng 3 - 4µm. Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc. Trong khi đó, sợi nấm phát triển bên trong cơ thể côn trùng có chiều rộng khoảng 3 – 4 µm, dày khoảng 20µm, chia thành nhiều tế bào ngắn (Bùi Cẩm Thu, 2009). Nấm có bào tử trần hình que, màu lục xám đến xanh lục, xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và tạo thành một lớp phấn khá rõ trên bề mặt cơ thể côn trùng. Khuẩn lạc có màu xanh, đôi chỗ màu hơi hồng (Phạm Thị Thùy, 2004). Dựa vào hình thái bên ngoài có thể chia nấm Metarhizium anisopliae thành 2 dạng bào tử: dạng bào tử phân sinh dài 3,5 – 9µm Metarhizium anisopliae var. ansopliae và dạng bào tử phân dài 9 – 18µm Metarhizium anisopliae var. major (Trần Văn Mão, 2004). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 2: Hình thái bên ngoài của nấm Metarhizium anisopliae (Nguồn: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1276025) Hình 3: Rầy nâu bị bao phủ bởi nấm xanh Metarhizium anisopliae (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Metarhizium_anisopliae) Tuy nhiên, dựa trên phương pháp RAPD – PCR và trình tự các vùng ITS, 5.8S rDNA và 28S rDNA, Driver et al. (2000) lại phân chia loài M. anisopliae thành 4 nhóm sau: M. anisopliae var. anisopliae, var. major (majus), var. acridum và var. lepidiotum, với trình tự của var. acridum hoàn toàn khác biệt với trình tự của các dòng M. anisopliae khác. Trên cơ sở đó, Bischoff et al. (2009) đã nghiên cứu và tách hẳn M. anisopliae var. acridum thành một loài riêng biệt M. acridum stat. nov.. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Mặc dù có sự khác biệt về mặt vật chất di truyền, M. anisopliae var. acridum lại có hình thái sợi nấm, bào tử cũng như khuẩn lạc khá giống với các dòng M. anisopliae khác. Theo Lomer et al. (2001), rất khó để phân biệt dòng M. anisopliae var. acridum với các dòng M. anisopliae khác nếu chỉ dựa trên hình dáng và kích thước của bào tử. 2.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Theo Ninh Thị Huyền Nga (2005) và Bùi Cẩm Thu (2009), nấm xanh Metarhizium anisopliae có các đặc điểm cơ bản về sinh lý sinh hóa như sau: Nấm Metarhizium anisopliae không có khả năng sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có kitin. Tuy nhiên, chúng có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau. Chúng còn có thể phát triển tốt trên môi trường chứa glucose hay lipid. Metarhizium anisopliae sống được ở nhiệt độ thấp (8°C), có biên độ về độ ẩm rộng. Ở nơi có nhiều CO2, thiếu O2, chúng có thể sống tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, sự nảy mầm của bào tử đính bị ức chế bởi hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas. Ở nhiệt độ dưới 10°C và trên 45°C, nấm thường không hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 – 30°C, và sẽ bị chết ở 49 – 55°C. Nhiệt độ phát triển tốt nhất cho nấm là 25°C, pH dao động trong khoảng 3,3 – 8,5, pH tối ưu là 6,0. Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lông và vỏ côn trùng). Sản phẩm trao đổi chẩt có thể làm tê liệt ấu trùng của loài Galleria, Mellonela và Bombyx mori. 2.2.3. Phổ côn trùng ký chủ và tác động của nấm xanh Metarhizium anisopliae lên côn trùng 2.2.3.1. Phổ côn trùng ký chủ của nấm Có 3 loài thuộc Chi Metarhizium: Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, Metarhizium flavorviride (Gams and Roszypal) và Metarhizium album (Petch). Trong đó, Metarhizium anisopliae có phổ ảnh hưởng rộng đến nhiều nhóm côn trùng, trong khi 2 loài còn lại có phổ tác động hạn chế hơn (Stolz, 1999). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Theo Talwar (2005), Metarhizium sp. có khả năng tấn công hơn 200 loài côn trùng khác nhau thuộc các Bộ Coleoptera, Dermoptera, Homoptera, Lepidoptera và Orthoptera. Theo Bridge et al. (1997), M. anisopliae var. anisopliae có tác động lên vô số loài côn trùng gây hại, trong khi M. anisopliae var. acridum chỉ có công dụng đặc hiệu lên các loài thuộc Bộ Orthoptera, đặc biệt là cào cào hay châu chấu. 2.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Metarhizium anisopliae lên côn trùng Nấm xanh sau khi rơi trên bề mặt của côn trùng, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm, tạo thành ống mầm xuyên qua lớp vỏ kitin của côn trùng trong vòng 24 giờ. Sau đó, chúng tiếp tục phân nhánh tạo thành một mạng sợi nấm chằng chịt trên khắp bề mặt của cơ thể côn trùng (Ninh Thị Huyền Nga, 2005). Lúc này, côn trùng huy động tất cả tế bào bạch huyết để chống chọi, nhưng nấm Metarhizium anisopliae lại tiết ra độc tố Destruxin A và B lần lượt tiêu diệt các tế bào bảo vệ này, làm chết côn trùng. Cơ thể côn trùng cứng dần lại do các sợi nấm đan xen với nhau. (Phạm Thị Thùy, 2004). Một trường hợp khác, khi bị nấm tấn công, cơ thể côn trùng bị ngắn lại hoặc bị khô do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu nguồn thức ăn. Khi nấm Metarhizium anisopliae ký sinh thì tuyến mỡ và các mô khác của côn trùng bị hòa tan do lipase và protease do nấm tiết ra (Phạm Thị Thùy, 2004). Các độc tố diệt côn trùng do nấm sinh ra không phải là enzyme. Chúng là những hợp chất hóa học có trọng lượng phân tử thấp, và có khả năng giết chết côn trùng ngay cả khi hiện diện với nồng độ thấp (Ninh Thị Huyền Nga, 2005) Theo Nguyễn Văn Tuất (2004), độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium anisopliae bao gồm các chất ngoại độc tố Destruxin A, B, C và D. Các ngoại độc tố này là sản phẩm thứ cấp vòng peptide, L – prolyl, L – leucine, anhydride, L – prolyl – L – valine anhydride và desmethyl destruxin B. Destruxin A có công thức C29H47O7N5, bản chất hóa học là D – 2hydroxy – 4 – penteNry – L – prolyl L – isoleucyl – N – methyl – L – valyl – N – methyl – L – alanyl –  – alanyl lacton. Hợp chất này sôi ở 188°C. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Destruxin B có công thức C30H51O7N5, bản chất hóa học là D – α – hydroxy – γ – methylvaleryl – L – prolil – L – isoleucyl – N – methyl – L – valyl – N – methyl – L – alanyl – β – alanyl lacton. Điểm sôi của Destruxin B là 234°C. Những độc tố này được sinh ra từ các chất trao đổi sơ cấp nhờ quá trình chuyển hóa sinh hóa đặc biệt và được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm khi các nguồn thức ăn và năng lượng đã cạn dần (Bùi Cẩm Thu, 2009). Tuy nhiên, nấm Metarhizium anisopliae có thể cần các điều kiện thích hợp như nhiệt độ, ẩm độ, quá trình bệnh lý để hình thành độc tố (Nguyễn Văn Tuất, 2004). 2.2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về nấm Metarhizium anisopliae Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưa xác định được một loài vi nấm nào có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi như Metarhizium anisopliae. Nhiều loài nấm trong Chi Metarhizium có khả năng diệt côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles Setphensi, Clexpipiens thuộc bộ hai cánh Diptera, bọ xít đen hại lúa mì Scotiphora coarctata thuộc bộ cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc bộ cánh thẳng Orthoptera, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc Bộ cánh bằng Isoptera (Bùi Cẩm Thu, 2009). Pachamuthu et al. (1999) đã nghiên cứu độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên loài gián Đức Blattella germanica. Tử suất trung bình của các quần thể gián thí nghiệm từ 31 đến 86%, trong khi tỉ lệ này chỉ ở khoảng 16% đối với quần thể không được xử lý với chế phẩm nấm. Năm 2006, Toledo et al. đã nghiên cứu tác động của loài nấm này lên ruồi giấm Mexico Anastrepha luden và ruồi giấm Địa Trung Hải Ceratitis capitata bằng nhiều phương pháp khác nhau. Kết quả cho thấy loài nấm này có độc tính mạnh mẽ đối với ruồi giấm trưởng thành, tuy nhiên lại không cho kết quả đối với ấu trùng hoặc nhộng. Năm 2011, Ngumbi et al. đã nghiên cứu độc tính của loài nấm này lên loài ruồi Phlebotomus duboscqi với kết quả đến 76,8 – 100% ruồi bị nhiễm trên tất cả dòng nấm thử nghiệm. Năm 2012, Mnyone et al. đã thử nghiệm nấm Metarhizium anisopliae trên ấu trùng bọ chét Xenopsylla brasiliensis. Thí nghiệm cho kết quả khả quan về khả năng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ tác động của loài nấm này lên ấu trùng bọ chét, đến hơn 90% ấu trùng chết và tỉ lệ sống sót của ấu trùng sau xử lý giảm mạnh. Ở nước ta, trong giai đoạn đầu, các quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học Metarhizium nhằm phòng trừ các loại sâu hại như rầy nâu, châu chấu, cào cào, sâu róm, bọ cánh cứng đã đạt được nhiều kết quả đáng ghi nhận. Tuy nhiên, chế phẩm sản xuất còn thô, hạn chế cho việc phun rải, chất lượng chế phẩm vẫn còn chưa ổn định. Nghiên cứu đầu tiên về nấm Metarhizium anisopliae được Phạm Thị Thùy (2000) thực hiện trên đối tượng bọ dừa tại Bến Tre. Kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium sau khi thử nghiệm trong phòng, nhà lưới và ngoài đồng có hiệu quả tốt đối với bọ gây hại ở dừa (Trần Nhật Nam, 2007). Năm 2004, Nguyễn Văn Tuất đã thực hiện nghiên cứu cải tiến công nghệ, nâng cao chất lượng chế phẩm và mở rộng phạm vi ứng dụng. Kết quả thu được 18 chủng Metarhizium trên nhiều loại sâu bọ ở khắp các tỉnh thành trên đất nước. Trong đó có 2 chủng nấm xanh M. anisopliae ở miền Nam có hoạt lực diệt côn trùng rất cao, được các tỉnh trong khu vực xây dựng mô hình thử nghiệm và được Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long đưa vào sản xuất đại trà. Hiệu quả của chế phẩm đối với các loại sâu hại trên cây nhãn và dừa tại huyện Ô Môn (Cần Thơ) được tổng kết ở Bảng 1. Bảng 1: Hiệu quả của chế phẩm Metarhizium anisopliae đối với các loại sâu hại tại huyện Ô Môn (Cần Thơ) Hiệu lực (%) ở 10 ngày sau phun Loại sâu hại Năm 2001 Năm 2002 + 2003 Năm 2004 Rầy nâu hại lúa 78,55 86,42 90,87 Bọ xít hại lúa 69,31 75,29 72,46 Rầy chồng cánh hại cam quýt 71,10 68,75 73,14 Rầy mềm hại xoài 77,43 71,56 81,70 Bọ xít hại nhãn 72,14 80,65 75,23 Bọ cánh cứng hại dừa 85,42 80,75 90,69 (Nguồn: Nguyễn Văn Tuất, 2004) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ sinh học