Tài liệu Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin synflorix ™

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HÒA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HÒA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ Chuyên ngành : Động vật học (Vi sinh vật học) Mã số : 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Văn Hùng Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Văn Hùng. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng. Hà Nội, ngày 29/10/2015 Học viên Lê Thị Hòa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đươ ̣c bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c tới giáo viên hướng dẫn: TS. Phạm Văn Hùng, Phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình hướng dẫn và truyề n d ạy nhiều kiến thức quý báu đồ ng thời luôn đô ̣ng viên và t ạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trinh nghiên cứu và hoàn thành luâ ̣n văn. ̀ Tôi xin chân thành cảm ơn các th ầy, cô giáo và các đồng nghiệp tại Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, chia sẻ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình tôi học tập tại Viện. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các anh, chị đồng nghiệp Khoa Quản lý chất lượng Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế đã luôn động viên, chia sẻ và hỗ trợ công việc để tôi có điều kiện học tập và thực hiện tốt đề tài nghiên cứu và luận văn này. Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Ths. Lưu Anh Thư và các đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, phòng Tổ chức cán bộ, phòng Khoa học và Đào tạo đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc để tôi hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, tôi xin dành những tinh cảm thân thương nhấ t gửi tới gia đinh ̀ ̀ của tôi, những người đã luô n bên tôi , ủng hộ , đô ̣ng viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn ! Học viên Lê Thị Hòa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BSA Bovine Serum Albumin Huyết thanh bò CV Coefficient Variation Hệ số biến thiên DT Diphtheria toxoid Giải độc tố Bạch Hầu ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Phương pháp miễn dịch gắn assay Enzyme EU European Union Liên hiệp Châu âu GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt GSK Glaxo Smith Kline ICH IEC ISO IU International Conference on Hiệp hội quốc tế về hài hòa Harmonization kỹ thuật về Dược phẩm International Electrotechnical Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế Commission International Organization for Standardization Internationnal Unit Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Đơn vị quốc tế KKT Kháng kháng thể KN Kháng nguyên KT Kháng thể LAL Limulusamoebocyte lysate LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng OD Optic density Độ hấp thu của mẫu thử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PCV Pneumococcal Polysaccharide vaccine PD PPV Vắc xin phế cầu cộng hợp Protein D Pneumococcal polysaccharide Vắc xin phế cầu vaccine polysaccharide PS Polysaccharide SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SOP Standard Operating Procedure Qui trình chuẩn NICVB NTHi National Institute for Control of Viện kiểm định quốc gia vắc Vaccine and Biologicals Non-typeable H. influenzae xin và sinh phẩm y tế Haemophilus influenza không định týp Giá trị trung bình TB TMB Tetramethylbenzidine Cơ chất TRS Technical Report Series Báo cáo kỹ thuật TT Tetanus toxoid Giải độc tố uốn ván TTB Trang thiết bị WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới USP United States of Pharmacopeia Dược điển Mỹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................... 4 1.1. Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn ...................................... 4 1.1.1. Phế cầu khuẩn ........................................................................................... 4 1.1.2. Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn ......................................................... 7 1.2. Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™ ............................................................ 7 1.2.1. Vắc xin phế cầu ....................................................................................... 7 1.2.2. Vắc xin Synflorix™ ............................................................................... 10 1.3. Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu ......................... 15 1.3.1. Nguyên lý chung .................................................................................... 15 1.3.2. Một số phương pháp ELISA .................................................................. 15 1.4. Thẩm định quy trình......................................................................................... 18 1.4.1. Định nghĩa thẩm định quy trình ............................................................. 18 1.4.2. Phân loại thẩm định quy trình ................................................................ 19 1.4.3. Các thông số trong thẩm định quy trình ................................................. 23 1.5. Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM bằng phương pháp ELISA ............................................................ 27 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 28 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 30 2.3.1. Thiết kế thử nghiệm................................................................................ 30 2.3.2. Cỡ mẫu ................................................................................................... 30 2.3.3. Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM bằng phương pháp ELISA ................................................. 30 2.3.4. Xây dựng quy trình thẩm định cho từng thông số và tiêu chuẩn chấp thuận của từng thông số cần thẩm định ................................................. 34 2.3.5.Cách tính toán giá trị cut-off cho từng thông số...................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................... 37 3.1. Giới hạn phát hiện ............................................................................................ 37 3.2. Độ mạnh ........................................................................................................... 44 3.3. Độ đặc hiệu ...................................................................................................... 48 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 60 4.1. Thử nghiệm có giá trị ....................................................................................... 60 4.2. Giới hạn phát hiện ............................................................................................ 60 4.3. Độ mạnh ........................................................................................................... 62 4.4. Độ đặc hiệu ...................................................................................................... 63 KẾT LUẬN .................................................................................................... 64 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin Synflorix™ . 11 Bảng 1.2. Các thông số dùng trong thẩm định toàn phần ............................. 20 Bảng 1.3. Các thông số dùng trong thẩm định một phần .............................. 21 Bảng 1.4. Các thông số dùng trong tái thẩm định ......................................... 22 Bảng 1.5. Các thông số dùng trong thẩm định .............................................. 26 Bảng 2.1. Mẫu chuẩn, hóa chất sử dụng cho thí nghiệm .............................. 28 Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho thí nghiệm..................................... 29 Bảng 2.3. Công thức tính giá trị cut-off cho từng thông số .......................... 36 Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 37 Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 38 Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 38 Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 39 Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F qua 6 lần thử nghiệm ............................................................ 40 Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 5 qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 40 Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 41 Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C qua 6 lần thử nghiệm ............................................................ 42 Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B qua 6 lần thử nghiệm..................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F qua 6 lần thử nghiệm ............................................................ 43 Bảng 3.11. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu ... 45 Bảng 3.12. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên do 2 người thực hiện ............................................................................. 47 Bảng 3.13. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 của 3 mẫu thử ......................................................................................... 49 Bảng 3.14. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 của 3 mẫu thử ......................................................................................... 50 Bảng 3.15. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F của 3 mẫu thử ......................................................................................... 51 Bảng 3.16. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 của 3 mẫu thử ......................................................................................... 52 Bảng 3.17. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F của 3 mẫu thử ......................................................................................... 53 Bảng 3.18. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng týp 5 của 3 mẫu thử ........... 54 Bảng 3.19. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V của 3 mẫu thử ......................................................................................... 55 Bảng 3.20. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C của 3 mẫu thử ......................................................................................... 56 Bảng 3.21. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B của 3 mẫu thử ......................................................................................... 57 Bảng 3.22. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F của 3 mẫu thử ......................................................................................... 58 Bảng 4.1. Giới hạn phát hiện của từng týp kháng nguyên phế cầu............... 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình thái của phế cầu Streptococcus pneumoniae sau khi nhuộm Gram dưới kính hiển vi .................................................................. 5 Hình 1.2. Hình ảnh một số bệnh gây bởi phế cầu Streptococcus pneumoniae . 7 Hình 1.3. Hình ảnh của vắc xin vỏ phế cầu Pneumo 23 ................................... 9 Hình 1.4. Hình ảnh của vắc xin phế cầu cộng hợp Synflorix™....................... 10 Hình 1.5. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin Synflorix™ .................... 12 Hình 1.6. Kỹ thuật ELISA trực tiếp ................................................................ 16 Hình 1.7. Kỹ thuật ELISA gián tiếp................................................................ 16 Hình 1.8. Kỹ thuật ELISA Sandwich trực tiếp ............................................... 17 Hình 1.9. Kỹ thuật ELISA Sandwich gián tiếp ............................................... 17 Hình 1.10. Kỹ thuật ELISA cạnh tranh ........................................................... 17 Hình 2.1. Tóm tắt quy trình nhận dạng týp kháng nguyên phế cầu ................ 31 Hình 3.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của 10 týp kháng nguyên phế cầu ................................................................................................. 44 Hình 3.2. Kết quả nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu .......................... 46 Hình 3.3. Kết quả xác định độ đặc hiệu của quy trình .................................... 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Có thể tổng kết trong suốt hai thế kỷ vừa qua, với sự phát minh của Bác sĩ người Anh E. Jenner ra chủng đậu bò dùng phòng ngừa dịch đậu mùa vào cuối thế kỷ 18, từ nền tảng khoa học đó suốt giai đoạn 1857-1885 nhà bác học thiên tài người Pháp L. Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vắc xin phòng bệnh than, bệnh dại và nhiều vắc xin khác tạo ra một trường phái riêng về sử dụng vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm tồn tại cho tới ngày nay [5]. Với những thành tựu đạt được về phòng chống và thanh toán bệnh truyền nhiễm bằng tiêm phòng vắc xin như bại liệt, uốn ván sơ sinh, bạch hầu, viêm gan B... , hiện nay Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận và khuyến cáo trên toàn cầu rằng tiêm phòng vắc xin là phương thức bảo vệ hiệu quả nhất giúp nhân loại tránh được các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho cộng đồng. Khoa học công nghệ ngày càng phát triển trong các lĩnh vực vi sinh, miễn dịch, sinh học phân tử, di truyền, hóa, lý, tin học và công nghệ nano, peptid, gene và protein đã hỗ trợ đắc lực cho công cuộc nghiên cứu và sản xuất ra nhiều loại vắc xin an toàn, hiệu quả và tiện lợi sử dụng hơn. Vắc xin học cũng đã tiếp cận sang nhiều lĩnh vực mới như bệnh dị ứng, bệnh xã hội, các bệnh nan y (ung thư, HIV/AIDS), bệnh ký sinh trùng (sốt rét) và đạt nhiều thành quả đáng kể. Vắc xin là chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật, được làm mất khả năng gây bệnh hoặc từ vật liệu sinh học không phải vi sinh vật nhưng có khả năng kích thích sự hình thành miễn dịch đặc hiệu để chống đỡ các mầm bệnh tương ứng hoặc được dùng với mục đích khác, vắc xin dùng để bảo vệ cho toàn thể cộng đồng người [6],[7]; Vì vậy việc kiểm soát chất lượng vắc xin trước và trong quá trình sử dụng, bảo quản là đặc biệt quan trọng và phải tuân 1 thủ theo các yêu cầu khắt khe theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cũng như tiêu chuẩn của Dược điển của các quốc gia, khu vực toàn cầu. Theo qui định chung, tất cả các loạt vắc xin và sinh phẩm y tế trước khi cấp phép xuất xưởng để sử dụng với mục đích phòng bệnh đều phải được kiểm định nghiêm ngặt về chất lượng với các tiêu chí như: tính chất vật lý, an toàn, nhận dạng đặc hiệu, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt, và các đặc tính về hoá lý [19]. Một trong các loại vắc xin công nghệ mới được sử dụng hiện nay là vắc xin SynflorixTM phòng bệnh do phế cầu (Streptococcus Pneumoniae) gây ra như: Viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm màng não.. đã được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong. Vắc xin Synflorix™ là một vắc xin Polysaccharide cộng hợp với Protein D của Haemophilus influenzae không định týp (NTHi) và giải độc tố Bạch hầu và Uốn ván, hấp phụ với nhôm phosphate, giúp bảo vệ trẻ nhỏ phòng được các bệnh gây bởi 10 týp kháng nguyên phế cầu (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) [26]. Khoảng 40% quốc gia và lãnh thổ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng vắc xin cộng hợp phế cầu (PCV) đang sử dụng vắc xin Synflorix™. Tại Việt Nam, Synflorix™ là vắc xin được nhập khẩu từ nhà sản xuất GSK. Để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng, việc đảm bảo chất lượng vắc xin là rất quan trọng. Quy trình kiểm định chất lượng vắc xin gồm rất nhiều chỉ tiêu, trong đó thử nghiệm nhận dạng là một trong những chỉ tiêu quan trọng; Tuy nhiên thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ chưa được thẩm định và chưa được xác nhận giá trị sử dụng theo tiêu chuẩn của ISO 17025, theo tổ chức Y tế thế giới. 2 Chính vì vậy, với mục đích sử dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa trong vắc xin Synflorix™ áp dụng tại phòng kiểm định của NICVB. Chúng tôi tiến hành đề tài “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™”. Với mu ̣c tiêu cu ̣ thể như sau: 1. Đánh giá độ mạnh của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. 2. Đánh giá độ đ ặc hiệu của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. 3. Giới hạn phát hiện của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn 1.1.1. Phế cầu khuẩn Hình thái: Phế cầu-Streptococcus pneumoniae là thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng cũng là một tác nhân chủ yếu của viêm phổi và viêm màng não ở trẻ em và người lớn [40]. S. pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae hoặc pneumococcus (phế cầu khuẩn) là một tác nhân gây bệnh ở người được phân lập đầu tiên ở Pháp bởi LouisPasteur năm 1880 từ mủ apxe. Năm 1883, Talamon (Pháp) phát hiện được phế cầu khuẩn trong đờm, trong máu và trong khối viêm phổi gan hóa của bệnh nhân và mô tả nó. Vai trò của phế cầu gây viêm màng não cấp đã được Netter phát hiện vào năm 1909 khi quan sát thấy hội chứng nhiễm trùng thần kinh trung ương ở một số người bệnh có triệu chứng viêm phổi nặng [40]. Các chủng phế cầu khác nhau có thể được phân biệt nhờ vào cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ polysaccharide bao bọc bên ngoài tế bào. Lớp vỏ polysaccharide tạo nên 1 trong những đặc tính của vi khuẩn khi phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo + Pneumococcus dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích thước 1mm, mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có khả năng gây bệnh. + Pneumococcus dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ polysaccharide (có thể do điều kiện nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoặc nuôi cấy trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề 4 mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô...những phế cầu này ít có khả năng gây bệnh [40]. Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh. Ngược lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất ADN của dạng S. Trên môi trường thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ướt do vi khuẩn có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của enzym ly giải [40]. Phế cầu - Streptococcus pneumoniae là những cầu khuẩn dạng ngọn nến, thường xếp đôi, đường kính khoảng 0,5 – 1,25 μm; là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào; trong bệnh phẩm hay môi trường chứa nhiều albumin thì có vỏ [1],[9]. Hình 1.1. Hình thái của phế cầu Streptococcus pneumoniae sau khi nhuộm Gram dưới kính hiển vi 5 Tính chất nuôi cấy: Vi khuẩn phế cầu phát triển thích hợp ở 370C trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí tùy tiện; phát triển dễ dàng trong các môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng. Trên thạch máu, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trơn trong như giọt sương, xung quanh có vòng tan máu alpha. Trên môi trường nghèo dinh dưỡng, phế cầu kém phát triển, khuẩn lạc thô, nhỏ, xù xì, những khuẩn lạc có vỏ thường lớn, hơi nhày và có màu xám nhẹ. Có thể có khuẩn lạc trung gian M [1],[9]. Tính chất hóa sinh: Phế cầu bị ly giải bởi muối mật, hoặc mật; không có catalase; không phát triển trong môi trường có ethylhydrocuperin [1],[9]. Bốn tính chất quan trọng để xác định phế cầu là: - Catalase ( -) - Optochin (+) - Bị ly giải trong muối mật - Tan máu α Phế cầu được lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết hô hấp của người bệnh. Vỏ của Streptococcus pneumoniae là nhân tố gây bệnh chủ yếu, vỏ phế cầu bao gồm các polysaccharide, chúng tạo thành các gel và nước trên tế bào vi khuẩn. Vỏ phế cầu có tác dụng bão hòa opsonin hóa, làm vô hiệu hóa tác dụng của IgG và bổ thể. Do vậy khả năng thực bào vi khuẩn bị giảm xuống và phế cầu vẫn tồn tại để gây bệnh [1],[9]. Tính chất kháng nguyên: Vỏ Polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất được biết. Hiện có trên 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn (pneumococci) đã được nhận biết. Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh. Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong 6 tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân. Phức hợp Polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate [43]. 1.1.2. Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn Phế cầu gây ra các bệnh lý xâm lấn nghiêm trọng như viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm xoang và những bệnh không xâm lấn thông thường như viêm tai giữa... [23]. Hình 1.2. Hình ảnh một số bệnh gây bởi phế cầu Streptococcus pneumoniae 1.2. Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™ 1.2.1. Vắc xin phế cầu Theo tổ chức Y tế Thế giới, ước lượng hàng năm có khoảng 476.000 trường hợp tử vong do bệnh phế cầu ở trẻ em dưới 5 tuổi [38]. 7 Nhiễm phế cầu là nguyên nhân chính gây tử vong và gánh nặng bệnh tật ở trẻ em trên toàn thế giới đặc biệt là các nước đang phát triển [14]. Ở Việt Nam tỷ lệ mắc phải bệnh phế cầu xâm lấn được ước tính ít nhất là: 48,7 ca/100.000 trẻ em dưới 5 tuổi theo nghiên cứu trước đây được tiến hành tại tỉnh Khánh Hòa năm 2005-2006 [13]. Các týp kháng nguyên phế cầu phổ biến nhất được phát hiện ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà nội giữa những năm 1997-1999 là: các týp 23F, 19F,6B và 14 [15]. Theo một nghiên cứu hồi cứu vào năm 2008-2009 sự phân bố các týp kháng nguyên tương tự được quan sát ở những người Việt Nam mắc bệnh ở tất cả các lứa tuổi cho thấy các týp kháng nguyên phế cầu chủ yếu là các týp: 19F, 23F, 14,11 và 6B [22]. Do phế cầu thường lây theo đường hô hấp nên việc phòng bệnh không đặc hiệu rất khó khăn [18]. Phòng bệnh đặc hiệu đã được sử dụng ở một số nước bằng vắc xin polysaccharide của vỏ phế cầu. Trên thế giới, có rất nhiều sản phẩm thương mại vắc xin phòng bệnh gây ra bởi phế cầu: Synflorix™ (GSK), Pneumo 23 (Sanofi Pasteur), Prevenar (Phzer) [18]. Có 2 loại vắc xin phế cầu: vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu và vắc xin phế cầu cộng hợp [18]. Vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu (PPV – Pneumococcal polysaccharide vaccine) được cấp phép sử dụng từ năm 1977. Những vắc xin này gây ra được miễn dịch nhớ, nhưng với trẻ em dưới 2 tuổi lại không tạo đáp ứng miễn dịch [30]. Vắc xin Pneumo 23 do hãng Sanofi Pasteur sản xuất là vắc xin polysaccharide vỏ phế cầu, chứa 23 týp kháng nguyên: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F. Vắc xin này được sử dụng cho người trên 2 tuổi có nguy cơ cao nhiễm phế cầu: người già trên 65 tuổi, người bị HIV, người giảm đáp ứng miễn dịch, người nghiện rượu, nghiện thuốc lá...[18], đang được lưu hành trên thị trường Việt Nam. 8 Hình 1.3. Hình ảnh của vắc xin vỏ phế cầu Pneumo 23 Vắc xin phế cầu cộng hợp (PCV – Pneumococcal conjugate vaccine) gồm các polysaccharide của vỏ vi khuẩn Streptococcus pnemoniae được cộng hợp với protein mang. Bằng việc sử dụng công nghệ cộng hợp, kháng nguyên polysaccharide làm cho tế bào T đáp ứng miễn dịch, khả dụng đối với trẻ nhỏ. Khác với vắc xin polysaccharide vỏ phế cầu, PCV bảo vệ được trẻ dưới 2 tuổi. PCV phòng được các bệnh phế cầu nặng như: Viêm màng não, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm tai giữa... PCV không bảo vệ được trong trường hợp bệnh gây bởi loại kháng nguyên khác, hoặc các týp kháng nguyên không có trong vắc xin PCV. Vắc xin cộng hợp đầu tiên Prevnar 7 gồm 7 týp kháng nguyên (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F và 23F) được cộng hợp với protein CRM197 đã được cho phép sử dụng tại EU (2001) cho trẻ từ 2 tháng tuổi. Hai loại vắc xin thế hệ sau được sử dụng từ năm 2009 là Synflorix™ gồm 10 týp kháng nguyên (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) và Prevnar 13 gồm 13 týp kháng nguyên (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, and 23F) [17],[18]. 9