Tài liệu Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng rhodaminb bằng phương pháp hplc và ứng dụng phân tích hóa chất này trong một số loại thực phẩm trên địa bàn thành phố hải dương

NGUYỄN ĐỨC HOÀNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------- NGUYỄN ĐỨC HOÀNG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RHODAMINB BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH HOÁ CHẤT NÀY TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHOÁ 2011-2013 Hà Nội – Năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------NGUYỄN ĐỨC HOÀNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RHODAMINB BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH HOÁ CHẤT NÀY TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. TS. VŨ HỒNG SƠN 2. TS. TRẦN QUANG CẢNH Hà Nội – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp, những người thân trong gia đình và các cơ quan có liên quan. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn hai thầy hướng dẫn: Tiến sĩ Vũ Hồng Sơn, Tiến sĩ Trần Quang Cảnh đã tận tình hướng dẫn, động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn nghiên cứu này. Tôi vô cùng biết ơn Tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm- trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Labo Xét nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm, Bộ môn Xét nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm- Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, cho tôi cơ hội được đi học chuyên sâu về xét nghiệm Hoá-Độc, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến những người thân yêu trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi về tinh thần và vật chất để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn bè, đồng nghiệp gần xa, đặc biệt là các anh chị em cùng khóa, những người đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Lời cảm ơn sâu sắc sau cùng, tôi xin gửi tới Vợ và Con gái tôi. Những người luôn dành cho tôi tình cảm yêu thương chân thành nhất, những người luôn sát cánh, gần gũi, động viên và chia sẻ, giúp tôi có đủ nghị lực vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống để tôi làm việc, học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Nguyễn Đức Hoàng I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, luận văn này là kết quả nghiên cứu và làm việc của tôi, các kết quả, số liệu của luận văn là trung thực, thực tế tại nơi nghiên cứu. Hải Dương, tháng 09 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hoàng Học viên cao học khoá học 2011-2013 Chuyên môn xét nghiệm Hoá-Độc II MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………… I LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………………….. II MỤC LỤC…………………………………………………………………............. III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................ VII DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………………… VIII DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ.................................................................... X DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ..................................................................... XI ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………... 1 Chương 1 - TỔNG QUAN………………………………………………………… 3 1.1. Đặc điểm RhodaminB………………………………………………………… 3 1.2. Độc tính của RhodaminB…………………………………………………….. 4 1.3. Giới hạn cho phép của RhodaminB trong thực phẩm, dược phẩm.................... 4 1.4. Một số kỹ thuật phân tích RhodaminB………………………………………... 4 1.5.Tổng quan về sắc ký lỏng……………………………………………………… 6 1.5.1.Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC....................................................... 6 1.5.2.Cấu tạo của hệ thống HPLC............................................................................ 6 1.5.3.Quá trình sắc ký................................................................................................ 9 1.5.4.Các yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký..................................................... 10 1.5.5. Tốc độ di chuyển của các chất ....................................................................... 10 1.5.6.Sự doãng peaks và hình dáng peaks................................................................. 11 1.5.7. Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết..................................................................... 12 1.6.Ứng dụng của sắc ký (HPLC) trong phân tích.................................................... 13 1.6.1. Định tính và thử độ tinh khiết ......................................................................... 13 1.6.2. Định lượng....................................................................................................... 14 III Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………............... 17 2.1.Thời gian và địa điểm thực hiện.......................................................................... 17 2.2.Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………….. 17 2.3.Thiết bị và dụng cụ............................................................................................. 17 2.4.Hoá chất và mẫu.................................................................................................. 18 2.5. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………............ 21 2.5.1.Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ..................................................... 21 2.5.2.Phương pháp xác định RhodaminB.................................................................. 23 2.5.3.Cải tiến phương pháp xác định RhodaminB…………………………................. 23 2.6.Phương pháp thẩm định....................................................................................... 25 2.6.1. Lựa chọn các thông số tối ưu của phương pháp với thiết bị ……………….. 25 2.6.2.Khoảng tuyến tính và đường chuẩn………………………………………............ 27 2.6.3.Xác định độ lặp lại- Độ chụm........................................................................... 29 2.6.4.Xác định độ đúng.............................................................................................. 30 2.6.5.Xác định giới hạn phát hiện (LOD),giới hạn định lượng (LOQ)..................... 31 2.7.Phương pháp tính toán và xử lý số liệu .............................................................. 33 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………….. 34 3.1. Kết quả tối ưu hoá các điều kiện phân tích trên HPLC……………………….. 34 3.1.1. Chọn loại pha tĩnh và cột................................................................................ 34 3.1.2. Kết quả kiểm tra và chọn bước sóng tối ưu..................................................... 34 3.1.3. Kết quả chọn hệ dung môi và tỉ lệ pha động................................................... 35 3.1.4.Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống................................................ 39 3.2.Quy trình phân tích ……………………………………………............ 40 3.3.Kết quả xử lý mẫu để tìm thời gian và nhiệt độ tối ưu........................................ 41 3.3.1.Kết quả thực hiện gia nhiệt, rung siêu âm ở 60 oC với thời gian 15, 30, 45, IV 42 60 phút....................................................................................................................... 3.3.2. Kết quả thực hiện gia nhiệt, rung siêu âm ở 70 oC ở thời gian 15, 30, 45, 60 phút....................................................................................................................... 44 3.3.3.Kết quả thực hiện gia nhiệt và rung siêu âm ở 80 oC ở các chế độ thời gian 15, 30, 45 phút........................................................................................................... 46 3.4.Kết quả tìm lượng dung môi tối ưu cần dùng để xử lý mẫu…………………… 49 3.5. Quy trình phân tích của nghiên cứu…………………………………………... 52 3.6.Thẩm định phương pháp đã cải tiến.................................................................... 54 3.6.1. Xây dựng các đường chuẩn............................................................................. 54 3.6.2.Xác định độ lặp lại–độ chụm với 3 loại mẫu hạt dưa, ớt bột, thịt bò khô ....... 55 3.6.3.Xác định độ đúng với 3 loại mẫu hạt dưa, ớt bột, thịt bò khô......................... 58 3.6.4. Xác định LOD, LOQ........................................................................................ 59 3.7. Ứng dụng phân tích RhodaminB trong một số loại Thực phẩm trên địa bàn thành phố Hải Dương ............................................................................................... 67 3.7.1.Kết quả phân tích các mẫu hat dưa.................................................................. 67 3.7.2.Kết quả phân tích các mẫu ớt bột..................................................................... 68 3.7.3.Kết quả phân tích một số sản phẩm từ ớt bột (muối ớt)................................... 69 3.7.4.Kết quả phân tích các mẫu thịt bò khô............................................................. 69 BÀN LUẬN………………………………………………………………………... 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 75 Kết luận..................................................................................................................... 75 Kiến nghị................................................................................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 78 PHỤ LỤC.................................................................................................................. A Phụ lục 1: Lập đường chuẩn với các trường hợp........................................... A Phụ lục 2: Kết quả xử lý số liệu khi đánh giá sự phù hợp của hệ thống.................. C V Phụ lục 3: Bảng kết quả chi tiết tính độ thu hồi khi xử lý mẫu ở chế độ 60oC/15, 30, 45, 60 phút........................................................................................................... D Phụ lục 4: Bảng tính độ thu hồi khi xửa lý mẫu ở chế độ 70oC /15, 30, 45, 60 phút E Phụ lục 5: Bảng tính độ thu hồi khi xử lý mấu ở chế độ 80oC/15, 30, 45 phút ........ F Phụ lục 6: Bảng tính kết quả thực hiện sử dụng 100 mL và 50 mL để định mức cuối cùng sau khi xử lý mẫu...................................................................................... G Phụ lục 7: Bảng tính độ chụm tích khi phân tích mẫu hạt dưa................................. H Phụ lục 8: Bảng tính độ chụm tích khi phân tích mẫu ớt bột.................................... I Phụ lục 9: Bảng tính độ chụm tích khi phân tích mẫu thịt bò khô............................ J Phụ lục 10: Bảng tính kết quả độ thu hồi khi thẩm định mẫu hạt dưa...................... K Phụ lục 11: Bảng tính kết quả độ thu hồi khi thẩm định mẫu ớt bột......................... K Phụ lục 12: Bảng tính kết quả độ thu hồi khi thẩm định mẫu thịt bò khô................. L Phụ lục 13: Kết quả đánh giá 15 mẫu hạt dưa.......................................................... M Phụ lục 14: Kết quả đánh giá tiếp 15 mẫu hạt dưa ở khu vực TP Hải Dương......... O Phụ lục 16: Kết quả đánh giá tiếp 15 mẫu ớt bột ở khu vực TP Hải Dương............ R Phụ lục 17: Kết quả đánh giá 15 mẫu thịt bò khô ở khu vực TP Hải Dương........... S Phụ lục 18: Kết quả đánh giá tiếp 5 mẫu thịt bò khô ở khu vực TP Hải Dương. U Phụ lục 19: Một số hình ảnh trong nghiên cứu......................................................... V Phụ lục 20: Kết quả xác định hàm lượng RhodaminB trong hạt dưa và hạt điều tại Labo XNATVSTP.................................................................................................. VI AA DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitril AOAC: Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức) CRM: Certified reference material (Mẫu chuẩn được chứng nhận) DAD: Diode Array Detector (Detector mảng diod) EI: Electron Impact (Va đập điện tử) GC: Gas chromatography (Sắc ký khí) HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) R (%): Độ thu hồi (đơn vị %) KPH: Không phát hiện (nhỏ hơn ngưỡng phát hiện của phương pháp) MeOH: Methanol MS: Mass spectrometry (Khối phổ) LOD: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) S/N: Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu) SOP: Standard Operation Procedure (Quy trình thao tác chuẩn) ppm: Nồng độ ppm (mg/kg) QC: Quality control (Kiểm tra chất lượng). RM: Reference material (Vật liệu chuẩn / đối chiếu) RSD: Hệ số biến sai USP: United States Phamacopeia (Dược điển Mỹ) USFDA: United States Food and Drug Administration (Cục dược phẩm và thực phẩm Mỹ) UV-VIS: Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến) TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam. VII DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)… 30 Bảng 2.2. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC………….. 31 Bảng 2.3. Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu…………………………... 31 Bảng 3.1. Tính chất của 1 số loại dung môi dùng làm pha động………............... 35 Bảng 3.2. Kết quả tìm thành phần, tỉ lệ dung môi pha động................................. 36 Bảng 3.3. Điều kiện chạy sắc ký tối ưu.................................................................. 39 Bảng 3.4. Kết quả tính toán sự phù hợp của hệ thống........................................... 40 Bảng 3.5. Độ thu hồi khi xử lý mẫu ở chế độ 60oC/15, 30, 45, 60 phút................ 43 Bảng 3.6. Độ thu hồi khi xửa lý mẫu ở chế độ 70oC /15, 30, 45, 60 phút............. 45 Bảng 3.7. Độ thu hồi khi xử lý mấu ở chế độ 80oC/15, 30, 45 phút ..................... 47 Bảng 3.8. Độ thu hồi khi xử lý mẫu ở nhiệt độ 60, 70, 80 oC/15, 30, 45, 60 phút ...... 48 Bảng 3.9. Kết quả sử dụng bình định mức 100 mL và 50 mL để định mức sau khi xử lý mẫu......................................................................................................... 50 Bảng 3.10. Kết quả độ chụm khi thẩm định hạt dưa, ớt bột và thịt bò khô .......... 56 Bảng 3.11. Xác định độ đúng với 3 loại mẫu hạt dưa, ớt bột, thịt bò khô............ 58 Bảng 3.12. Xác định LOD của hạt dưa ................................................................. 60 Bảng 3.13. Xác định LOD của hạt dưa (thực hiện thêm 3 mẫu) ........................... 61 Bảng 3.14. Xác định LOD của ớt bột..................................................................... 62 Bảng 3.15. Xác định LOD của ớt bột (thực hiện thêm 3 mẫu)............................. 63 Bảng 3.16. Xác định LOD của thịt bò khô............................................................. 64 Bảng 3.17. Xác định LOD của thịt bò khô (thực hiện thêm 3 mẫu)....................... 65 Bảng 3.18. Tổng hợp các kết quả thẩm định.......................................................... 66 Bảng 3.19. Kết quả phân tích các mẫu hat dưa..................................................... 67 Bảng 3.20.Kết quả phân tích các mẫu ớt bột......................................................... 68 Bảng 3.21. Kết quả phân tích một số sản phẩm từ ớt bột (muối ớt)...................... VIII 69 Bảng 3.22.Kết quả phân tích các mẫu thịt bò khô................................................. 69 Bảng 3.23.Kết quả phân tích tổng hợp các mẫu.................................................... 70 Bảng 3.24.Những điểm mới-sáng tạo trong nghiên cứu........................................ 72 IX DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích RhodaminB trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 10 ppm (khi xử lý mẫu ở 60oC/15, 30, 45, 60 phút) ..... 42 Biểu đồ 3.2. Biểu thị độ thu hồi khi xử lý mẫu ở 60oC ỏ thời gian 15, 30, 45, 60 phút và mẫu đối chứng................................................................................................ 44 Đồ thị 3.3. Biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích RhodaminB trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 10 ppm (khi xử lý mẫu ở 70oC/15, 30, 45, 60 phút) ..... 44 Đồ thị 3.4. Biểu thị độ thu hồi khi xử lý mẫu ở 70oC với thời gian 15, 30, 45, 60 phút và mẫu đối chứng................................................................................................ 46 Đồ thị 3.5. Biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích RhodaminB trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 10 ppm (khi xử lý mẫut ở 80oC/15,30,45 phút) ............ 46 Đồ thị 3.6. Biểu thị độ thu hồi khi xử lý mẫu ở 80 độC /15, 30, 45 phút và mẫu đối chứng.......................................................................................................................... 48 Đồ thị 3.7. Biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích RhodaminB trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 10 ppm (khi thực hiện tìm lượng dung môi tối ưu dùng để xử lý mẫu)............................................................................................................... 49 Đồ thị 3.8. Biểu thị độ thu hồi khi dùng bình định mức 100 và 50 mL để định mức sau khi xử lý mẫu........................................................................................................ 51 Các đồ thị 3.9. Xây dựng các đồ thị để lập đường chuẩn (khi thẩm định 3 loại mẫu là hạt dưa, ớt bột và thịt bò khô)................................................................................ 54 Đồ thị 3.10. Biểu thị % mẫu dương tính của RhodaminB đối với 3 đối tương mẫu nghiên cứu và 1 đối tượng khảo sát............................................................................ 70 X DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Hình 1.1. Màu sắc của mẫu có chứa RhodaminB và dung dịch RhodaminB ở các nồng độ khác nhau...................................................................................................... 3 Hình 1.2. Cấu tạo hệ thống HPLC............................................................................. 7 Hình 1.3. van tiêm mẫu, thể tích của vòng bơm mẫu 20 µL....................................... 8 Hình 1.4: Sắc đồ một chất.......................................................................................... 10 Hình 1.5. tính bất đối của peaks................................................................................. 11 Hình 1.6 Peaks sắc ký (a) so sánh với đường cong phân bố chuẩn Gauss (b)......... 12 Hình 1.7. R S và sự tách 2 peaks............................................................................... 13 Hình 2.1. HPLC 1120 hãng Agilent............................................................................ 18 Hình 2.2. HPLC 1200 hãng Agilent............................................................................ 18 Hình 2.3. Máy lắc và máy ly tâm................................................................................ 18 Hình 2.4. Bể rung siêu âm có gia nhiệt và các ồng ly tâm (đang xử lý mẫu)............. 18 Hình 2.5. Dụng cụ thuỷ tinh........................................................................................ 18 Hình 2.6. Cân phân tích.............................................................................................. 18 Hình 2.7. Dung dịch chuẩn gốc và các dung dịch chuẩn làm việc............................. 20 Hình 2.8. Mẫu hạt dưa dùng để phân tích.................................................................. 22 Hình 2.9. Mẫu thịt bò khô dùng để phân tích............................................................ 22 Hình 2.10. Mẫu ớt bột dùng để phân tích................................................................... 23 Sơ đồ 2.11. Sơ đồ quy trình phân tích theo TCVN 8670:2011.................................. 24 Hình 2.12 đường chuẩn trên nền mẫu thực……………………………………………… 28 Hình 2.13. Xác định LOD bằng cách tính S/N…………………………………….......... 32 Hình 3.1. Hình ảnh 3D của RhodaminB khi tìm bước sóng tối ưu ở nồng độ 5ppm.. 34 Sơ đồ 3.2. Quy trình dự kiến phân tích cải tiến.......................................................... 44 Sơ đồ 3.3. Quy trình phân tích của nghiên cứu ......................................................... 52 XI ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, bên cạnh sự đòi hỏi về cân bằng dinh dưỡng của các loại thực phẩm thì vấn đề an toàn thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu. Chất lượng thực phẩm nói chung và chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm nói riêng có ảnh hưởng trực tiếp đối với sức khỏe của con người. Nó còn có liên quan mật thiết đối với sự hưng thịnh của các hoạt động thương mại, văn hóa, đối với nền an ninh chính trị xã hội và đối với sự trường tồn của giống nòi, của một dân tộc. Bởi vây vấn đề an toàn thực phẩm có thể là một trong những nguồn động lực quyết định sự phát triển của nhân loại. Tuy nhiên, tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) tại Việt Nam vẫn đang gây nhiều lo lắng cho người dân. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ở Việt Nam hàng năm có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD (khoảng 4000 tỷ VND). Thực chất, nhiều sự kiện như việc tiếp tục sử dụng những hóa chất cấm dùng trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, việc sản xuất một số sản phẩm kém chất lượng do quy trình chế biến hoặc do nhiễm độc từ môi trường đang gây ảnh hưởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng. Hiện nay, Rhodamin B - một loại chất hoá học dùng để nhuộm quần áo, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm để xét nghiệm tế bào hay nhuộm huỳnh quang... được sử dụng để tạo màu thực phẩm, do đó có thể gây ra suy gan, thận và ung thư cho những người ăn phải những thực phẩm này. Qua một số nghiên cứu cho thấy Rhodamin B có nguy cơ xuất hiện trong nhiều sản phẩm lương thực xuất phát từ việc dùng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học. Bên cạnh đó, một số loại dầu thực vật cũng phát hiện thấy hóa chất phát quang này, nguyên nhân có thể do sử dụng thuốc trừ sâu trong quá trình chăm sóc. Trong công nghệ sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng RhodaminB trong các loại gia vị như: hạt dưa, bột ớt, bột điều, sa tế hay thịt bò khô... nhằm giúp sản phẩm có màu sắc đẹp hơn, hấp dẫn hơn đối với người tiêu dùng và không đòi hỏi chi phí lớn. Thêm vào đó, sử dụng RhodaminB còn nhằm mục đích khôi phục màu đã mất trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm và điều chỉnh màu sắc tự nhiên hoặc gia 1 tăng màu sắc của thực phẩm tới mức độ cần thiết. Vì vậy, để ngăn chặn việc sử dụng RhodaminB trong chế biến thực phẩm, Bộ y tế đã ra quyết định cấm triệt để không được sử dụng hóa chất này trong tất cả các khâu liên quan đến quá trình sản xuất lương thực, thực phẩm và dược phẩm. Thị trường thực phẩm hiện nay rất đa dạng và phức tạp, theo số liệu gửi về Cục An toàn vệ sinh Thực phẩm và những kết quả phân tích của Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia cho thấy có có năm lên tới 80-100% mẫu hạt dưa (tùy từng tỉnh) bị nhuộm chất RhodaminB. Trong bối cảnh đó, một số nghiên cứu đưa ra được quy trình xác định từ định tính tới định lượng với những điều kiện cụ thể khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu đó vẫn chưa đưa ra được thực trạng sử dụng RhodaminB tại các địa phương hiện nay. Mặt khác, mỗi quy trình khi áp dụng vào thực hiện đều có những đều kiện khác nhau từ con người trang thiết bị, hoá chất cụ thể của phòng kiểm nghiệm. Vì vậy, mỗi phòng kiểm nghiệm phải xây dựng quy trình tiến hành phù hợp, có độ tin cậy cao, tiết kiệm thời gian, tiết kiệm hoá chất và thực hiện dễ dàng. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng RhodaminB bằng phương pháp HPLC và ứng dụng phân tích hoá chất này trong một số loại thực phẩm trên địa bàn thành phố Hải Dương “ với các mục tiêu: 1. Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng RhodaminB trong mẫu phân tích. 2. Ứng dụng quy trình xác định hàm lượng RhodaminB trong một số loại thực phẩm trên thị trường thành phố Hải Dương. 2 1.1. Đặc điểm RhodaminB Chương 1 TỔNG QUAN Rhodamin B là loại thuốc nhuộm tổng hợp dạng tinh thể, có màu nâu đỏ, ánh xanh lá cây, công thức là C 28 H 31 ClN 2 O 3 , dễ hòa tan trong nước, cồn. Khi hòa tan, dung dịch có màu đỏ, phát huỳnh quang ánh xanh lục khối. RhodaminB có nhiệt độ nóng chảy là 165oC, khối lượng phân tử là 479,02g/mol [22]. Hình 1.1. Màu sắc của mẫu có chứa RhodaminB và dung dịch RhodaminB ở các nồng độ khác nhau RhodaminB có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm xuất phát từ cây trồng có dùng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học hoặc được tạo màu trong sản xuất để đẹp hơn, làm cho sản phẩm hấp dẫn hơn. Một số thực phẩm khác có hóa chất này có thể do khôi phục màu đã mất trong quá trình chế biến, bảo quản, điều chỉnh màu sắc tự nhiên hoặc gia tăng màu sắc của sản phẩm tới mức độ cần thiết. Trong công nghiệp, RhodaminB được sử dụng thường xuyên để nhuộm quần áo, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm để xét nghiệm tế bào; chất này có màu đỏ sẫm, bị cấm tuyệt đối trong thực phẩm và dược phẩm. 3 1.2. Độc tính của RhodaminB Cho đến nay RhodaminB được xếp vào loại chất độc, bị cấm tuyệt đối trong thực phẩm và thuốc. Hoá chất này có khả năng gây kích thích cực mạnh, tác động trên các bề mặt tiếp xúc như da, niêm mạc mắt, mũi và miệng. Cho nên, khi sử dụng chất này cần phải sử dụng những dụng cụ bảo hộ có tính bảo vệ cao. RhodaminB khi bị vào trong đường tiêu hóa, chất này nó sẽ kích thích niêm mạc ruột, gây nôn mửa, nếu liều cao thì nó có thể gây độc ở gan và thận. Về độc tính lâu dài, hóa chất này tích tụ dần trong cơ thể, gây nhiều tác hại khác như tác động tới hệ gan thận, hệ sinh dục, hệ thần kinh gây ra suy gan, suy thận và cũng là một trong những tác nhân gây ung thư [25], [26], [27], [28]. 1.3. Giới hạn cho phép của RhodaminB trong thực phẩm, dược phẩm RhodaminB được xếp vào loại độc chất và không được phép dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, dược phẩm. Quyết định 76/768/EEC của Châu âu đã liệt kê 158 phẩm màu cho phép được sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Nghiên cứu trong lĩnh vực độc chất học và các bệnh về da liễu, cho thấy một số phẩm màu được sử dụng trong dược phẩm rất có hại. Trong đó, RhodaminB bị cấm bởi quyết định 91/1843/EEC. Tại Malaysia, theo pháp lệnh ban hành năm 1952 và Quy chế thực phẩm ban hành năm 1985 về thực phẩm đều quy định RhodaminB không được phép sử dụng trong thực phẩm. Tại Việt nam, RhodaminB không có trong danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm (Ban hành kèm theo quyết định 3742/2001/QĐ-BYT) và cũng chưa có nghiên cứu cụ thể về giới hạn cho phép của RhodaminB trong thực phẩm, đặc biệt như trong hạt dưa ớt bột và thịt bò khô, tuy nhiên RhodaminB bị cấm sử dụng trong thực phẩm [29], [30] [31] [32]. 1.4. Một số kỹ thuật phân tích RhodaminB Hiện nay, trong nước và nước ngoài một số phương pháp xác định RhodaminB đã được sử dụng rộng rãi như: Cục sức khỏe và An toàn lao động Mỹ OSHA đã ban hành phương pháp xác định RhodaminB trong không khí bằng HPLC - sắc ký lỏng hiệu năng cao với 4 detector UV và huỳnh quang. Đó là, mẫu không khí được thu vào trong bình polyvinyl clorid, chiết RhodaminB với methanol và xác định bằng HPLC trong các điều kiện sắc ký như sau: - Cột: 100 mm × 2.1 mm i.d. Hypersil ODS, 5 µm - Nhiệt độ buồng cột: 40°C. Tốc độ dòng: 0.2 mL/min. Detector UV-VIS: 556 nm - Pha động: 85% acetonitril 15% nước 0.005M acid 1-heptaneulfonic và điều chỉnh pH đến 3.5 bằng H 3 PO 4 - Detector huỳnh quang: E x = 210 nm, E m = 550 nm. Phương pháp có LOD là 0,28 μg/m3. [24]. Theo Asean (2005), cũng đưa ra quy trình định tính RhodaminB, chiết mẫu bằng Ethanol và sử dụng 1 trong 2 hệ dung môi sau làm pha động [15]: - Etyl acetat /metanol/Nước = 100/17/13 (v/v/v) - Etyl acetat/metanol/ (amoni hydroxid/nước 3/7) = 15/3/3 (v/v/v). Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương-Việt Nam – khoa kiểm nghiệm đông dược-dược liệu đã xử lý mẫu bằng Ethanol và đã đưa ra quy trình định tính trên sắc ký bản mỏng và định lượng bằng máy HPLC với thông số của máy HPLC: - Cột pha đảo C18, (250mm × 4,6mm × 5μm - Pha động:50 ACN:50 đệm kali dihydrophosphat 20 mM – triethylamin (100:0,3), pH = 3. - Tốc độ dòng: 1,4 mL/phút. Detecter: UV 525 nm. Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. [7]. Năm 2010 Việt Nam đã có TCVN 8670: 2011 để xác định hàm lượng Rhodamin B trong hạt dưa và gia vị với các thông số máy HPLC: - Cột tách: C18 (250mm × 4,6mm × 5μm) - Pha động: H 2 O:ACN = 25:75, Nhiệt độ cột 40oC và tốc độ dòng 1 ml/phút - Detector PDA hoặc UV-VIS ở bước sóng 556 nm. [8]. Nhìn chung, phương pháp HPLC ngày càng được ứng dụng phổ biến trong phân tích, phương pháp cho kết quả tin cậy, có độ nhạy cao đem lại nhiều ưu điểm, bởi lý do nguyên tắc xác định chất phân tích theo phương pháp HPLC là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng, mẫu được di 5 chuyển qua cột tách dưới dạng dung dịch và do cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất khác nhau nên khả năng tương tác giữa chúng với pha tĩnh với pha động khác nhau. Kết quả các chất di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau, những chất tách ra khỏi nhau này được phát hiện bằng detecter phù hợp. Chính vì vậy, phương pháp này có ưu điểm:  Có thể phân tích đồng thời nhiều chất;  Hiệu năng cao nhờ số đĩa lý thuyết;  Độ nhạy cao với các đầu dò thích hợp nên khả năng phát hiện rất tốt (khả năng phát hiện thường có đơn vị là ppm, ppb);  Thể tích tiêm mẫu rất nhỏ có thể từ 1-100 µL, giảm thiểu các sai số;  Dung môi pha động sử dụng rẻ, dễ tìm (TCVN 8670:2011 dùng nước và ACN);  Phạm vi, đối tượng áp dụng rộng. 1.5. Tổng quan về sắc ký lỏng 1.5.1.Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha động. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Các chất tách khỏi nhau ra và được detecter phát hiện ghi lại thành các tín hiệu (peaks), dựa vào các peaks này mà chúng ta có thể định tính hoặc định lượng các chất khác nhau [4], [11]. 1.5.2. Cấu tạo của hệ thống HPLC - Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bộ phận này được dùng để lọc, loại các hạt vẩn và đuổi khí hoà tan trong dung môi. Khí hoà tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền và xuất hiện các pic lạ,... trong phân tích. Có thể đuổi khí trong dung 6 môi bằng nhiều cách, như dùng siêu âm, đun và khuấy, sục khí trơ như heli, lọc dưới áp suất giảm... Đối với phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi; phương pháp rửa giải gradient, thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ lệ biến đổi theo chương trình đã định. 1 1-Bình chứa dung môi 4 3 2- Lọc dung môi 1 5 3- Bơm cao áp kết hợp với bộ phận loại khí 4- Bộ tiêm mẫu 5- Cột sắc ký 1 1 2 1 6 6- detectơ 7 - Máy ghi tín hiệu 1 7 8 – Bình hứng (chứa 1 8 dung môi thải ra). Hình 1.2. Cấu tạo hệ thống HPLC. - Hệ thống bơm: Các đơn vị áp suất hay dùng trong HPLC: 1Pa = 1 Nm-2; 1 bar = 105 Pa; 1 psi = 0,4536 × 9,81 / 0,02542 = 6897 Pa; 1 at = 1 kg cm-2 = 1,01 bar Trong phân tích HPLC thường hay dùng loại bơm dòng không đổi (constant flow), bơm kiểu piston là loại được dùng phổ biến và để khử xung nên dùng bơm có hai piston bơm luân phiên (Đây là loại được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm). - Hệ tiêm mẫu: Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) với dung tích xác định và chính xác. Có thể thay đổi các vòng mẫu với những dung tích khác nhau: 5 đến 500 µl; trong đó loại 20µl được dùng phổ biến hơn và tiêm bằng van tiêm có độ chính xác cao, hệ thống tiêm mẫu-bơm mẫu có thể bơm tự 7