Tài liệu Tài liệu thực hành-phân tích thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  Tài liệu thực hành PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Người biên soạn: ThS. Huỳnh Quang Phước TS. Ngô Đại Nghiệp ThS. Trần Thị Ngọc Mai KS. Trần Thị Hồng Hạnh KS. Nguyễn Thị Thu Hà Tài liệu lưu hành nội bộ Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM 1. Trang phục Sinh viên vào PTN phải đeo bảng tên, mặc áo blouse trắng và mang giày, dép có quai hậu. 2. Giờ giấc  Sinh viên đi thí nghiệm đúng giờ qui định  Sinh viên không được phép ra khỏi phòng thí nghiệm khi chưa có sự cho phép của giáo viên hướng dẫn.  Sinh viên không tự ý vô PTN khi chưa có sự đồng ý của giáo viên đang giảng dạy. 3. Nhiệm vụ  Phải đọc và tìm hiểu bài trước khi vào PTN  Nghe và thực hiện đúng các chỉ dẫn cụ thể của giáo viên, không được làm các thí nghiệm ngoài giáo trình khi chưa có sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn.  Có thái độ khoa học nghiêm túc trong PTN như: • Khi làm việc với các hóa chất độc hại đến thân thể phải sử dụng các thiết bị bảo hộ lao động như găng tay, mặt nạ phòng độc . • Khi làm việc với các khí độc hay dung môi dễ bay hơi phải làm việc trong • tủ hút Các dung dịch đổ bỏ có liên quan đến acid hay kiềm mạnh phải pha loãng và thải bỏ từ từ, sau đó sử dụng vòi nước xối mạnh.  Thiết lập qui trình làm việc chi tiết và trình cho giáo viên liên quan.  Vạch kế hoạch làm việc trước khi vào phòng thí nghiệm.  Toàn bộ quá trình làm việc phải được ghi chép lại cẩn thận dưới dạng nhật ký làm việc.  Tuân thủ qui định phòng cháy chữa cháy.  Trực nhật và đổ rác đúng nơi quy định sau mỗi buổi học. Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Phụ trách phòng thí nghiệm Trang 1 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM 1. Cẩn thận khi tiến khi tiến hành thí nghiệm, không được sử dụng những máy móc, dụng cụ mà chưa biết cách sử dụng. Phải hiểu rõ tính chất các hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc. 2. Không được dùng các dụng cụ thủy tinh chưa rửa sạch, các dụng cụ thủy tinh bẩn phải để riêng hoặc rửa ngay sau khi dùng. 3. Tất cả các chai lọ đựng hóa chất phải có ghi nhãn. Khi dùng hóa chất phải đọc kỹ nhãn hiệu, dùng xong phải để lại chỗ cũ. Nhãn ghi hóa chất bằng tiếng nước ngòai thì phải xem xét cẩn thận chỗ nào chưa rõ phải tra cứu tài liệu, không được đoán. Hóa chất chưa dùng ngay phải ghi lại để tránh nhầm lẫn. Trên thực tế phần lớn các hóa chất là chất độc nên phải hết sức cẩn thận. 4. Khi hút hóa chất bằng ống hút (pipette) phải sử dụng bóp cao su. 5. Khi theo dõi dung dịch đang sôi hoặc tinh thể đang chảy không được để mặt gần; khi đổ một chất lỏng vào cốc phải để xa mặt. Nên dùng kính bảo hộ lao động. 6. L Làm gì nguy hiểm phải chú ý cả người đứng bên cạnh. Đun một chất lỏng trong ống nghiệm phải để miệng ống quay về phía không có người. lúc đun không được giữ ống nghiệm đứng yên mà phải lắc đều, đun toàn bộ bề mặt ống nghiệm ở phần chứa chất lỏng. 7. Khi làm việc với chất dễ cháy thì tuyệt đối: • Không dùng lửa ngọn • Không làm việc bên cạnh lửa ngọn • Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt. 8. Khi làm việc với chất dễ nổ: như nitrate, chlorate, pemanganate, bicromate, peoxyt… thì phải cẩn thận và đúng qui cách. 9. Khi làm việc với các acid và base mạnh phải: • Không để đổ ra ngoài. • Khi đổ acid hay base vào nước khi pha loãng chúng (không được đổ nước vào acid hay base). • Sang chai phải dùng phễu (khi rót phải quay nhãn lên phía trên, chai kia phải để trên bàn, tuyệt đối không cầm trên tay). • • Không hút acid hay base khi trong chai còn quá ít. Khi đun sôi phải cho đá bọt hoặc bi thủy tinh … để điều hòa, tránh để bắn hay trào ra ngoài. 10. Khi làm việc với dụng cụ điện: Trang 2 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm • Tay phải thật khô, chỗ làm việc cũng phải khô. • Cẩn thận khi dùng điện có điện thế 220 Vol. 11. Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh • Tránh đỗ vỡ. • Dụng cụ loại nào dùng cho việc đó, chỉ được đun với dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt và dùng cho chân không những dụng cụ đặc biệt dùng trong chân không. 12. Khi có bất kỳ sự cố gì về đường ống dẫn nước trong PTN, phải nhanh chóng khóa van của đường ống dẫn nước. Trang 3 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm MỤC LỤC Trang 4 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 1: PHA CHẾ HÓA CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH 1. Lý thuyết 1.1 Cách pha các nồng độ a. Nồng độ phần trăm theo khối lượng Thí dụ: Muốn pha 500g dung dịch sulfat đồng 20% từ tinh thể ngậm nước CuSO4.5H2O Ta biết: Phân tử khối của CuSO4 khan nước: 160 Phân tử khối của CuSO4.5H2O là: 250 Muốn pha 500g CuSO4 20% thì cần một lượng CuSO4 khan nước là: (20.500)/100 = 100g. Muốn có 160g khan nước thì ta phải cần 250g CuSO4.5H2O. Vậy muốn có 100g CuSO4 khan nước thì phải cần một lượng CuSO4.5H2O là: (250.100)/160= 156g. Lượng nước cần đổ thêm: 500 – 156 = 334g. b. Nồng độ phần trăm khối lượng theo thể tích - Ta hòa tan lượng chất đã cân trong một ít nước và thêm nước cho tới thể tích đúng. • Thí dụ: Cần chuẩn bị 1 lít dung dịch NaCl 30%thì ta cần một lượng NaCl là: (300.1000)/100 = 300g để hòa tan trong 1 ít nước và thêm nước cho đủ thể tích 1 lít. - Trường hợp các hóa chất có ngậm nước, khi cân ta phải tính thêm cả lượng nước trong phân tử như trường hợp trên. - Trường hợp chất hòa tan là chất lỏng ta cũng làm tương tự như trên, nghĩa là cân chất tan và dung môi đem trộn lẫn với nhau cho đều là được. Nhưng việc cân chất lỏng không được thuận lợi cho lắm nên cần phải đưa chất lỏng về đơn vị thể tích theo công thức: V = P/d - Mặt khác đối với chất lỏng thường dùng có giới hạn hòa tan tối đa tính theo %. • Thí dụ: H2SO4 hòa tan tối đa 96%, HCl 37%, H3PO4 65%... cho nên khi cân các chất lỏng này phải tính cả số g có thực trong dung dịch để pha cho chính xác. Nếu ta xem HCl là 100% thì khi pha dung dịch 10% ta chỉ việc cân 10g HCl và thêm vào 90ml nước trộn đều là được. Nhưng thực ra HCl chỉ có 37% nên trọng lượng cân phải là (100.10)/37 = 27,02g hay 27,02/1,19 = 23ml và thêm lượng nước 100 – 27,02 = 72,98g hay 72,98ml. c. Nồng độ phân tử gam - Mol hoặc phân tử gam là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó. Dung dịch phân tử gam là dung dịch chứa 1 phân tử gam chất hòa tan trong 1 lít. Trang 5 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Để chuẩn bị dung dịch 1M của chất nào đó, người ta tính khối lượng phân tử. Lấy lượng cân chính xác đem hòa tan trong dung môi cho thành 1 lít dung dịch (dùng bình định mức). Khi phải đun nóng dung dịch hay khi phản ứng tỏa nhiệt hay thu nhiệt phải để cho nhiệt độ về bình thường (200C) rồi mới thêm nước tới vạch. • Thí dụ: Cần 0,5 lít dung dịch K2Cr2O7 0,1M; M(K2Cr2O7) = 294,2 Để chuẩn bị dung dịch K2Cr2O7 0,1M cần lấy 0,1M cần lấy 0,1 phân tử gam, nghĩa là 29,42g K2Cr2O7. Để chuẩn bị 0,5 lít ta chỉ cần cân 29,42 . 0,5 = 14,71g pha trong bình định mức 500ml. Nếu chất tan là chất lỏng có phần trăm thấp (chưa được 100%) ta phải chú ý tới nồng độ % tối đa của chúng để tính toán. • Thí dụ: Pha HCl 1M từ HCl 37% M(HCl) = 36,5 Ta phải cân: (36,5 x 100)/37 ≈ 98,65g HCl Hay: 98,65/1,19 ≈ 83ml HCl Vậy ta phải lấy 83ml HCl 37% pha với nước cất thành 1 lít thì được dung dịch HCl có nồng độ 1M. d. Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn 1N chứa 1 đương lượng gam chất tan trong 1 lít. Đương lượng gam sẽ được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng trong lúc định phân. * Trong định phân acid hay base Đương lượng gam của một chất acid là khối lượng chất đó có thể cho ra trong phản ứng 1 ion gam H+. Đương lượng gam của một chất base là khối lượng chất đó có thể cho ra trong phản ứng 1 ion gam OH-. • Thí dụ: H+Cl- + NaOH Na+Cl- + H2O 1 phân tử gam HCl cho ra 1 ion gam H+ Vậy đương lượng gam HCl = 1 phân tử gam HCl 2H+SO4-- + 2 Na+OH- 2Na+SO4-- + H2O 1 phân tử gam H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ Vậy đương lượng gam H2SO4 = 1/2 phân tử gam H2SO4 Một phân tử gam NaOH cho ra 1 ion gam OHTrang 6 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Vậy 1 đương lượng gam NaOH = 1 phân tử gam NaOH Một dung dịch nguyên chuẩn HCl chứa 36,5g HCl trong 1 lít. Một dung dịch nguyên chuẩn H2SO4 chứa 98/2 = 49g H2SO4 trong 1 lít. Con số 1 hay 2 được dùng để chia phân tử gam trong những thí dụ trên được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ. Trong trường hợp tổng quát số đó được gọi là γ và M/ γ được gọi là đương lượng gam phản ứng. * Trong trường hợp phản ứng oxy hóa - khử Muốn tìm đương lượng của một chất trong hệ thống oxy hóa khử, người ta đem chia phân tử gam cho số điện tích trao đổi trong phản ứng mà chất đó tham gia. Thí dụ: 2Na2S2O3 + I2Na2S4O6 + 2NaI Số điện tích trao đổi ở phản ứng này là I. Do đó N = M/I Cách pha: việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự như pha nồng độ phân tử gam (M) nhưng thay đổi số phân tử gam (M) bằng đương lượng gam (N). Lưu ý: Hầu hết các hóa chất rắn không tinh khiết hoàn toàn. Khi tính toán pha dung dịch từ các hóa chất rắn cần phải tính tới độ tinh khiết của hóa chất. 1.2 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch a. Dung dịch chuẩn Trong quá trình pha hóa chất có nhiều yếu tố làm sai số nồng độ như: việc cân đo không chính xác, các chất chưa tinh khiết hay hút nước, để lâu bị thăng hoa hay bị oxy hóa. Do đó người ta phải kiểm tra nông độ thực của các dịch pha dựa vào các chất ổn định hay nồng độ chính xác được coi là dung dịch chuẩn. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải bền vững để nồng độ chất phản ứng này không thay đổi nhanh chóng với thời gian. b. Cách xác định nồng độ - Hai dung dịch phản ứng với cùng một thể tích sẽ có cùng một chuẩn độ. Khi một thể tích V1 của dung dịch có chuẩn độ C1 (C1, N) tác dụng trên một thể tích V2 của dung dịch có chuẩn độ C2 (C2, N), chúng ta có thể viết rằng số hóa trị gam tác dụng với nhau đều bằng nhau trong 2 trường hợp: C1V1 = C2V2 - Hệ thức trên dùng để hiệu chỉnh lại nồng độ một số dung dịch cho chính xác. Thí dụ: Ta có dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N chính xác. Một dung dịch NaOH ta pha lấy nồng độ định pha là 0,1N. Đem chuẩn độ ta thấy 10ml H2SO4 0,1N tác dụng với 11ml NaOH ta pha. vậy nồng độ NaOH ta pha là: C1 = (V2C2)/V1 = 0,091N. Hệ số 10/11 = 0,91 là hệ số hiệu chỉnh. 2. Thực hành pha chế và hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Trang 7 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm 2.1 Pha chế dung dịch Yêu cầu: Pha 100ml dung dịch Na2S2O3 0,1N từ Na2S2O3 rắn (Chú ý quan sát trên nhãn chai để tìm các thông tin về hóa chất rắn) 2.2 Chuẩn độ dung dịch Na2S2O3 bằng dung dịch K2Cr2O7 a. Nguyên tắc Trong môi trường acid, với lượng thừa KI và lượng xác định dung dung dịch K2Cr2O7 chuẩn: Cr2O72- + 9I- + 14H+ = 2Cr3+ + 3I3- + 7H2O Lượng I3- (phức của dung dịch I2) tạo thành được chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3. b. Đặc điểm - Chuẩn độ trong môi trường có [H+] = 0,2 - 0,4M. Môi trường càng acid càng làm tăng tính định lượng của cân bằng chuẩn độ nhưng cũng làm cho I- dễ oxi hóa bởi oxi của không khí. - Để phản ứng hoàn toàn, cần sử dụng KI thích hợp để [I-] ≥ 2% và để yên hỗn hợp trong tối khoảng 10 phút. - Định điểm cuối: sử dụng chỉ thị hồ tinh bột. c. Thí nghiệm * Hóa chất - Dung dịch chuẩn K2Cr2O7 0,05N. - Na2S2O3 rắn - Dung dịch KI 10%. - Dung dịch H2SO4 (1:5) hoặc HCl (1:1) - Dung dịch chỉ thị hồ tinh bột. * Dụng cụ - Buret 25ml: 1 cây/tổ. - Erlen 100ml: 3 cái/tổ. - Pipet 5ml: 3 cái/tổ. - Bình định mức 100ml: 1 cái/tổ. * Cách tiến hành - Buret: Dung dịch mẫu Na2S2O3. - Erlen: hút V(ml) dung dịch K2Cr2O7 0,05N + 5ml H2SO4 + 5ml KI, để yên khoảng 10 phút. Chuẩn độ đến khi dung dịch có màu vàng nhạt + vài giọt chỉ thị hồ tinh bột. Chuẩn độ tiếp đến mất màu xanh (dung dịch có thể không màu hoặc có màu xanh xám nhạt của Cr3+). * Kết quả - Xác định V f từ 3 lần chuẩn độ. - Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ của Na2S2O3 trong dung dịch pha được. Trang 8 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 2: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO -KJELDAHL 1. Mục đích Phương pháp Micro - Kjeldahl thường được dùng để xác định tổng lượng nitơ trong nguyên liệu 2. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa hữu cơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O còn nitơ chuyển thành NH3 và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat. 3. Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ, hóa chất * Nguyên liệu • Mẫu bột đậu phộng đã sấy khô đến mất ẩm hoàn toàn * Thiết bị • Hệ thống cất đạm • Bếp điện • Tủ hút * Dụng cụ • Bình Kjeldahl • Pipette 10ml • Becher • Erlen • Muỗng inox • Dĩa nhựa • Bình định mức 250ml • Phễu thủy tinh • Burette 25ml • Giá burette • Kẹp burette • Bình xịt nước cất • Ống bóp cao su * Hóa chất • H2SO4 đđ • NaOH 45% • Hỗn hợp CuSO4 : K2SO4 theo tỉ lệ 1:3 • H2SO4 0,1N • Chỉ thị methyl red (hay phenolphtalein) Trang 9 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm 4. Tiến hành * Vô cơ hóa mẫu - Cân chính xác khoảng 3g mẫu rắn đã tách ẩm hoàn toàn (sấy 100 – 1050C đến khối lượng không đổi). - Gói mẫu bằng giấy lọc không tro. - Chuyển mẫu vào bình vô cơ hóa (bình Kjeldahl). - Thêm vào bình vô cơ hóa 10ml H2SO4 đậm đặc và 0,2g hỗn hợp CuSO4 : K2SO4 theo tỉ lệ 1:3. - Đặt bình vô cơ hóa lên bếp đun và đun đến khi dung dịch trong suốt và có màu xanh ngọc (không cặn) thì dừng quá trình vô cơ mẫu. Để nguội. - Tiến hành định mức lên 250ml * Lắp hệ thống cất đạm theo sơ đồ A: Bình đun tạo hơi nước B: Bình thu dịch thải C: Bình cất (chứa dung dịch vô cơ đã pha loãng và NaOH đậm đặc) D: Phễu dẫn chất thử và NaOH vào bình cất C E: Hệ thống sinh hàn F: Bình thu NH3 P, P1, P2: Các khóa dẫn * Chuẩn bị vận hành hệ thống cất đạm - Cho nước vào bình đun (1/2 – 2/3V) thể tích của hệ thống sinh hàn (mở van nước). - Đóng các khóa của hệ thống. - Sử dụng đèn cồn để đun nóng bình đun. - Khi nước ngưng tụ ở đầu ra của hệ thống sinh hàn thì tiến hành quy trình rửa. Trang 10 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Cho nước cất vào phễu, nạp mẫu và mở khóa để nước vào bình cất. Tắt đèn cồn, nước ở bình cất sẽ chuyển vào bình xả, mở khóa bình xả để xả nước ra ngoài. - Lặp lại quy trình rửa ít nhất hai lần. * Cất đạm - Chuẩn bị bình thu NH3 chứa 10ml dung dịch H2SO4 0,1N, 2 giọt chỉ thị methyl red (hay phenolphtalein) và nhúng ngập đầu ra của ống sinh hàn. - Mở đèn cồn để đun nóng bình đun. - Mẫu đã vô cơ hóa và pha loãng được cho vào phễu nạp mẫu (khoảng 10ml). - Mở khóa phễu nạp mẫu từ từ để đưa mẫu vào bình cất. - Rửa phễu nạp mẫu 3 lần bằng nước cất vô đạm. - Cho 10ml NaOH 45% vào phễu nạp mẫu, mở khóa từ từ lưu ý không xả hết. - Rửa phễu nạp mẫu 3 lần (cho từ từ vào không xả hết). - Thực hiện quá trình cất trong 10 phút. * Chuẩn độ, tính kết quả Hạ bình thu NH3 khỏi đầu ra ống sinh hàn và thực hiện trong 5 phút. Lấy bình thu NH3 ra và tiến hành chuẩn độ. Hàm lượng đạm tổng X (%) được tính theo công thức: 0,0014.(VNaOH 0,1Ntr − vNaOH 0,1Nth ) f .Vm .100 vm .m (%) f : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH VNaOH 0,1 tr (trắng) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn độ mẫu trắng (ml) vNaOH 0,1N th (thật) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn độ mẫu thật (ml) vm : thể tích mẫu đưa vào cất (10 ml) Vm : thể tích mẫu định mức (250 ml) m : khối lượng mẫu đưa vào vô cơ hóa (g) * Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ f Lấy 10ml H2SO4 0,1N vào erlen, thêm 2 giọt chỉ thị phenolphtalein đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt thì ngưng. Tính nồng độ thực tế của NaOH, sử dụng hệ thức hiệu chỉnh nồng độ: C1.V1 = C2.V2 f: là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ theo lý thuyết của NaOH Trang 11 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY 1. Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. 2. Dụng cụ và hóa chất * Dụng cụ • Buret 25ml • Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml chính xác • Bình định mức 50ml • Erlen 250ml * Hóa chất • Dung dịch albumin 0,1% : cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml. • Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml • Dung dịch B: cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% tạo thành 100ml. • Dung dịch C: (chỉ pha để dùng trong ngày) là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1 • Thuốc thử Folin : thuốc thử này đã pha sẵn, cách đều chế như sau: o Cân: 100g Natri tungstat và 25g Natri molybdate thật tinh khiết. Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto phosphoric 85%. Khuấy cho hòa tan và thêm vào đó 100ml acid clohydric đậm đặc. Tiếp tục khuấy rồi cho vào đó một bình cấu nút nhám 2 lít. Đun hoàn lưu trong 10 giờ. o Sau khi đun cho vào đó 150g Lithium sulfat. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi đổ vào đó thêm 5 – 10ml brom 1/3 (hoặc 2 – 3ml Brom lỏng). Khuấy đều và đun sôi trong tủ hút khí độc trong 15 phút. Làm lạnh ở nhiệt độ thường. Cho vào bình định mức 1 lít và thêm nước cất cho đủ. Lắc kỹ và lọc (nếu dung dịch không trong). Dung dịch có màu vàng chanh, nếu chuyển sang màu xanh là không dùng được. Bảo quản trong chai thủy tinh màu. 3. Thực hành * Dựng đường chuẩn Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là albumin của bò đã đông khô theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn có nồng độ protein từ 0 đến 250 γ /ml: Trang 12 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Ống nghiệm số Nồng độ protein µg/ml Dung dịch albumin 0,1%(ml) Nước cất (ml) 0 0 0 10 1 50 0,5 9,5 2 3 4 5 100 150 200 250 1,0 1,5 2,0 2,5 9,0 8,5 8,0 7,5 Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác nhau (gồm hai ống thử không và năm ống từ 1 đến 5). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm hay 500nm. Xử lý số liệu thu được theo phương pháp bình phương cực tiểu.Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ( ∆ OD) theo nồng độ protein chuẩn ( γ /ml). * Xác định hàm lượng protein trong mẫu Hút 0,4ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khô. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm hay 500nm. (Nên làm 3 ống nghiệm để lấy trung bình). * Tính toán Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đó suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a ( γ /ml). Lượng protein (M) có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức: M = Với a.10 −3.n mg protein/1g m a: là hàm lượng protein ( γ /ml dung dịch) n: là hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) Trang 13 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 4: NITROGEN 1. 2. - - – NITRITE Nguyên tắc Nitrite được xác định bằng phương pháp so màu, màu do phản ứng từ các dung dịch tham chiếu và mẫu sau khi tác dụng với acid sulfanilic và naphthylamine ở môi trường pH bằng 2 – 2,5 tạo thành hợp chất đỏ tím của acid azobenzol naphthylamine sulfonic. Phương pháp diazo thích hợp khi hàm lượng N – NO2 – từ 1 – 25mg/l. Hình 4.1: Cơ chế phản ứng tạo màu Dụng cụ, thiết bị và hóa chất * Dụng cụ, thiết bị - Bình định mức 10ml - Pipet 1ml, 5ml, 10ml. - Bầu hút an toàn - Spectrophotometer. * Hóa chất - Dung dịch chuẩn: dung dịch lưu trữ NO2 - 1000ppm: hòa tan 1,5 g NaNO2 khan trong nước cất và định mức thành 1 lít. - Dung dịch NO2 - chuẩn 10ppm: lấy 10ml dung dịch chuẩn 1000ppm + nước cất định mức thành 1 lít. Trang 14 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - 3. - STT ống nghiệm 1 2 3 4 5 Dd NO2 chuẩn (10ppm) (ml) 0 1 2 3 4 Mẫu (ml) Dung dịch sulfanilic (ml) M1 M2 8 8 1 1 Cx Cx 0,5 Đợi 10 phút Dung dịch naphthylamine 0,5 Đợi 20 phút H2O (ml) 9 C (mg/l) 0 8 7 6 - Thêm vào mẫu các dung dịch theo đúng thứ tự trong bảng. - Đo độ hấp thu A ở bước sóng 520nm. - Cách tính Từ đường chuẩn đo độ hấp thu. 4. 5. Dung dịch sulfanilic: cân 0,6g acid sulfanilic + 70ml nước nóng để nguội + 20ml HCl đậm đặc, pha loãng thành 100ml với nước cất. Dung dịch naphthylamine chlohydrate: cân 0,6g naphthylamine chlohydrate + 50ml nước cất + 1ml HCl đậm đặc + nước cất thành 100ml. Pha dùng ngay hoặc giữ ở nhiệt độ thấp. Thực hành Chuẩn bị mẫu và dung dịch tham chiếu đồng thời - 5 Sử dụng phương pháp bình phương cực tiểu để lập phương trình y = ax + b, vẽ giản đồ A = f(C). Từ trị số độ hấp thu của mẫu Am suy ra nồng độ Cm. Cm (NO2-) = C x .10.1000 . f (ppm) 1000.8 f: độ pha loãng của mẫu trước khi hiện màu Câu hỏi chuẩn bị 1.1. Phân tích một mẫu nước ngầm, kết quả hàm lượng nitrite cao, có thể kết luận gì? 1.2. Nitrogen thường tồn tại ở dạng nào trong nước mặt, nước ngầm? Trang 15 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS) 1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic.Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm và có gia nhiệt. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalicylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. 2. Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất * Nguyên liệu • Chuối sứ chín * Thiết bị • Máy quang phổ • Bếp điện hoặc bể điều nhiệt * Dụng cụ • Ống nghiệm • Giá ống nghiệm • Becher 500 ml • Becher 250 ml • Becher 100 ml • Kẹp ống nghiệm • Bình xịt nước cất • Bóp cao su • Cối chày sứ • Dĩa nhựa • Dao • Muỗng Inox • Pipette 5 ml • Pipette 1 ml • Phễu thuỷ tinh • Bình định mức 100 ml • Cuvet nhựa • Giấy lọc • Erlen 250 ml • Erlen 100 ml • Đũa khuấy * Hóa chất • Cách pha thuốc thử DNS DNS 0,1% (500ml) o Cân 8/p (gram) NaOH  định mức 100ml  Dung dịch A (NaOH 2M; p: độ tinh khiết) Trang 16 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm o Cân 0,5 gram DNS hòa tan trong dung dịch A (đun cách thủy, khuấy cho đến khi tan hết)  dung dịch B o Cho 150 gram Natri Kali tatrate vào dung dịch B  chuẩn lên 300ml  tráng cốc chứa muối kép, sau đó định mức thành 500ml. • Glucose 0,1% • Acetat chì 10 % • Na2HPO4 bão hòa • Acid trichloroacetic 10%, • NaOH 5% , • Chỉ thị methyl red • Chỉ thị phenolphtalein • Na2CO3 bão hòa. • Cồn 70 – 80o. • Giấy lọc 3. Tiến hành * Xử lý mẫu Tùy vào đối tượng nghiên cứu mà cách chuẩn bị dung dịch dùng để định lượng đường có khác nhau: • Nguyên liệu không chứa nhiều tinh bột Dùng nước nóng trích ly đường. Cân 1–2g mẫu nếu là nguyên liệu khô (cây, lá hoặc quả khô) hoặc 5 – 10g nếu là nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao (rau, quả tươi). Cho vào cối sứ nghiền thật nhỏ (có thể nghiền với bột thủy tinh hay cát sạch). Trích ly nhiều lần bằng 30ml nước cất nóng 70 – 80oC. Chuyển lượng dịch vào bình định mức, bỏ phần bã. • Nguyên liệu chứa protein (dứa,…) Trích ly dung dịch (V<50ml), đem kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch acid trichloroacetic 10% (hoặc Acetat chì 10 %), sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 5% với chỉ thị methyl red (màu đỏ chuyển sang vàng) hoặc Na2HPO4 bão hòa. • Nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ (dứa, chanh, khế,…) Trong quá trình trích ly đường, sacarose có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của acid hữu cơ có sẵn trong nguyên liệu, do đó khi xác định đường khử phải trung hòa acid hữu cơ bằng dung dịch NaOH 5% hay Na2CO3 bão hòa. Nghiền nhuyễn nguyên liệu trong cối sứ với một ít nước cất. Nhỏ 3 giọt chỉ thi đỏ methyl red hoặc phenolphtalein và cho từ từ từng giọt NaOH 5% đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Tiếp tục trích ly bằng nước ấm như trên • Nguyên liệu chứa nhiều tinh bột (chuối, khoai lang,..) Trích ly đường bằng 30ml rượu 70 – 80o. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không đáng kể. Mẫu đã qua xử lý thêm nước cất tới vạch định mức 100ml, lọc qua giấy lọc vào cốc. Nước qua lọc là dung dịch mẫu cần phân tích. 4. Lập đường chuẩn Ống nghiệm Dd glucose chuẩn 0,1% (ml) 1’ 0,8 2’ 1 3’ 1,2 4’ 1,4 5’ 1,6 Trang 17 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Nước cất (ml) Cglucose ( µg / ml ) Dãy ống nghiệm mới Hút từ các ống 1’,2’,3’,4’,5’ (ml) Nước cất (ml) Thuốc thử DNS (ml) 0 1 3 3,2 200 3 250 2,8 300 2,6 350 2,4 400 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 3 M1 M2 1 3 1 3 Đun cách thủy các ống nghiệm đúng 5 phút Làm nguội các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng, sau đó đem đo OD OD540nm 5. Xử lý kết quả • Xây dựng đường chuẩn glucose y = f(x) với trục tung (y) là mật độ quang, trục hoành (x) • là hàm lượng glucose (mg) bằng phương pháp bình phương cực tiểu. Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ X (mg/ml) glucose trong dung dịch mẫu 6. Tính toán Hàm lượng glucose trong nguyên liệu được tính theo công thức: G= X .V .100 fmẫu 1000.m (%) Với: m V X fmẫu : lượng mẫu đem thí nghiệm (g) : thể tích định mức dung dịch thí nghiệm (100ml) : nồng độ đường khử trong dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml) : hệ số pha loãng mẫu (nếu có) Trang 18 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 6: SẮC KÝ CỘT (COLUMN CHROMATOGRAPHY) LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT SẮC TỐ Ở LÁ CÂY 1. Nguyên tắc Trong các loại lá cây thường có chứa sắc tố gồm chlorophyll, carotenoid… Những loại sắc tố này được dùng rộng rãi trong thực phẩm cũng như y dược. Ở bài thực hành này, chúng ta dùng phương pháp sắc ký ngoại hấp (hấp phụ) để tách chúng ra khỏi hỗn hợp. Trước hết các sắc tố được cho hấp phụ vào cột cellulose (cellulose được xem như là phase cố định), sau đó dung ly chúng nhờ các loại dung môi khác nhau (phase di động) để tách chúng ra khỏi hỗn hợp. Như ta đã biết các loại sắc tố có trong lá cây, nếu đứng về mặt phân cực tăng dần thì sẽ như sau: carotene, xanthophyl, chlorophyll b, chlorophyll a. Như vậy ta sẽ cho dung ly chúng bằng các loại dung môi phân cực tăng dần: ether dầu hỏa, ether dầu hỏa 2% acetone, ether dầu hỏa 5% acetone và cuối cùng là ether dầu hỏa 20% acetone. Cuối cùng ta sẽ tách được các sắc tố riêng biệt. Sau khi có được những sắc tố, ta phải định tính và định lượng chúng. Về định tính, chúng ta khảo sát phổ hấp thu của nó. Mỗi sắc tố sẽ có phổ hấp thu riêng, nhở những mũi hấp thu cực đại cho phép chúng ta xác định chúng. Muốn định lượng riêng từng sắc tố, thông thường người ta dùng phương pháp thực nghiệm (gần đúng) vì chúng ta tuy cô lập được chúng nhưng những sắc tố này dễ bị phân huỷ cho nên khó mà có được chất chuẩn. Hình 6.1: Trình tự thao tác trên sắc ký cột 2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên liệu * Thiết bị • Cân phân tích • Spectrophotometer • Thiết bị lọc chân không Trang 19