Tài liệu Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGỪƠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------- Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 Ch­¬ng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................11 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN ............................................11 1.1.1. G protein..................................................................................................11 1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein .................................................................11 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ ........................................14 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 ....18 1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin ..............................................18 1.3.2. Thụ thể neurokinin – 1 ............................................................................20 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH .......................................................................................................................23 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 .....................................................................................................26 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......28 2.1. NGUYÊN LIỆU .....................................................................................28 2.1.1. Mẫu vật....................................................................................................28 2.1.2. Các cặp mồi sử dụng ...............................................................................28 2.1.3. Các hệ thống vector.................................................................................29 2.1.4. Chủng vi khuẩn .......................................................................................29 2.1.5. Hóa chất và thiết bị .................................................................................29 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................30 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................................30 2.2.2. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu .......................................................31 2.2.2.1. Tách RNA tổng số................................................................................31 2.2.2.2. Phản ứng phiên mã ngược ....................................................................32 2.2.2.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ......................................32 2.2.2.4. Tinh sạch DNA bằng phương pháp thôi gel ........................................33 2.2.2.5. Nối ghép các đoạn DNA vào vector ....................................................33 2.2.2.6. Kỹ thuật biến nạp .................................................................................33 2.2.2.7. Sàng lọc khuẩn lạc ...............................................................................34 2.2.2.8. Tách plasmid ........................................................................................34 2.2.2.9. Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn ..................................................35 2.2.2.10. Kỹ thuật điện di ..................................................................................36 2.2.2.11. Phân tích trình tự cDNA của cDNA-NK1 .........................................36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................37 3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI ...................................................................................................37 3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người .......................................................37 3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 .37 3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 .39 3.1.4. Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ......................................................................................................41 3.1.5. Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 ..........44 3.1.6. Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1..........49 3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 .....................................................................................................49 3.2.1. Thiết kế mồi .........................................................................................49 3.2.2. Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin1 .........................................................................................................................52 3.2.3. Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện ...........................................................................................................................56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................57 KẾT LUẬN ...................................................................................................57 KIẾN NGHỊ ..................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................58 \ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Họ các thụ thể liên kết với G protein (GPCRs).......................................................3. Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein.....................4. Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú ..................................7. Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hòan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt........................................................................................................................................12. Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam..............................................................................22. Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1…………9 Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.......................................................................................................................30. Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1........................................................................................................................30. Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1. .....................................................................................................................30. Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1....34. Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. .........................................................................................................35. Hình 12. Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1...............36 Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R………………………………………………………………………………………….37 Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction………………………………………………………………………………..38. Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh....................................................................................................................................40. Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK13...........................................................................................................................................41. Hình 17: Điê ̣n di sản phẩ m PCR với khuôn là vector tái tổ hơ ̣p pNK 1-3 và hai mồ i NK 1 F3/NK1 R3.......................................................................................................................43. Hình 18: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t ve ctor pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme Hind III và Bam HI.........................................................................................................................44. Hình 19: Điê ̣n di sản phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n la ̣c mang vector tái tổ hợp pCDNA 3- NK1.....................................................................................................................................46. Hình 20: Điê ̣n di sản phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n la ̣c mang vector tái tổ hơ ̣p pGFPN 1- NK1.....................................................................................................................................47. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Dedeoxyribonuleic acid pb base pair (cặp bazơ) kb kilobase = 1000 bp dNTP deoxyribonucleoside triphosphate E.col Escherichia coli LB Lubertani Both PCR Polymerase Chain Reception RNA Ribonucleic acid GPCR G protein coupled receptor TACR Tachykinin Receptor TM Transmembrane IL Ỉntacellular CIN V Chemotherapy induced nausea and vomiting MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein. Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất ít hoặc chưa được công bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Ch-¬ng 1. 1.1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1.1. G protein G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4]. G protein một nhóm protein lớn có bản chất là enzyme GTPases [46]. Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn. G protein kích thước lớn được tạo thành từ các tiểu đơn vị alpha (Gα), beta (Gβ) và gamma (Gγ). Hai tiểu đơn vị beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29]. G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào. 1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]. Hình 1: Sự đa dạng của các họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) [56]. Họ GPCR được phân chia thành ba lớp chính: lớp A, B và C. Lớp A hay còn gọi là lớp Rhodopsin đông đảo nhất về số lượng thụ thể trong họ GPCR với 19 phân lớp (Hình 1). Lớp A cho phép nhận tín hiệu từ các monoamine, purine, opioid, chemokine, một số hormone có bản chất peptide hoặc glycoprotein, ... trong đó đặc biệt là truyền dẫn các tín hiệu có liên quan tới mùi hương. Lớp B còn được gọi là lớp Secretin với 34 phân lớp chủ yếu dẫn truyền tín hiệu liên quan tới các hormone có bản chất peptide như parathyroid, calcitonin, … Lớp C còn được gọi là lớp Glutamate với 8 phân lớp có vai trò thu nhận tín hiệu trong quá trình trao đổi dinh dưỡng của tế bào [3, 60]. Về cấu trúc, tất cả các thụ thể liên kết với G protein đều có đầu amino ở ngoài màng, 7 chuỗi xoắn xuyên màng, 3 vòng ở phía ngoài (exoloop), 3 vòng ở phía trong màng (cytoloop) và đầu carboxyl phân bố trong màng (Hình 2). Hầu hết các thụ thể này đều được gắn thêm carbonhydrate vào đầu amino và palmityl hóa ở vị trí Cys ở đầu carboxyl. Mỗi chuỗi xuyên màng chứa 20-27 acid amine, đầu amino chứa 7-595 acid amine, các vòng xoắn chứa 5-230 acid amine, đầu carboxyl chứa 12-359 acid amine. Điều này cho thấy cấu trúc của GPCR rất đa dạng. Người ta đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa chiều dài của đầu amino với kích thước của cấu tử gắn tương ứng [51]. Ngoài tế bào tế bào Trong tế bào tế bào Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein [60]. Vùng xuyên màng với 7 chuỗi xoắn alpha tạo nên hình dạng đặc trưng cho thụ thể GPCR. Trong đó vùng xuyên màng 1, 4, 7 chỉ chứa duy nhất một acid amine kỵ nước là asparagine hoặc serine. Điều này khiến cho chúng có tính kỵ nước cao hơn các vùng xuyên màng còn lại. Trên cấu trúc của các vùng xuyên màng thường chứa cysteine tham gia vào tạo cầu disulfit [51]. GPCR đều có chung một cơ chế hoạt động. Khi một cấu tử mang tín hiệu (hormone, photon, ...) liên kết với vùng đặc hiệu trong thụ thể trên bề mặt tế bào sẽ làm thay đổi cấu hình của GPCR. Sự thay đổi đó kích hoạt G protein chuyển từ trạng thái “tắt” – đang liên kết với GDP sang trạng thái “bật” – liên kết với GTP ở tiểu đơn vị Gα. Ở trạng thái “bật”, phức Gα-GTP tách khỏi phức dimer Gβγ, khi đó chúng sẽ kích hoạt các enzyme hình thành lên chất truyền tin thứ hai là cAMP hoặc inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP3/DAG). Điều này phụ thuộc vào loại tiểu đơn vị alpha trong G protein, từ đó tạo ra một dòng thác những tín hiệu được truyền dẫn, kết quả cuối cùng là làm thay đổi hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào [29, 38]. Về chức năng, GPCR và G protein cùng phối hợp với nhau để thực hiện vai trò truyền dẫn các tín hiệu hormone, chất dẫn truyền thần kinh, hạt photon ánh sáng, các phân tử mùi hương, các loại peptide, một số ion, ... từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế bào [51, 60]. Do có nhiều chức năng rất quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu của tế bào nên hiện nay G protein và các thụ thể liên kết với chúng đang là đích tách động cho nhiều liệu pháp chữa bệnh. Theo ước tính có khoảng hơn một nửa số thuốc hiện nay có đích tác động là GPCRs [3, 4]. 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45]. Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công. Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50]. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33]. Hiện nay, tachykinin trong mô động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide K và neuropeptide γ (Bảng 1). Bảng 1: Trình tự amino acid đầu carboxyl của các tachykinin ở động vật có vú [61] Peptide/Nguồn SP Vùng dưới đồi của bò NKA Tủy sống của lợn NKB Tủy sống của lợn Neuropeptide-γ Ruột thỏ Neuropeptide K Não lợn Trình tự amino acid đầu C Tài liệu trích dẫn Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln- Chang và cộng sự, 1971 Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 His-Lys-Thr-Asp-SerPhe- Val-Gly-Leu-Met-NH2 Asp-Met-His-Asp-PhePhe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Asp-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Ile-SerHis-Lys-Arg-Lys-Asp-SerPhe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Asp-Ala-Asp-Ser-Ser-Ile-GluLys-Gln-Val-Ala-Leu-Leu-LysAla-Leu-Tyr-Gly-His-Gly-GlnIle-Ser-His-Lys-Arg-His-GlyGln-Ile-Ser-His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser – Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Kimura và cộng sự, 1983 Kangawa và cộng sự, 1983 Kage và cộng sự, 1988 Tatemoto và cộng sự, 1985 Các tachykinin ở động vật có vú đều được đặc trưng bởi trình tự đầu carboxyl với cấu trúc bảo thủ: Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2, trong đó X là một amino acid béo (Val hoặc Ile) hoặc thơm (Phe hoặc Tyr) [20]. Gen PPT-A Quá trình phiên mã Dịch mã và tổng hợp protein Dịch mã và tổng hợp protein Dịch mã và tổng hợp protein Quá trình biến đổi sau dịch mã Quá trình biến đổi sau dịch mã Quá trình biến đổi sau dịch mã Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú [37]. Các gen mã cho tachykinin ở người gồm TAC1 (hay PPT-A) định vị trên NST số 7 và TAC3 (hay PPT-B) định vị trên NST số 12. Các gen này tương ứng với gen Tac1 và Tac2 ở chuột. Gen TAC1 mã hóa cho SP, NKA, neuropeptide K, neuropeptide- γ [3, 7]. Sở dĩ gene này mã hóa được cho một loạt sản phẩm là do mRNA tổng hợp từ gen TAC1 đã trải qua quá trình cắt nối luân phiên để tổng hợp các dạng preprotachykinin khác nhau: alpha (α-PPT), beta (β-PPT) và gamma (γPPT) [34]. Sau quá trình dịch mã, từ các tiền chất protein này sẽ tiếp tục được cắt nối để tạo thành tachykinin SP, NKA, NKB. Chi tiết sơ đồ quá trình cắt nối được trình bày trong Hình 3. Trong đó, dạng α-PPT-A mARN thiếu exon 6 được tìm thấy chủ yếu ở trong não. Dạng γ-PPT-A mARN thiếu exon 4 và dạng β-PPT-A mARN đủ cả 7 exon được tìm thấy chủ yếu ở các hạch thần kinh ngoại biên [36, 37]. Các đoạn peptide tiền thân được nhận biết nhờ 6 nhóm enzyme thủy phân gọi là convertase và cắt đặc hiệu tại các vị trí Lys-Arg, Arg-Arg hoặc Arg-Lys để tạo thành các dạng tachykinin tương ứng [34, 47]. Trong đó cả ba dạng preprotachykinin đều được sử dụng để tạo thành chất P còn dạng preprotachykinin beta và gamma mới được sử dụng để hình thành lên các dạng peptide khác (NKA, neuropeptide γ, neuropeptide K). Ở một số mô trong cơ thể, neuropeptide K và γ thường có đầu amino dài hơn so với NKA [12]. Trong khi đó gen TAC3 (PPT-B) mã hóa cho neurokinin B biểu hiện chủ yếu trong vùng dưới đồi và ruột [7]. Từ năm 2000, nhóm của Yu Zhang và cộng sự tiến hành nghiên cứu ở tế bào lympho B ở chuột đã phát hiện dạng tachykinin thứ tư là hemokinin. Ở người, hemokinin được mã hóa bởi gen TAC4 (PPT-C) định vị trên NST số 17 [39, 54]. Gen này có được cắt nối theo nhiều cách khác nhau để từ đó hình thành nên nhiều dạng hemokinin và endokinin khác nhau trong cơ thể. Tachykinin được tổng hợp trong các tế bào thần kinh (trung ương và ngoại vi) và cả các tế bào không phải tế bào thần kinh. Sự phân bố này phụ thuộc vào từng loài và rất khó tìm ra quy luật phân bố của chất này. Có nhiều vị trí biểu hiện tachykinin đến nay vẫn chưa biết chức năng. Khi phân bố ở tế bào thần kinh, tachykinin hoạt động như một chất truyền dẫn tín hiệu thần kinh, trong khi ở các tế bào không phải tế bào thần kinh, chúng có vai trò như những chất nội tiết, cận nội tiết hoặc điều chỉnh hoạt động hệ nội tiết [27]. Ở động vật có vú, tachykinin chú yếu được biểu hiện ở tế bào không phải tế bào thần kinh dưới dạng SP. Sau khi được giải phóng vào máu, SP cùng với serotonin hoạt động như một chất cận nội tiết hoặc một chất nội tiết tố thực sự. Khi đó chúng đóng vai trò như một tác nhân gián tiếp gây giải phóng chất gây giãn mạch máu hoặc trực tiếp gây co cơ trơn [8, 21]. Khi liên kết với thụ thể tương ứng của mình, tachykinin có vai trò kích thích các tế bào thần kinh, gợi những phản ứng thói quen, hành vi giới tính, dẫn truyền cảm giác đau đớn và gây co trực tiếp hoặc gián tiếp cơ trơn, từ đó gây hiện tượng co thắt ruột, gây giãn mạch máu và phản xạ nôn, gây viêm [6, 8, 40]. Dựa vào hiểu biết về chức năng cuả tachykinin, nhiều nghiên cứu tập trung tìm kiếm các chất đối vận với tachykinin để điều trị các điều kiện gây viêm như hen suyễn, triệu chứng kích thích co thắt ruột [8, 16, 25]. Tuy nhiên, mục đích chính để sử dụng các loại thuốc này là chống buồn nôn cho người và động vật [18, 19]. 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1). Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop). Những vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể. Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45]. Có ba dạng thụ thể của họ tachykinin ở động vật có vú đã được phát hiện là: neurokinin 1 (NK1), neurokinin 2 (NK2) và neurokinin 3 (NK3) tương ứng với các tachykinin SP, NKA và NKB. Trên thực tế, giữa các thụ thể và tachykinin có thể liên kết chéo, nhưng ái lực liên kết thay đổi nhiều giữa thụ thể và cấu tử (Bảng 1) [3, 9, 10, 35]. Riêng tachykinin endokinin và hemokinin đều ưu tiên gắn với thụ thể NK1 [21]. Bảng 2: Ái lực liên kết giữa các tachykinin với các thụ thể của chúng [3] Tachykinin Ái lực liên kết SP NK1 > NK2 > NK3 NKA NK2 > NK3 > NK1 NKB Neuropeptide-γ Neuropeptide K NK3 >> NK2 > NK1 NK2 > NK1 >> NK3 NK2 > NK1 >> NK3 Ngoài ái lực liên kết với các tachykinin khác nhau, ba thụ thể NK1, NK2 và NK3 còn phân biệt với nhau ở một số đặc điểm được thống kê trong Bảng 3. Bảng 3: Một số đặc điểm sai khác giữa các thụ thể NK1, NK2 và NK3 ở người [3, 23, 28] Đặc điểm Thụ thể NK1 Thụ thể NK2 Thụ thể NK3 Gen mã hóa nằm trên NST 2 10 4 Số lượng acid amine (chiều dài đủ) 398 407 465 Độ tương đồng 41% với NK3 47% với NK1 51% với NK1 Khối lượng phân tử 46,364 43,851 51,104 Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng gen mã hóa cho 3 dạng thụ thể trên đều chứa 5 exon xen kẽ với 4 intron. Việc các gen mã hóa cho TACR chứa intron đã gợi ý rằng các gen này có thể có nhiều cách cắt nối khác nhau, từ đó tạo nên tính đa hình của thụ thể [22]. Khi nghiên cứu các thụ thể TACR người ta thấy có sự biến động về số lượng acid amine giữa các loài động vật. Trong đó NK1 ở tất cả các loàiđộng vật có vú chứa 407 acid amine. NK2 ở người chứa 398 acid amine, trong khi ở chuột chứa 390 và ở lợn là 402 acid amine. Tương tự như thế với NK3 ở người chứa 465 acid amine trong khi ở chuột là 452 và lợn là 440 acid amine [3]. Cả ba thụ thể của họ tachykinin ở người mặc dù có cấu trúc khác nhau nhưng đều có chung cơ chế hoạt động. Sau khi tachykinin liên kết vào thụ thể tương ứng của chúng, phức hợp thụ thể-cấu tử sẽ kích hoạt phân tử G protein, từ đó làm tăng hàm lượng Ca2+ nội bào hoặc hoạt hóa phospholipase C làm phân hủy phosphoinositol thành IP3/DAG. Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng phức hợp giữa thụ thể tachykinin và tachykinin tương ứng còn có khả năng kích hoạt G protein gây hoạt hóa adenylate cyclase hình thành cAMP [26, 42]. Vai trò của TACR được phát hiện thông qua các thí nghiệm gây đột biến làm mất các gen tổng hợp tachykinin hoặc thụ thể của tachykinin ở động vật [16, 18, 55]. Nhìn chung, các TACR khi phối hợp hoạt động với G protein cho phép truyền dẫn tín hiệu từ tachykinin vào trong tế bào, gây co thắt phế quản [23], tăng cường vận chuyển khí ở mạch máu và tăng tiết dịch nhày, gây co thắt cơ trơn, gây phản ứng viêm, .... Chất đối vận của thụ thể NK1 có cơ chế hoạt động tương tự như chất P đã được chứng minh là có khả năng chống suy nhược [9, 10] trong khi chất đối vận với thụ thể NK2 được chứng minh là có tác dụng chống lo âu [11, 12], còn chất đối vận với thụ thể NK3 có chức năng chống lại sự rối loạn thần kinh [46, 14]. 1.3.2. Thụ thể neurokinin – 1 Trong họ tachykinin, biểu hiện và đóng vai trò quan trọng nhất phải kể đến SP. SP có khả năng liên kết với cả ba loại thụ thể NK1, NK2 và NK3 nhưng ái lực mạnh nhất với thụ thể NK1. Khi biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở dòng tế bào COS-7, ái lực liên kết giữa thụ thể NK1 với SP có giá trị Kd là 0.35±0.07, cao gấp 100 lần so với NKA và 500 lần so với NKB [24]. Như đã nói ở trên, NK1 là một thành viên trong họ thụ thể liên kết với G protein, chúng chứa 7 vùng xuyên màng kỵ nước, trong đó có 3 loop xuyên ngoài màng và ba loop xuyên trong màng, đầu carboxyl nằm trong tế bào chất trong khi đầu amino nằm ngoài màng tế bào. Thụ thể này chứa 407 acid amine. Những cấu trúc liên quan trực tiếp tới chức năng của thụ thể gồm cầu disulfit tạo thành giữa Cys105-Cys180 thuộc TM 3 và TM4; đầu amino của NK1 bị glycosyl hóa tại vị trí Asp14 và Asp18; đầu carboxyl bị palmityl hóa ở vị trí Cys322 [58]; trình tự AspArg-Tyr của TM3 và Lys/Arg-Lys/Arg-XX-Lys/Arg nằm ở đầu carboxyl của thụ thể phía là nơi tương tác với G protein (Hình 4A). Glycosyl hóa Glycosyl hóa Disulfit Disulfit Palmityl hóa hóa A. NK1 dài hoàn chỉnh B. NK1 bị xén cụt đầu carboxyl Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hòan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt. Gen mã hóa cho neurokinin-1 có hai cách cắt nối trong tự nhiên hình thành nên dạng NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh và dạng NK1 bị xén cụt đầu carboxyl tận cùng ở người và ở lợn [5, 11, 22]. Cả hai dạng NK1 này phát hiện ra thấy ở tất cả các vùng trong não, thậm chí mở rộng ra tới hệ thần kinh vùng ngoại vi trong ngũ tạng. Nguyên nhân của sự xuất hiện dạng NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt là do bị lỗi trong quá trình cắt bỏ exon số 5 đã tạo ra sớm mã kết thúc [5]. Khi dịch mã sang protein, dạng NK1 dài hoàn chỉnh chứa 407 acid amine, trong khi dạng NK1 bị xén cụt chứa 311 acid amine. Hai dạng này khác nhau ở chiều dài đầu carboxyl tận cùng – vị trí gây ra sự phosphoryl hóa trong quá trình truyền tín hiệu của thụ thể NK1. Do sự khác biệt về đầu carboxylnên khi biểu hiện ở dòng tế bào thận phôi người HEK 293, hai dạng thụ thể NK1 này có nhiều điểm khác biệt về chức năng (Bảng 4) [30]. Theo nghiên cứu của Fong và cộng sự cho thấy ái lực của NK1 bị xén cụt đầu carboxyl giảm 10 lần so với NK1 có trình tự dài hòan chỉnh khi tương tác với chất đồng vận SP [22]. Điều này gợi ý rằng cần phải có một lớp thuốc mới phù hợp với dạng thụ thể này.