Tài liệu Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme h8 của phanerochaete chrysosporium trong nấm men pichia pastoris

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2012 1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 62 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. PHÍ QUYẾT TIẾN Hà Nội – 2012 2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1 ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Vũ Văn Lợi i 3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Một số số liệu đã được đăng trên các tạp chí khoa học chuyên ngành như trong: “Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án”, đã được sự đồng ý cho phép sử dụng các số liệu của các đồng tác giả và phần còn lại là các kết quả như trong luận án. Hà nội, ngày tháng năm 2012 Học viên Vũ Văn Lợi ii 4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 bp cDNA DEPC his DNA dNTP EDTA EtBr kb kDa LiP LiP H8 rLiP H8 mRNA OD ORF PCR 18 19 20 21 pI RNA rRNA RT-PCR 22 23 SDS SDS-PAGE 24 25 26 TAE TEMED tRNA Cặp bazơ (base pair) DNA bổ trợ (Complementary DNA) Diethyl pyrocarbonate Histidine dehydrogenase Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide Ethylene diamine tetra-acetic acid Ethidium bromide Kilo bazơ Kilo Dalton Lignin peroxidase Lignin peroxidase isozyme H8 Lignin peroxidase isozyme H8 tái tổ hợp ARN thông tin (messenger RNA) Mật độ quang (Optical Density) Khung đọc mở (Open Reading Frame) Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) Điểm đẳng điện (isoelectric point) Ribonucleic acid ARN ribosom Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase (Reverse transcription polymerase chain reaction) Sodium dodecyl sulfate Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl sulfate Tris-acetat EDTA N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine ARN vận chuyển iii 5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng 2.1 Thành phần gel chạy SDS-PAGE 29 3.1 So sánh độ tương đồng của trình tự amino acid giữa các LiP 38 Trang H8 từ P. chrysosporium 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hoạt tính rLiP H8 44 của chủng P. pastoris C132 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng đến khả năng 47 phát triển và sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men trong môi trường đến 48 khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ peptone trong môi trường đến khả 49 năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 3.6 Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate đến 50 hoạt tính rLiP H8. iv 6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin 3 1.2 Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin 4 1.3 Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của 5 polymer lignin, tạo thành các oligomer 1.4 Cơ chế phân cắt mối liên kết C-C tạo thành gốc aryl 6 1.5 Cơ chế xúc tác của laccase 7 1.6 Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus 14 his4 3.1 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của 33 nấm đảm P. chrysosporium 36210 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen lipH8 và plasmid 35 pCR2.1::lipH8 trên gel agarose 1,0% 3.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen lipH8 từ 36 chủng P. chrysosporium 36210 với trình tự amino acid của các protein tương ứng từ các chủng P. chrysosporium khác được đăng ký trên GenBank 3.4 Cây phân loại thể hiện sự tương đồng về trình tự amino acid 38 suy diễn của LiP H8 từ chủng P. chrysosporium 36210 và các trình tự LiP H8 tương ứng của các chủng P. chrysosporium khác 3.5 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pPIC9::lipH8 bằng hai 39 enzyme giới hạn 3.6 Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen lipH8 với khuôn 40 v 7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DNA là bộ gen của P. pastoris tái tổ hợp 3.7 Điện di đồ protein dịch nuôi cấy của năm dòng P. pastoris 42 tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel 3.8. Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau 43 84 giờ nuôi cấy 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8 45 của chủng P. pastoris C132 3.10 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi 51 chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo 110 dung tích 7,5 lít 3.11. Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau 52 quá trình tối ưu 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 53 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh 54 tổng hợp bởi P. pastoris C132 3.14 Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các 55 nhiệt độ khác nhau theo thời gian 3.15 Độ bền của rLiP H8 ở các pH khác nhau theo thời gian 55 vi 8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii an m c c c i c i iii an m c c c ản an m c c c n vi đ v M cl c vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 c ức năn 3 1.2. H enzyme p ân ủy li nin 4 1.2.1. Lignin peroxidase 5 1.2.2. Mangan peroxidase 6 1.2.3. Laccase 7 1.3. Vi sin 8 1.1. Lignin-cấ rúc ậ p ân ủy li nin 1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi) 8 1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn 9 1.4. Ứn d n của li nin peroxidase 1.5. T n n n iên cứ iể 10 i n lignin peroxidase rên iới 11 ại Vi Nam 1.6. Vec or iể i n pPIC9 iể i n nấm men 12 1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9 12 1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men 13 1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115 14 1.7. Mộ số y 16 ố ản ưởn ới q rn iể i n enzyme i ổ ợp ron P. pastoris 1.7.1. Ảnh hưởng methanol 16 vii 9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.7.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 17 1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men 18 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vậ li 20 2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid 20 2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 20 2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy 21 2.2. P ươn p p n iên cứ 22 2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase 22 2.2.2. Điện di DNA/RNA trên gel agarose 22 2.2.3. Tách chiết RNA tổng số từ P. chrysosporium 36210 23 2.2.4. Tổng hợp cDNA 24 2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa LiP H8 từ cDNA 24 2.2.6. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 25 2.2.7. Đăng ký trình tự lipH8 trên GenBank 25 2.2.8. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn 25 2.2.9. Phản ứng ghép nối gen 26 2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli và P. pastoris 26 2.2.11. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P. 28 pastoris 2.2.12. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp 28 2.2.13. Sàng lọc dòng P. pastoris biểu hiện LiP H8 tái tổ hợp hoạt 29 tính cao 2.2.14. Xác định hàm lượng protein 29 2.2.15. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS 30 2.2.16. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men biểu hiện rLiP 30 H8 của chủng P. pastoris C132 2.2.17. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính và độ bền của 31 viii 10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Nhân dòng gen lipH8 33 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 33 3.1.2. Khuếch đại gen lipH8 từ cDNA 34 3.1.3. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 của P. 35 chrysosporium 36210 3.2. T i ec or iể i n rLiP H8 trong P. pastoris 3.3. Tạo c ủn P. pastoris i ổ ợp iể 3.4. Biể i n x cđn 38 i n rLiP H8 39 oạ ín rLiP H8 ron c c dòn P. 41 pastoris i ổ ợp 3.5. Nân cao ả năn iể i n rLiP H8 của c ủn P. pastoris C132 43 3.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 43 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 45 3.5.3. Nồng độ chất cảm ứng methanol 46 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và peptone 48 3.5.5. Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate 49 3.6. Độn 50 i lên men sin 3.7. N iên cứ c c y ổn ố ản ợp rLiP H8 ưởn ới oạ ín độ ền của rLiP 53 H8 3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của rLiP H8 53 3.7.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ xúc tác của rLiP H8 54 3.7.3. Độ bền của rLiP H8 với nhiệt độ 53 3.7.4. Độ bền của rLiP H8 với pH 55 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62 PHỤ LỤC 63 ix 11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật, có mặt trong nguyên liệu, phụ phẩm và chất thải của sản xuất nông, lâm, công nghiệp. Lignocellulose chứa lignin, hemicellulose và cellulose; trong đó lignin (chiếm khoảng 20÷30% sinh khối khô) là hợp chất khó bị phân giải nhất. Thành phần hóa học chính của lignin là polymer của các phenylpropanoid phức tạp được cấu trúc từ ba loại rượu thơm coniferyl, sinapsyl và p-coumaryl (Elis, 2002). Trong quy trình sản xuất bột giấy, cần phải loại bỏ lignin khỏi sinh khối gỗ và giữ lại bột giấy (cellulose và một phần hemicellulose) sao cho độ dài, độ bền của xơ sợi chứa cellulose được bảo tồn cao nhất. Một trong các hướng có triển vọng được quan tâm nhiều là sử dụng các enzyme phân hủy lignin trong sản xuất bột giấy và giấy (xử lý dăm mảnh nguyên liệu, tẩy trắng bột giấy, khử màu nước thải) nhằm giảm sử dụng hóa chất và giảm thải các chất độc hại ra môi trường (Elis, 2002). Các enzyme phân hủy lignin quan trọng nhất là lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase (Kirk et al., 1996; Gettemy et al., 1998; Wang et al., 2004; Hong et al., 2006). Lignin peroxidase là enzyme phân hủy lignin mạnh nhất, oxy hóa các tiểu phần lignin không chứa hợp chất phenol (chiếm 90% polymer của các phenylpropanoide) (Gold et al., 2000; Martinez, 2002). Các nghiên cứu trước đây cho thấy khi sử dụng enzyme phân hủy lignin từ Phanerochaete chrysosporium để tẩy trắng bột giấy cho phép giảm 2/3 hàm lượng lignin, độ trắng của bột tăng 54,6% (Elis, 2002). Ngoài ra, các enzyme phân hủy lignin được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác như xử lý nguyên liệu phế phụ phẩm nông nghiệp trong sản xuất cồn nhiên liệu, xử lý các nguồn ô nhiễm lignin hay các hợp chất hydrocarbon đa vòng thơm (Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAH)... Lignin peroxidase được sinh tổng hợp bởi nhiều loại vi khuẩn (thuộc các chi Pesudomonas, Bacillus, Serritia...), xạ khuẩn (thuộc các chi Streptomyces, Thermomonospora...), nấm mốc (Aspergillus) hay nấm đảm 1 12Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (Phanerochaete, Trametes...) sống ký sinh trên thân thực vật bị mục hoặc trong các nguồn cơ chất có chứa lignin. Có 6 loại isozyme LiP bao gồm H1, H2, H6, H7, H8 và H10 đã được tách từ dịch nuôi cấy của P. Chrysosporium (Leisola et al., 1987; Ollikka et al., 1993). Các isozyme này được cho rằng có thể tạo ra từ quá trình sửa đổi các protein sau quá trình dịch mã (posttranslational modification). Các gen mã hóa enzyme H2, H6, H8 và H10 đã được xác định và giải trình tự trong khi một số gen mã hóa các isozyme LiP khác chưa được xác định. Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả. Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996). Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P. chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004), đã được thực hiện thành công trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái tổ hợp sử dụng vector pGV1503, hoạt tính enzyme đạt 1,125 nkat/mg. Trong khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP H8 trong P. methanolica có hoạt tính lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector pMETA và 1933 U/L đối với pMETαA (Wang et al., 2004). Vì vậy, biểu hiện LiP H8 trong các vi sinh vật khác nhau nhằm thu LiP hoạt tính cao đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới quan tâm (Doyle, Smith, 1996; Martinez, 2002; Wang et al., 2004). Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các isozyme LiP từ P. chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của của luận văn này là:”Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8 của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris“ nhằm thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 13Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lignin-cấu trúc và chức năng Lignin là một polymer không tham gia vào quá trình trao đổi chất trong thực vật. Nó thường tập trung ở các mô hoá gỗ, đóng vai trò như chất liên kết các tế bào, làm tăng sức bền cơ học, khả năng chống thấm, ngăn chặn sự xâm nhập của các chất độc, các enzyme vi sinh vật và các tác động khác từ bên ngoài. Lignin có cấu trúc 3 chiều không đồng nhất và là đại phân tử với khối lượng 600÷1000 kDa. Tuy phức tạp, nhưng về cơ bản, lignin được hình thành từ 3 loại monomer: p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol (Hình 1.1). Các monomer này được tích hợp vào lignin dưới dạng các phenylpropanoid tương ứng là: p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringal (S). Hình 1.1. Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin Tùy theo từng loài thực vật mà tỷ lệ ba thành phần này trong lignin khác nhau. Lignin của cây hạt trần chứa chủ yếu dạng G và một lượng nhỏ H; của cây hạt kín hai lá mầm thường chứa hỗn hợp G và S và ít dạng H, còn ở cây một lá mầm thì là hỗn hợp của cả ba dạng trên. Nhiều loại cỏ có lignin dạng G, trong khi ở cây cọ chủ yếu là dạng S (http://en.wikipedia.org/wiki/Lignin). Như vậy, lignin thực chất không phải là một hợp chất có công thức xác định mà là nhiều loại hợp chất khác nhau tùy thuộc vào thành phần và số 3 14Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lượng các tiểu phần cấu tạo nên nó cũng như cơ chế kết hợp giữa các thành phần đó. Hình 1.2. Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin Do sự phức tạp trong cấu trúc lignin với các tiểu phần khác nhau bắt cặp với nhau một cách ngẫu nhiên, nên cho đến nay người ta vẫn chưa mô tả được chính xác và đầy đủ cấu trúc hoá học của lignin. 1.2. Hệ enzyme phân hủy lignin Trong thực tế, lignin được phân giải bằng quá trình oxy hóa phức tạp, nhưng nhờ tác động của một số enzyme cơ bản (lignin peroxidase (LiP), mangan peroxidase (MnP) và laccase) do nấm mục trắng và vi sinh vật sinh tổng hợp. Ngoài ra, một thành phần quan trọng của hệ thống enzyme phân huỷ lignin là các enzyme oxidase, bao gồm: glyoxal oxidase, glucose oxidase, aryl alcohol oxidase… Các enzyme này không trực tiếp tham gia vào cơ chế phân cắt mạch lignin nhưng chúng tiến hành phản ứng oxy hoá chuyển C2H2O2 (có sự tham gia của O2) thành H2O2 cần thiết cho hoạt động của các peroxidase ngoại bào. 4 15Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2.1. Lignin peroxidase Lignin peroxidase (EC 1.11.1.14) được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium sau nhiều năm nghiên cứu độc lập của hai nhà khoa học người Mỹ và người Nhật (Tien, Kirk, 1983). Sau này enzyme này còn tìm thấy trong các nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate, P. tremellose, Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces viridosporus, Thermomonospora fusca… Lignin peroxidase là một glycoprotein có nhân heme, khối lượng phân tử 38÷43 kDa. pH tối thích cho hoạt động của lignin peroxidase tương đối thấp, khoảng 2,5÷3,0 và điểm đẳng điện pI là 3,2÷4,0. Lignin peroxidase hoạt động với sự tham gia của hydro peroxide (H2O2) sinh ra từ các enzyme khác, tiến hành phản ứng oxy hoá nhường electron cho các cơ chất. Cơ chất của LiP là veratryl alcohol và các phenolic acid nhưng chủ yếu là veratryl alcohol. Nó thực hiện xúc tác các quá trình oxy hóa khác nhau trong mối liên kết aryl của phức hợp lignin, cắt mối liên kết C-C của nhánh bên lignin (Hình 1.3), thực hiện oxy hóa veratryl alcohol và các cấu trúc tương tự tạo thành aldehyde và ketone, phân cắt mối liên kết intradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic methylene (Hình 1.4). Hình 1.3. Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của polymer lignin, tạo thành các oligomer 5 16Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.4. Cơ chế phân cắt mối liên kết C-C tạo thành gốc aryl Lignin peroxidase phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế tiếp chuyển dịch một điện tử, hình thành cation-gốc tự do trung gian. Do thế oxy hóa khử cao (1.5V), lignin peroxidase cũng có thể oxy hóa đơn vị mắt xích của lignin là phenyl propan ở dạng không phenolic (Schoemaker, Piontek, 1996). Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của lignin peroxidase trong quá trình phân giải lignin và các thực vật chứa lignin. Enzyme này có thể phân giải lignin trong dung dịch loãng, oxy hóa và phân giải hàng loạt dimer và oligomer tương ứng với các cấu trúc của lignin trong điều kiện phòng thí nghiệm, xúc tác cho quá trình tạo ra các phân tử oxy hoạt tính. 1.2.2. Mangan peroxidase Mangan peroxidase được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984. Mangan peroxidase là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 40÷48 kDa và có điểm đẳng điện pI 2,9÷7,0. Ngoài P. chrysosporium, MnP còn được tìm thấy trong nấm mục trắng khác T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma frowadic. Enzyme này hoạt động như một phenoloxydase trên cơ chất phenolic bằng cách sử dụng Mn 3+/Mn2+ 6 17Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn làm cặp oxy hoá khử trung gian. Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia vào phản ứng oxy hoá hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenolic của lignin (có - OH phenol tự do). Mangan peroxidase tấn công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc có khối lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử mangan gián tiếp (Johansson, Nyman, 1993; Gold et al., 2000). 1.2.3. Laccase Laccase (benzeldiol: O2 oxydoreductase) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải lignin. Phần lớn nấm mục trắng có khả năng sản sinh ra enzyme này (Donal, Muralidhara, 1993; Bononi et al., 2005). Tất cả các laccase đều là glycoprotein. Enzyme này có chứa 4 ion đồng, phân bố ở ba vị trí liên kết khác nhau (một ion dạng I, một ion dạng II và hai ion dạng III) và mọi ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác. Ion đồng dạng I có vai trò là một ion vận chuyển điện tử từ cơ chất tới tâm hoạt động của enzyme được tạo thành bởi ion dạng II và dạng III, là nơi chúng liên kết với oxy và bị khử trở thành hai phân tử nước. Các ion đồng này giúp cho quá trình khử 4 electron của phân tử oxy không tạo thành chất trung gian là oxy nguyên tử hoạt động mạnh. Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của laccase Laccase là enzyme oxy hóa, thực hiện thủy phân các hợp chất hydroxyl thơm hoặc các amino thơm tới các gốc phenol và gốc amino tự do. Laccase cũng oxy hóa cấu trúc lignin phenol thành các gốc phenol tự do dẫn đến thay đổi các chất quinon. Sự thay đổi này dẫn tới việc phân tách bộ khung cacboncacbon hoặc cacbon-oxy bên trong các tiểu đơn vị phenylpropan của lignin. 7 18Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết quả là hai chuỗi bên và các vòng thơm bị phân hủy. Đây là những bước phản ứng quan trọng cho quá trình chuyển hóa, phân hủy các hợp chất lignin. Trong quá trình xúc tác, laccase kết hợp với một số enzyme như glucose oxydase, lignin peroxidase….thực hiện phân cắt các mối liên kết cacboncacbon, cacbon-oxy trong cấu trúc lignin và hợp chất lignin thành các vòng thơm có cấu trúc đơn giản hơn. 1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin Trong tự nhiên, gỗ là cơ chất khó bị phân huỷ do thành phần hoá học và kết cấu đặc trưng của nó. Các polyme cấu trúc chính của gỗ bao gồm cellulose (chiếm 40÷50 % trọng lượng khô của gỗ), hemicellulose (25÷40%), lignin (20÷30%) và một lượng nhỏ protein (<5%). Như vậy trong gỗ có chứa rất ít nitơ, mà nitơ lại cần để tạo ra các enzyme phân huỷ các hợp phần này. Ngoài ra, lignin nằm trong vách tế bào cũng cản trở sự phân hủy gỗ do nó hạn chế khả năng thấm nước của cellulose và hemicellulose, do vậy cũng cản trở sự phân hủy của các polysacaride này; đồng thời nó hình thành một rào chắn các enzyme vi sinh vật tấn công 2 thành phần còn lại. Bên cạnh đó, trong gỗ luôn có các chất độc như ta-nanh, terpen, stilbenen, flavonoit và troponol khiến cho côn trùng và vi sinh vật khó tiêu hóa được gỗ. Mặc dầu vậy, vẫn có một số loài nấm và vi sinh vật tấn công được vào thành tế bào gỗ và phân hủy mô gỗ. 1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi) Tác nhân làm mục gỗ nhiều nhất trong tự nhiên là các loại nấm thuộc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) - tác nhân cần thiết trong quá trình tuần hoàn sinh khối và làm giàu đất cho hệ sinh thái rừng. Theo cách thức tấn công vách tế bào mà chúng được chia thành ba loại: nấm mục trắng, mục nâu và mục xốp. Tuy nhiên, chỉ có nấm mục trắng là có khả năng phân hủy lignin, còn hai loại nấm kia chủ yếu tấn công vào cellulose và hemicellulose. Nấm mục trắng là tác nhân phân huỷ gỗ hiệu quả nhất, chúng có khả năng khoáng hoá hoàn toàn các thành phần của gỗ, tạo ra CO 2 và nước. Đúng 8 19Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn với tên gọi của mình, nấm mục trắng có thể phân hủy cả cellulose, hemicellulose và lignin, khiến cho vị trí thân gỗ bị nấm tấn công trở thành màu trắng. Tuy có khả năng phân huỷ triệt để lignin, chúng lại không thể sử dụng lignin như nguồn cacbon duy nhất. Người ta cho rằng chúng phân giải lignin để tiếp cận nguồn nitơ và cacbon có trong các thành phần protein và cacbonhydrat còn lại (Highley, Dashek, 1998). Có hai dạng nấm mục trắng chủ yếu được phân loại dựa trên tính đặc hiệu khi tấn công. Dạng thứ nhất là phân hủy có chọn lọc, ở giai đoạn đầu lignin được phân hủy nhanh hơn so với cellulose và hemicellulose, khiến cho gỗ mất màu nhưng vẫn giữ được một phần cấu trúc. Dạng thứ hai là phân hủy đồng thời, hệ enzyme do những loài nấm này sinh ra có thể phân hủy cả ba thành phần chính của gỗ với tốc độ gần như nhau, thân gỗ bị phá hủy hoàn toàn, trở thành dạng mùn trắng (Highley, Dashek, 1998). Tuy nhiên, tốc độ phân huỷ các thành phần cacbonhydrat của nấm mục trắng vẫn chậm hơn nấm mục nâu và nấm mục xốp. Nấm mục trắng tấn công vào các cây gỗ cứng. Các loài nấm mục trắng có hệ enzyme phân giải lignin mạnh được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, T. hirsuta, chi Cerrena (C. unicolor), Pleurotus và một số chi khác. 1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn Các vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas, Acinetobacter và Xanthomonas được cho là có tham gia vào quá trình phân giải lignin nhưng vai trò của chúng vẫn chưa thực sự rõ ràng. Một số tác giả đã phân lập được vi khuẩn thuộc chi Agrobacterium, Burkholderia, Arthrobacter và Sphingomonas thường xuyên có mặt trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium. Quan hệ giữa vi khuẩn và loài nấm này được giả thiết là cộng sinh, vì chúng có khả năng phân giải các hợp chất thơm là sản phẩm từ quá trình phân hủy lignin của nấm. Một số nghiên cứu mới đây đã cho thấy khả năng phân giải lignin của các vi khuẩn thuộc chi Clostridium đã chứng minh được rằng lignin cũng có thể bị phân huỷ trong điều kiện yếm khí (Crawford, 1978). 9 20Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn