Tài liệu Tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas haloplanktis ant505 trong e. coli và nghiên cứu tính chất của chúng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Trƣờng Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Văn Trƣờng - phó trưởng phòng Di truyền vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị cán bộ phòng Di truyền vi sinh vật đã giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Tác giả Đỗ Thị Thu Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện từ tháng 9 năm 2010 tới tháng 8 năm 2011. Thái Nguyên, ngày 24 tháng 09 năm 2011 Tác giả Đỗ Thị Thu Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cảm ơn Lời cam đoan MỤC LỤC ......................................................................................................... i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Vi khuẩn ưa lạnh ............................................................................... 3 1.2. Nơi sống của vi khuẩn ưa lạnh........................................................... 4 1.3. Enzyme thích ứng lạnh ...................................................................... 4 1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp ..... 6 1.5. Pectin và pectinase ............................................................................. 8 1.5.1. Pectin ............................................................................................... 8 1.5.2. Pectinase.......................................................................................... 9 1.5.2.1. Phân loại pectinase ....................................................................... 9 1.5.2.2. Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase................................. 11 1.6. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp ........................................... 14 1.6.1. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây .... 14 1.6.2. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may .......................... 14 1.6.3. Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học ............................. 14 1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...................................... 15 1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................ 15 1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................. 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 17 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ................................. 17 2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid........................................................... 17 2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị ...................................................... 17 2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 18 2.3.1. Phương pháp tách DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505............................................ 18 2.3.2. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ................................ 19 2.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen ............................................... 20 2.3.4. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen ......................... 21 2.3.5. Phương pháp giải trình tự gen....................................................... 25 2.3.6. Phương pháp biểu hiện gen ........................................................... 25 2.3.7. Phương pháp thu enzyme ngoại bào, nội bào ............................... 25 2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase .............................. 26 2.3.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide .................. 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 29 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ...................................................... 29 3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505.............................................. 29 3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli ....................................... 30 3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC .......................................................... 31 3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC .................................................. 33 3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC ........................... 33 3.5.2. Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào chủng E. coli BL21 ................................................................................. 34 3.5.3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi trường thạch ............................................................................................ 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 3.5.4. Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC .... 35 3.6. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trường lỏng ....... 36 3.7. Nghiên cứu một số tính chất của rPelC ........................................... 37 3.7.1. Hoạt tính pectate lyase của rPelC ................................................. 37 3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme ............ 38 3.7.3. Ảnh hưởng của ion Ca²+ và Na+ đến hoạt tính pectinase của rPelC .... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt STT Chữ viết đầy đủ 1. ARN Ribonucleic Acid 2. bp Base pair 3. Cs Cộng sự 4. CTAB Cetyl trimethylammonium bromide 5. dH2O Nước khử ion 6. DNA Deoxyribonucleic acid 7. dNTP Deoxyribonucleotide 8. E. coli Escherichia coli 9. EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit 10. EtBr Ethydium bromide 11. IPTG Isopropylthio--D-galactoside 12. Kb Kilobase 13. kDa Kilo Dalton 14. LB Luria and Bertani 15. PCR Polymerase Chain Reaction 16. SDS Sodium dodecyl sulfate 17. TAE Tris - acetate - EDTA 18. v/p Vòng / phút 19. VSV Vi sinh vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp (Ohgiya, 1999) ........ 7 Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990) ..................... 10 Bảng 2.1. Chu kỳ phản ứng PCR .................................................................... 20 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................... 21 Bảng 2.3. Công thức pha gel tách (12%) ........................................................ 27 Bảng 2.4. Công thức pha gel cô (5%) ............................................................. 27 Bảng 3.1. Hoạt tính pectinase của rPelC khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau ...................................................................................... 36 Bảng 3.2. Phát hiện liên kết đôi trong sản phẩm sau phản ứng phân cắt pectin acid của rPelC..................................................................... 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV ....................................... 5 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin .............................................. 9 Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases. ................................ 11 Hình 1.4. Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. ..... 12 Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt ............................................ 21 Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 ..................................................................... 29 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC ............................... 30 Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin...................................... 31 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC .................... 31 Hình 3.5. Trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC ............................ 32 Hình 3.6. Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym hạn chế ............................................................................................ 33 Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E. coli BL21(DE3) .............................................................................. 34 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các thể biến nạp..................................................................................... 35 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự có mặt của pelC trong các chủng BL21/pET43pelC ........................................................................... 35 Hình 3.10. Kết quả biểu hiện rPelC trong E. coli BL21(DE3) ở 30oC ........... 37 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rPelC .................. 39 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme rPelC .......................... 39 Hình 3.13. Ảnh hưởng của ion Ca²+ đến hoạt tính enzyme rPelC .................. 40 Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion Na+ đến hoạt tính enzyme rPelC ................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Pectinase là một thuật ngữ chung cho các enzyme có khả năng phân hủy cơ chất pectin, một loại polysaccharide có nhiều trong tế bào thực vật. Enzyme pectinase thường được sử dụng trong các quá trình liên quan đến sự biến đổi của nguyên liệu thực vật như đẩy nhanh tiến độ khai thác nước ép trái cây từ trái cây chín và được sử dụng trong sản xuất rượu vang từ những năm 1960. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng của enzyme pectinase trong các ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt may, đặc biệt thể hiện rõ trong ngành công nghiệp tẩy trắng sợi bông [45]. Tuy nhiên, đối với một số ngành công nghiệp như ngành công nghiệp gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzyme phải thực hiện ở nhiệt độ thấp chính vì vậy mà việc sử dụng enzyme lạnh đóng vai trò quan trọng giúp nâng cao chất lượng sản phẩm. Một trong những enzyme lạnh được các nhà công nghệ quan tâm là pectinase từ các vi sinh vật sinh trưởng ở nhiệt độ thấp do các ưu điểm của chúng như: tham gia xúc tác phản ứng ở nhiệt độ thường (20-30oC) nên không cần phải tốn năng lượng ủ ấm; bảo vệ được các chất dễ phân hủy trong dịch quả như vitamin, hương vị; dễ biến tính bởi nhiệt độ. Gen mã hóa cho pectinase (pelC) là một trong những gen có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 đã được TS. Lê Văn Trường và cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học) tạo dòng và giải trình tự trong những nghiên cứu trước đây. Tuy nhiên cho đến nay enzyme này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ tính chất cũng như khả năng xúc tác phân hủy cơ chất pectin. Chính vì vậy, để hiểu rõ tính chất của enzyme này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 trong E. coli và nghiên cứu tính chất của chúng”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu: - Biểu hiện được enzyme pectinase PelC tái tổ hợp hoạt động ở nhiệt độ thấp, phân lập từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp. Nội dung nghiên cứu: 1. Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505. 2. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC trong E. coli. 3. Biểu hiện gen pelC trong chủng vi khuẩn E. coli BL21. 4. Nghiên cứu tính chất của PelC tái tổ hợp. Ý nghĩa của đề tài: Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ tính chất của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật chịu lạnh khi tham gia xúc tác phản ứng phân hủy cơ chất pectin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn ƣa lạnh Trên trái đất, các môi trường có nhiệt độ thấp chiếm ưu thế. Hơn 80% sinh quyển là môi trường lạnh giá, và khoảng 90% đại dương lạnh hơn mức 5oC [19]. Rất nhiều vi sinh vật trong môi trường đại dương thích nghi với điều kiện nhiệt độ thấp đó và được phân loại như là các sinh vật ưa lạnh hay sinh vật có khả năng chịu lạnh. Thuật ngữ “sinh vật ưa lạnh” được nhắc đến lần đầu tiên năm 1902 bởi Schmidt-Nielsen để miêu tả những vi khuẩn có khả năng sống ở mức 0oC [27]. Trong thực tế, không có nguyên do cụ thể nào để giới hạn việc sử dụng thuật ngữ ưa lạnh hay chịu lạnh đối với vi khuẩn hay sinh vật nhân sơ. Sinh vật ưa lạnh có thể là nhiều loài nấm, tảo [20], [23], côn trùng [22], cá [12] và có thể cả thực vật, nếu chúng trải qua điều kiện sống ở nhiệt độ thấp, ví dụ ở mức nào đó dưới 5oC. Trong số các VSV có thể sinh trưởng ở khoảng 20oC hoặc hơn, cần phải phân biệt sinh vật ưa lạnh với sinh vật chịu lạnh bởi vì sự khác biệt trong phân bố sinh thái và sự thích nghi sinh hóa của cả hai nhóm [33], [34]. Khái niệm được Morita đề xuất như sau: sinh vật ưa lạnh là những vi sinh vật có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 0oC, và nhiệt độ sinh trưởng tối ưu dưới 15oC. Sinh vật ưa lạnh không có khả năng sinh trưởng ở mức 20oC trở lên. Trong khi đó, sinh vật chịu lạnh sinh trưởng tốt hơn ở mức nhiệt độ trên 20-25oC và có thể có giới hạn sinh trưởng trên ở mức 40oC [27]. Khái niệm cổ điển đó của Morita được sử dụng thường xuyên trong nhiều tài liệu. Tuy nhiên, định nghĩa này không được rõ ràng ở ba điểm chính. Thứ nhất, mức nhiệt độ giới hạn được lựa chọn khá tùy ý và không tương ứng với sự phân chia rõ ràng của bất kỳ quá trình sinh học hoặc điều kiện môi trường nào. Thứ hai, định nghĩa của Morita không thể áp dụng được với hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Cuối cùng, VSV giống như các đơn vị nhiệt động: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 nhiệt độ nuôi cấy tăng thì tốc độ phản ứng tăng và tốc độ sinh trưởng tăng [13]. Vì những nguyên do đó, các tác giả gần đây bắt đầu sử dụng thuật ngữ chung sinh vật ưa lạnh đối với tất cả các VSV mà sinh trưởng tốt ở mức nhiệt độ quanh điểm đóng băng của nước thay vì sử dụng thuật ngữ vi sinh vật ưa lạnh và chịu lạnh riêng rẽ [10], [35]. 1.2. Nơi sống của vi khuẩn ƣa lạnh VSV ưa lạnh đã thống trị thành công các môi trường lạnh vĩnh cửu từ biển sâu cho tới vùng núi và vùng cực. Hoạt động của vi khuẩn ở nhiệt độ trên rất hạn chế bởi chỉ lượng nhỏ nước không bị đông cứng bên trong tầng đất bị đóng băng vĩnh cửu hoặc lớp băng, và bởi các dòng biển. Ở những nơi đó có nồng độ muối, các chất chất nhày hoặc chất hạt cao, và dòng chảy chất lỏng được duy trì bởi chênh lệch nồng độ và nhiệt độ. Mặc cho các khó khăn đó, sự sống vẫn phát triển mạnh trong những môi trường đó với sự đa dạng sinh học đáng chú ý của chính các vi khuẩn, nấm (đặc biệt là nấm men) và vi tảo. Trong số các vi khuẩn đã được tìm thấy, thường gặp nhất là các vi khuẩn Gram âm α-, β-, γ-proteobacteria (Pseudomonas spp. và Vibrio spp.) và ngành CytophagaFlavobacterium-Bacteriodes. Các chủng vi khuẩn Gram dương thường được phát hiện là vi khuẩn họ Coryne (Arthrobacter sp. và Micrococus sp.) [29]. Hầu hết chúng được phân lập dễ dàng từ môi trường lạnh giá tự nhiên và được nuôi cấy với methanogen trong phòng thí nghiệm. Chúng được phân lập từ một hồ ở Nam cực [15], [16], hồ nước ngọt ở Thụy Sỹ [40], lớp trầm tích đại dương ở Alaska [9] và ở biển Baltic [41], [46]. Để có thể sinh trưởng, các vi sinh vật ưa lạnh phải có các enzyme có hoạt tính sinh học cao trong điều kiện nhiệt độ thấp. Những enzyme đó được gọi là enzyme thích ứng lạnh. 1.3. Enzyme thích ứng lạnh Enzyme thích ứng lạnh là những enzyme có hoạt tính sinh học cao ở nhiệt độ thấp. Hoạt tính riêng biệt của enzyme thích ứng lạnh ở khoảng nhiệt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 độ 0-30oC cao hơn hoạt tính của các enzyme ưa nhiệt trung bình ở cùng nhiệt độ. Các enzyme thích ứng lạnh bị biến tính ở mức nhiệt độ cao hơn [17]. Jones và cs đã có báo cáo rằng fructose-1,6-bisphosphate aldolase và gluco-6phosphate dehydrogenase của Vibrio marinus sẽ mất 100% hoạt tính sau 30 phút ở 35-36oC [21]. Theo Morita, malic dehydregenase bán tinh sạch của chủng Vibrio marinus MP-1 sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 20oC, trong khi nhiệt độ hoạt động tối ưu là khoảng 15-20oC [27]. Hay như lactate dehydrogenase của VSV ưa lạnh V. marinus, có hoạt tính tối đa ở 10-15oC và mất hoạt tính ở 40oC [26]. Ohgiya là người đầu tiên đề xuất phân loại những enzyme thích ứng lạnh của VSV vào ba nhóm (hình 1.1): Nhóm I: Nhạy cảm nhiệt. Đặc tính của chúng tương tự với enzyme ưa nhiệt trung bình. Nhóm II: Nhạy cảm nhiệt và có hoạt tính cao hơn tương đối so với enzyme ưa nhiệt trung bình khi ở điều kiện nhiệt độ thấp. Nhóm III: Bền với nhiệt như các enzyme ưa nhiệt trung bình nhưng hoạt tính cao hơn enzyme ưa nhiệt trung bình ở điều kiện nhiệt độ thấp. Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV (A) Nhóm I, (B) Nhóm II (C) Nhóm III. Đường gạch đứt: enzyme của VSV ưa nhiệt trung bình, VSV ưa nhiệt. Đường gạch liền: enzyme của VSV ưa lạnh (Theo Ohgiya và cs, 1999). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp Phần lớn các enzyme ứng dụng trong công nghiệp là có nguồn gốc từ VSV. Hầu hết các enzyme của vi khuẩn dùng trong công nghiệp được sản sinh bởi các sinh vật ưa nhiệt trung bình. Các enzyme sinh vật ưa nóng có vai trò quan trọng trong công nghiệp bởi vì với tính bền nhiệt biến chúng thành chất xúc tác sinh học lý tưởng cho nhiều phản ứng. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp (ví dụ như công nghiệp gỗ và bơ sữa), phản ứng với enzyme phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp. Ứng dụng enzyme thích ứng lạnh sẽ mang lại nhiều lợi ích hơn enzyme từ sinh vật ưa nhiệt trung bình. Ứng dụng sinh học của enzyme thích ứng lạnh còn rất nhiều tiềm năng, bởi vì: - Tiết kiệm năng lượng: Sử dụng enzyme hoạt tính lạnh giúp tiết kiệm năng lượng. - Hạn chế sử dụng các hợp chất dễ bay hơi, không bền: Sử dụng các enzyme thích ứng lạnh ở nhiệt độ thấp giúp tiết kiệm sử dụng các hợp chất không bền hay dễ bay hơi ở quá trình chuyển hóa sinh học trong sản xuất thực phẩm. - Ngăn ngừa nhiễm khuẩn: Sản xuất thực phẩm ở nhiệt độ thấp giúp ngăn chặn sự phát triển của các sinh vật ưa nhiệt trung bình gây hại. - Bất hoạt enzyme: Điều chỉnh nhiệt độ để bất hoạt các enzyme nhạy nhiệt một cách dễ dàng. Một vài ứng dụng điển hình của enzyme thích ứng lạnh được tóm tắt trong bảng 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp (Ohgiya, 1999) Ứng dụng Enzyme Ƣu điểm Chất giặt tẩy Protease, lipase, cellulose... Sử dụng với nước máy Công nghiệp thực phẩm - Thay đổi thành phần Β-Galactosidase, lipase Giữ gìn sự tươi ngon - Cải thiện hương vị Protease, lipase, v.v... Giữ gìn sự tươi ngon - Loại bỏ phần vảy cá Protease Bảo quản chất lượng sản phẩm - Gạn lọc nước ép trái Pectinase, cellulose cây - Bảo quản Tổng hợp enzyme Xử lý nước thải Lysozyme, oxidase glucose Giữ hương vị Nâng cao hiệu quả bảo quản Lipase, Nitrit hydratase Với nguyên liệu nhạy nhiệt, dễ bay hơi Catalase Tiêu tốn ít năng lượng hơn Công nghệ sinh học - Tạo tế bào trần Enzyme phá hủy thành tế Khả năng sống sót cao bào - Sinh học phân tử Phosphatase, uracil DNA Hoàn toàn bất hoạt nhiệt glycosylase Những enzyme dùng trong công nghiệp giặt tẩy là protease, lipase, α-amylase và cellulase. Lợi ích nó mang lại là giảm tiêu tốn năng lượng và giảm hư hỏng, hao mòn khi giặt giũ. Hạn chế của enzyme thích ứng lạnh là chúng không bền khi được thêm vào sản phẩm cuối cùng sau thời gian dài lưu kho. Tuy nhiên, những enzyme đó thường là enzyme tái tổ hợp và tính ổn định của enzyme thích ứng lạnh ngày càng tăng bởi vì chúng ta ngày càng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 hiểu biết rõ hơn về cấu trúc cơ bản enzyme và kỹ thuật gây đột biến điểm định hướng, cũng như tạo đột biến ngẫu nhiên có thể thực hiện được [28], [43]. Trong sản xuất tơ sợi, các sợi bông thường nhô ra khỏi sợi chính, làm giảm độ mượt mà và thay đổi diện mạo trang phục [17]. Sử dụng các enzyme cellulase thích ứng lạnh có thể làm tăng độ mượt và mềm của vải bằng cách loại bỏ các sợi bông thừa và có thể nhanh chóng bất hoạt các enzyme này sau khi dùng. Để làm giảm hàm lượng lactose trong sữa, người ta có thể sử dụng enzyme β-galactosidase thích ứng lạnh. Ứng dụng pectinase trong sản xuất nước ép trái cây giúp nâng cao hiệu quả quá trình tách chiết và giảm độ sệt của sản phẩm. Pectinase thích ứng lạnh cũng tạo điều kiện cho phép quá trình sản xuất nước ép diễn ra ở nhiệt độ thấp. Điều đó giúp giữ chất lượng nước ép và cho phép bất hoạt enzyme bằng cách điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sau xử lý. 1.5. Pectin và pectinase 1.5.1. Pectin Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào thực vật bao gồm: pectin (polymethylgalacturonate), axit pectin (polygalacturonate) và oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị este hóa với methanol. Axit pectin là chất đa phân tử có khả năng hòa tan trong nước và có ít hơn 75% galacturonate bị methyl hóa. Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate. Oligomethylgalacturonate cũng là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa với C-6 [48]. Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau [18]. Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectic là galacturonan và rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan I. Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin. Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thường là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [48]. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở hình 1.2. Các đơn vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycosidic. Một số D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl-este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl [11], một số khác bị biến đổi thành dạng COO- hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH. Mức độ methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [36]. 1.5.2. Pectinase 1.5.2.1. Phân loại pectinase Các enzyme xúc tác phân hủy pectin được gọi chung là pectinase. Dựa vào cơ chế tác động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase được phân chia thành các loại như sau: (bảng 1.2). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990) Loại enzyme Esterase - Pectin methylesterase (pectin esterase) - Pectin acetylesterase* số EC Chất nền Sản phẩm 3.1.1.11 - Pectin - Pectin acid + Methanol - Thủy phân - Pectin - Oligogalacturonates - Monogalacturonate - Monogalacturonate - Monogalacturonate không no và saturate (n- 1) - Methyloligogalacturonates - Thủy phân - Thủy phân - Thủy phân - Thủy phân - Thủy phân - Oligogalacturates không no - Digalacturonates không no - Monogalacturonate không no - Methyloligogalacturonates không no - Phân cắt chuyển liên kết - Phân cắt chuyển liên kết - Phân cắt chuyển liên kết - Phân cắt chuyển liên kết - Pectin Polygalacturonase - Protopectinase 3.2.1.15 - Protopectin - Endopolygalacturonases 3.2.1.82 - Pectin acid - Exopolygalacturonases - Pectin acid - Oligogalacturonate hydrolases - Trigalactoronate - 4:5 Oligogalacturonate - 4:5 hydrolase không no (galacturonate)n - Endopolymethylgalacturonases - Pectin Lyase - Endopolygalacturonate lyases - Exopolygalacturonate lyase - Oligogalacturonate lyase - Endopolymethylgalacturonate lyase Cơ chế xúc tác 4.2.2.2 4.2.2.9 4.2.2.6 4.2.2.10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - Pectin acid - Pectin acid - Digalacturonates không no - Pectin http://www.lrc-tnu.edu.vn - Thủy phân