Tài liệu Tách collagen từ da cá basa bằng phương pháp hóa sinh

MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHUNG ........................................................................................................ 5 CHƯƠNG I........................................................................................................................... 8 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI .................................................................................. 8 1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa .................................................................................... 8 1.1/ Tên khoa học của cá basa ............................................................................................. 8 1.2/ Đặc điểm sinh học ........................................................................................................ 8 1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Việt Nam .................................................................... 8 1.4/ Thành phần hóa học của cá ........................................................................................ 9 2. Tính chất hoá học của collagen .................................................................................... 10 2.1/ Thành phần acid amin của collagen........................................................................... 10 2.2/ Cấu tạo phân tử .......................................................................................................... 12 2.2.1/ Đặc điểm cấu trúc phân tử của collagen (kiểu I).................................................... 12 2.2.2/ Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen ......................................................................... 13 2.3/ Kiểu liên kết và tính chất của các liên kết ngang trong chuỗi................................... 13 2.3.1/ Liên kết hydro ........................................................................................................... 13 2.3.2/ Các liên kết kỵ nước................................................................................................. 16 2.3.3/ Các liên kết ion......................................................................................................... 16 2.3.4/ Các liên kết cộng hoá trị........................................................................................... 16 3/ Các tính chất chức năng của collagen [7], [9].............................................................. 22 3.1/ Sự liên kết với nước của collagen ............................................................................... 22 3.2/ Sự trương nở ............................................................................................................... 24 3.3/ Khả năng tạo nhũ tương ............................................................................................. 24 3.4/ Sự tạo bọt...................................................................................................................... 24 3.5/ Tính tạo nhớt................................................................................................................ 25 4/ Ứng dụng của collagen.................................................................................................. 25 4.1/ Ứng dụng collagen trong thực phẩm.......................................................................... 25 4.2/ Ứng dụng collagen trong y dược................................................................................. 26 4.3/ Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm............................................................................ 27 5. Lịch sử nghiên cứu và tách chiết collagen .................................................................... 28 6. Quy trình tách chiết collagen ......................................................................................... 29 CHƯƠNG II ....................................................................................................................... 30 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 30 1/ Nguyên vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 30 1 2/ Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 30 CHƯƠNG III...................................................................................................................... 32 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................................................. 32 1/ Phân tích nguyên liệu ................................................................................................... 32 2/ Xử lý da cá bằng NaOH ................................................................................................ 32 3. Xử lý da cá bằng LasNa.................................................................................................. 33 4. Xử lý da cá bằng H2O2 .................................................................................................... 33 5. Chiết bằng acid acetic ..................................................................................................... 35 6. Chiết bằng acid acetic và pepsin..................................................................................... 38 7/ Xác định đặc tính lý hoá của dịch collagen thu được................................................... 41 7.1/ Kết quả phân tích collagen ở dạng tủa ....................................................................... 41 7.2/ Xác định phân tử lượng collagen bằng phương pháp điện di................................... 42 7.3/ Phân tích tính chất nhiệt của collagen dạng tủa........................................................ 42 CHƯƠNG IV...................................................................................................................... 44 KẾT LUẬN......................................................................................................................... 44 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng I.1. Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò .............. 10 Bảng I.2. Thành phần hóa học của cá (%) ....................................................................... 10 Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen ....................................................... 10 Bảng I.4: Các loại collagen ................................................................................................ 11 Bảng III.1: Thành phần da cá Basa nguyên liệu............................................................ 32 Bảng III.2: Kết quả xử lý da cá bằng NaOH..................................................................... 33 Bảng III.3: Kết quả xử lý da cá bằng LasNa 0.1M (1%) .................................................. 34 Bảng III.4: Kết quả xử lý da cá bằng H2O2 ....................................................................... 33 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình I.1: Sự hình thành tropocollagen và sự kết hợp các tropocollagen thành sợi collagen. .................................................................................................................... 12 Hình I.2: Sự hình thành sợi collagen ........................................................................ 13 Hình I.3: Liên kết hydro giữa hai chuỗi gần nhau (A và B) của collagen................ 14 Hình I.4: Các tương tác liên kết ngang của lysine xảy ra trong môi trường............. 19 Hình I.5: Các tương tác liên kết ngang của hydroxylysine xảy ra trong môi trường20 Hình I. 6 Ảnh hưởng của các anion đơn, đôi và đa hoá trị lên đường cong hydrat hoá theo pH...................................................................................................................... 23 Hình III.1: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất béo theo thời gian xử lý LasNa0.1M (1%) 34 o Hình III.2: Kết quả chiết collagen ở 3 C, tỷ lệ R/L = 1/50....................................... 35 Hình III.3: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/100 .................................... 35 Hình III.4: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/50 .................................... 36 Hình III.5: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/100 .................................. 36 Hình III.6: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/50 .................................... 37 Hình III.7: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/100 .................................. 37 Hình III.8: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/20....................................... 39 Hình III.9: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/80....................................... 39 Hình III.10: Kết quả chiết collagen ở 17oC, tỷ lệ R/L = 1/20................................... 40 Hình III.11: Kết quả chiết collagen ở 17oC, tỷ lệ R/L = 1/80................................... 40 Hình III.12: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/50................................... 41 Hình III.13:Hình chụp điện di collagen trên SDS-PAGE......................................... 42 Hình III.14: đồ thị nhiệt của collagen dạng tủa chụp bằng máy DSC1. ................... 43 4 GIỚI THIỆU CHUNG Thủy sản là một trong những ngành kinh tế quan trọng nhất của Việt Nam, một nước có đường bờ biển dài trên 3.200 km và một Vùng Đặc quyền Kinh tế (EEZ) có diện tích trên 1 triệu km2 và 1,4 triệu héc-ta diện tích đánh bắt nội đồng gồm sông ngòi, hồ đầm và ruộng cá có thể sử dụng để nuôi trồng thủy sản. 600.000 héc-ta tập trung ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. 800.000 héc-ta còn lại nằm ở vùng Đồng bằng sông Hồng phía Bắc và vùng duyên hải. Theo số liệu của ngành thủy sản, trên hải phận Việt Nam có khoảng 2.000 loài cá biển trong đó xấp xỉ 130 loài có giá trị thương mại. Lượng cá biển ước tính khoảng 4,2 triệu tấn và tổng nguồn tài nguyên có thể phục hồi ước tính khoảng 1,73 triệu tấn. Ngành chế biến thủy sản nói chung và ngành sản xuất cá, đặc biệt là sản xuất philê cá thải ra một lượng phế phụ phẩm rất lớn (Ở Việt Nam, chỉ tính riêng phế phụ phẩm từ sản xuất philê cá basa năm 2008 đã lên tới 700.000 tấn). Lượng phế phụ phẩm này ở nước ta từ trước đến nay chưa được quan tâm sử dụng đúng mức, thậm chí còn bị xem là chất thải. Tuy nhiên, ngày nay cùng với sự gia tăng dân số toàn cầu đã kéo theo nguy cơ về cạn kiệt các nguồn tài nguyên, cạn kiệt nguồn nguyên liệu, nhiên liệu cho sản xuất; chính vì vậy cả thế giới đang quan tâm đến vấn đề phát triển bền vững, sử dụng chất thải của ngành sản xuất này làm nguyên liệu cho ngành sản xuất khác. Theo hướng này, chất thải thủy sản có thể dùng để làm phân bón, chế biến thức ăn gia súc, làm bao bì sinh học, làm môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp các chế phẩm sinh học, là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất cần thiết cho ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm,… Colagen được xem như một loại dược liệu quý giúp kéo dài tuổi thanh xuân cho con người. Việc sản xuất colagen có nhiều ý nghĩa lớn đối với ngành thực phẩm, y học và ngành sản xuất mỹ phẩm + Trong sản xuất thực phẩm : collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, kẹo, ..., là nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. + Trong y học: collagen được ứng dụng rộng rãi trong việc chế tạo da nhân tạo để điều trị những vết bỏng sâu, ứng dụng trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình, làm vỏ bọc thuốc,… + Trong mỹ phẩm: colagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng; hơn nữa colagen còn dùng làm nguyên 5 liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội,các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm,… Trên thế giới, việc nghiên cứu về collagen đã tiến hành từ năm 1930 bởi người Đức; thời kỳ đó người ta tách chiết colagen chủ yếu từ da và xương của trâu, bò, lợn. Tuy nhiên đến năm 1990 đã bắt đầu một hướng chuyển biến mới: bắt đầu “tách chiết collagen từ da cá” phát minh này của các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk (Ba Lan) đã gây tiếng vang mạnh mẽ trên toàn cầu. Trong những năm gần đây nhiều quốc gia như: Mỹ, Đức, Pháp, Ba Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc đã đầu tư hàng triệu đôla vào nghiên cứu thu nhận collagen để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, da nhân tạo, chỉ tự tiêu, thuốc mỡ điều trị bỏng và các sản phẩm làm đẹp như mặt nạ, kem dưỡng da, dầu dưỡng tóc,… Nhận thấy nhu cầu rất lớn về collagen trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong những năm gần đây, đồng thời việc nghiên cứu tách chiết, sản xuất collagen ở Việt Nam hầu như chưa có, trong khi nguồn nguyên liệu da và xương cá để sản xuất collagen ở nước ta khá dồi dào, ổn định, giá rẻ và có tiềm năng phát triển nên chúng tôi chọn đề tài “Tách collagen từ da cá basa bằng phương pháp hoá sinh” với mong muốn tạo ra nguồn nguyên liệu collagen có giá cả phù hợp cung cấp cho các nhà sản xuất trong nước; nâng cao hiệu quả kinh tế cho các ngư dân và nhà sản xuất thủy sản; đồng thời cũng góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu công nghệ tách collagen từ da cá basa - Thu được collagen thô ở dạng dịch chiết Nội dung nghiên cứu - Thu thập tài liệu, tìm hiểu về cấu tạo, cấu trúc, tính chất, chức năng của collagen cá; các phương pháp tách chiết collagen. Các phương pháp xác định đặc tính hoá lý của collagen. - Phân tích nguyên liệu (da cá basa): xác định độ ẩm, độ tro, lipid, hàm lượng collagen,… - Xử lý da cá và chiết collagen từ da cá basa + Xử lý da cá bằng NaOH + Tách béo bằng LasNa + Xử lý da cá bằng H2O2 6 + Chiết collagen bằng acid acetic + Chiết collagen bằng phương pháp kết hợp enzym pepsin và acid acetic - Xác định một số đặc tính hoá lý của dịch chiết collagen: xác định phân tử lượng bằng SDS-PAGE, xác định nhiệt độ biến tính, hàm lượng tro, hàm lương béo, hàm lượng collagen 7 CHƯƠNG I CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI 1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa 1.1/ Tên khoa học của cá basa Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts, cá ba sa thuộc họ Pangasiidae, giống Pangasius, loài P. bocourti. Trước đây cá Basa được định danh là Pangasius pangasius (Hamilton) (Mai Đình Yên et al., 1992; Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương, 1993), Pangasius nasutus (Blecker) (Kawamoto và cộng sự., 1972). 1.2/ Đặc điểm sinh học - Về ngoại hình, cá basa rất dễ phân biệt đối với các loài khác trong họ Cá tra. Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân. Đầu cá basa ngắn hơi tròn, dẹp đứng. Miệng hẹp, chiều rộng của miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn, miệng nằm hơi lệch dưới mõm. Dải răng hàm trên to rộng và có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có 2 đôi râu, râu hàm tren bằng ½ chiều dài đầu; râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu. Răng trên xương khẩu cái là một đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên. Có 40-46 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31-36 tia vây. Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở 2 bên. Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn. Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng có màu trắng. - Phân bố: Cá Basa phân bố rộng ở Miến Điện, Java, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam. 1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Việt Nam Ở Việt Nam 2 họ chính trong bộ cá trơn được nghiên cứu là họ Pangasiidae và Clariidae. 8 Họ Pangasiidae có 21 loài thuộc 2 giống: giống Pangasius có 19 loài và giống Helicophagus có 2 loài. Có một loài sống trong nước lợ, 2 loài sống ở biển. Tính ăn của các loài trong họ Pangasiidae thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của cá thể. Trong họ Pangasiidae 2 loài cá basa và cá tra là cá nuôi kinh tế của đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt trong hình thức nuôi tăng sản. Đồng bằng sông Cửu Long vốn có truyền thống nuôi cá tra và cá ba sa từ lâu đời. Cá tra được phổ biến trong ao, đăng quầng, bãi bồi và nuôi lồng bè; cá ba sa chủ yếu được nuôi lồng bè trên các con sông lớn thuộc các tỉnh An Giang, Đồng Tháp. Hiện nay cá tra và cá ba sa đã được nơi ở hầu hết các tỉnh trong vùng. Những năm gần đây , Việc nuôi các loài cá này phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Đặc biệt từ khi chúng ta hoàn toàn chủ động về giống nhân tạo thì nghề nuôi càng ổn, định và có những bước phát triển vượt bậc. Thế nhưng do phát triển một cách tự phát nên khủng hoảng thừa cá nguyên liệu, cả người nuôi lẫn doanh nghiệp chế biến xuất khẩu đều gặp khó khăn. Đến 6 tháng đầu năm 2008 nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL đều tăng cả về diện tích, sản lượng và năng suất bình quân/ha. (Nguồn VOH, 29/06/2008) 1.4/ Thành phần hóa học của cá [5] Thành phần hóa học gồm: nước, protein lipid, muối vô cơ, vitamin... Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống,... Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là ở cá nuôi. Các yếu tố này có thể kiểm soát được trong chừng mực nào đó. Các thành phần cơ bản của cá và động vật có vú có thể chia thành những nhóm có cùng tính chất. 9 Bảng I.1. Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò Cá (phi lê) Thành phần Tối thiểu Thông thường Tối đa Thịt nạc bò Protein 6 16 – 21 28 20 Lipid 0,1 0,2 – 25 67 3 Carbohydrate - < 0,5 - 1 Tro 0,4 1,2 – 1,5 1,5 1 Nước 28 66 – 81 96 75 Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, việc bảo quản tươi nguyên liệu và qui trình chế biến. Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau Bảng I.2. Thành phần hóa học của cá (%) Thành phầnChỉ tiêu Thịt cá Trứng cá Gan cá Da cá Nước 48 – 85,1 60 - 70 40 - 75 60 - 70 Protein 10,3 – 24,4 20 - 30 8 - 18 7 - 15 Lipid 0,1 – 5,4 1 - 11 3-5 5 - 10 Muối vô cơ 0,5 – 5,6 1–2 0,5 – 1,5 1-3 2/ Tính chất hoá học của collagen 2.1/ Thành phần acid amin của collagen Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen [7] 10 • Phân loại collagen Bảng I.4: Các loại collagen [8] Loại collagen Cấu tạo của chuỗi Phân bố I (α1(I))2α2(I), trimer (α1(I))3 Da, gân, xương, giác mạc, men răng, sụn, mạch máu II (α1(II))3 Sụn III (α1(III))3 IV (α1(IV))2α2(IV) α1(V) α2(V) α3(V) hoặc V Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột, nướu răng, thành tử cung Màng nhầy Giác mạc, xương, mạch máu, sụn, nướu răng VI (α1(V))3 α1(VI) α2(VI) α3(VI) Da, cơ tim VII (α1(VII))3 Da, phổi, sụn, giác mạc, nhau VIII Chưa biết Tạo ra từ tế bào màng trong IX α1(IX) α2(IX) α3(IX) Sụn X (α1(X))3 Sụn XI α1(XI) α2(XI) α3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh XII (α1(XII))3 Gân, dây chằng XIII Chưa biết Da, xương 11 2.2/ Cấu tạo phân tử [6] 2.2.1/ Đặc điểm cấu trúc phân tử của collagen (kiểu I) Hình I.1: Sự hình thành tropocollagen và sự kết hợp các tropocollagen thành sợi collagen. - Collagen có cấu trúc bậc 4, M = 300.000 Da, l = 300nm, d = 1.5 nm 12 2.2.2/ Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen - Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định. Khoảng trống-gap: 40nm; khoảng sole: 67nm. Hình I.2: Sự hình thành sợi collagen 2.3/ Kiểu liên kết và tính chất của các liên kết ngang trong chuỗi [1],[2],[3],[4],[7] 2.3.1/ Liên kết hydro Được biết hydro liên kết cộng hoá trị với một chất cho điện tử (ví dụ N, O) có thể hình thành liên kết yếu thứ hai với nguyên tử tích điện âm khác (chất nhận). Sau đó được gọi là liên kết hydro. Những kiểu thông thường của liên kết hydro trong protein là giữa các nguyên tử NH…N, NH…O; và OH…O của acid amin, chúng chứa một lượng năng lượng khoảng 3-5kcal/mole (Ramachandran, 1968). 13 Hình I.3: Liên kết hydro giữa hai chuỗi gần nhau (A và B) của collagen. 14 Các liên kết này rất cần cho sự ổn định cấu trúc bậc hai và gắn kết các phân tử collagen (Harrington, 1964); vì thế chúng giữ ổn định hình dạng phân tử protein ở một dạng đặc biệt . Ở collagen tự nhiên, các chuỗi tropocollagen được định hướng để nhóm NH của liên kết peptid thứ ba của chuỗi này có thể hình thành liên kết hydro với nhóm COOH của liên kết peptid thứ ba của chuỗi bên cạnh. Điều đáng chú ý là các liên kết peptid imino (xoay quanh pyrrolidine) khuyết một nguyên tử hydro, không thể hình thành liên kết hydro nội phân tử làm bền cấu trúc xoắn α (Veis, 1964), mặc dù một liên kết hydrogen nội phân tử có thể được tạo thành giữa nhóm OH của một hydroxyproline còn lại trên chuỗi peptid và nhóm COOH của chuỗi bên cạnh (Gustavson, 1956). Tuy nhiên, những quan điểm khác nhau về số liên kết hydro trong collagen. Rich và Crik (1961) bàn luận theo hướng “cấu trúc liên kết đơn”, nghĩa là chỉ có một liên kết hydro cho mỗi đoạn ba liên kết peptid (Traub, 1969), Trong khi đó Ramachandran và cộng sự (1962) cho rằng “ cấu trúc hai liên kết”, nghĩa là có hai liên kết hydro cho mỗi đoạn ba liên kết peptid. Hình I.12 mô tả cấu trúc “một liên kết” và “hai liên kết”. Ramachandran và Chandrasekaran (1968) đưa ra lựa chọn cấu trúc “hai liên kết” trung hoà hai quan điểm bằng cách chỉ ra rằng một liên kết hydrogen liên kết trực tiếp với chuỗi polypeptid bên cạnh còn một liên kết hydrogen khác tạo thành qua một phân tử nước. Ngược với cấu trúc “ hai liên kết”, nhóm OH của hydroxyproline được xem như thể hiện hai chức năng: một là hình thành liên kết hydro với phân tử nước để gia tăng tính bền của sợi protofibril ba chuỗi, liên kết hydro còn lại (liên kết ngang) giữa một chuỗi xoắn bộ ba với một chuỗi xoắn bộ ba kế bên (Hình I.12c). Cấu trúc hai liên kết xem ra thích hợp nhất so với minh chứng thực nghiệm (Harrington, 1964; Berendsen, 1972; Yee và cộng sự, 1974; Suzuki và cộng sự, 1980). Nó cũng cho thấy thêm nhóm 4-OH của hydroxyproline ở vị trí Y của (Gly-X-Y)n là cấu hình đối xứng với nhóm COOH của hydroxyproline để thể hiện những chức năng này (Schubert và Hamerman, 1968; Ramachandran và Ramakrishnan, 1976). Salem và Traub (1975) cũng đề nghị gộp cả glutamine vào sự hình thành cầu nối hydrogen trong vùng xoắn ốc của các chuỗi α. Theo họ, glutamine ở vị trí Y trong chuỗi ba peptid [Gly-X-Y]n của vùng xoắn ốc có thể hình thành một cầu nối hydrogen với nhóm carbonyl của liên kết peptid (chuỗi bên aspargine quá ngắn đối với phản ứng này). 15 2.3.2/ Các liên kết kỵ nước Mặc dù các acid amin không phân cực glycine và alanine chiếm gần 44% phân tử collagen, tuy nhiên chúng góp phầm rất nhỏ vào tương tác van der Waals (liên kết kỵ nước) phụ thuộc vào các nhóm bên rất nhỏ (Veis, 1964). Ngược lại, một số nghiên cứu đã chỉ ra tương tác kỵ nước thích hợp giữa các acid amin propyl cạnh nhau trên các chuỗi khác nhau (Segal,1969; Yonath và Traub, 1969). Tuy nhiên, các nhóm bên của các acid amin không cực khác có thể hình thành liên kết kỵ nước bên trong và giữa các phân tử (Schnell, 1968; Heidemann và Hill, 1969) trong đoạn không phân cực (vùng giữa các chuỗi) của chuỗi α (Schubert và Hamerman, 1968). Người ta cho rằng chuỗi α2 chứa nhiều acid amin kỵ nước hơn chuỗi α1. Thật vậy, sự hình thành chuỗi góp phần đáng kể vào tính chất kỵ nước của collagen kiểu I (Fietzek và Kuhn, 1976). Hơn nữa, phản ứng tối đa ở vùng có cực và không có cực của các phân tử liền kề thì thích hợp với kiểu xếp xen kẽ xung quanh trục (D=233 acid amin) bên trong sợi cơ. Vì thế, cả lực tĩnh điện và tương tác kỵ nước đều quan trọng trong sự kết hợp các phân tử collagen vào các sợi cơ. 2.3.3/ Các liên kết ion Các liên kết muối (dạng ion) được xem như không quan trọng về việc ổn định cấu trúc collagen so với liên kết hydro (Weir và Carter, 1950), nhưng Weinstock và cộng sự (1967) cho rằng hầu hết các vị trí ion hình thành các liên kết muối bên trong và giữa các phân tử. Chẳng hạn như, Salem và Traub (1975) cho rằng arginine ở vị trí Y có liên quan đến tương tác tĩnh điện với acid glutamic ở vị trí X của chuỗi bên cạnh. 2.3.4/ Các liên kết cộng hoá trị a/ Các liên kết disulfide Các liên kết disulfide (-S-S-) giữa các chuỗi được tìm thấy ở đầu C tận cùng của vùng peptid dạng khối cầu (được gọi là chuỗi Pc- α) của chuỗi α procollagen của tất cả các dạng. Nhưng, chuỗi Pc bị phân tách bởi enzym trước khi phân tử procollagen bị giấu vào trong vùng ngoại bào (Martin và cộng sự, 1975; Bornstein và Traub, 1979). Do đó, các liên kết disulfide không hiện diện trong kiểu collagen I và II do không có cystein trong chuỗi tropocollagen. Tuy nhiên, các liên kết disulfide giữa các chuỗi đã được tìm thấy ở vùng xoắn của collagen kiểu III (Harwood, 1979) và trong vùng không xoắn glycoprotein ( vùng tận cùng) của 16 collagen kiểu IV (Kefalides, 1973). Cả hai kiểu collagen này chứa một lượng đáng kể cystein). b/ Các liên kết ngang giữa lysine và hydrolysine Hiện nay có rất nhiều tài liệu về liên kết ngang cộng hoá trị giữa các chuỗi (giữa các phân tử) ở các kiểu collagen khác nhau bắt nguồn từ phản ứng aldehyde, từ phản ứng oxy hoá deamin của nhóm ∈- NH2 của lysine và hydroxylysine (Tanzer, 1973, 1976; Bailey, 1969, 1974; Gallop và Paz, 1975). Các acid amin lysine và hydroxylysine ở cả hai vùng tận cùng của chuỗi α1(I) và vùng đầu N tận cùng của chuỗi α2 có thể bị oxi hoá thành α-aminoadipic acid δ-semialdehyde (Traub và Piez, 1971; Stark và cộng sự, 1971ª; Gallop và cộng sự, 1972). Điều này xảy ra bằng cách oxi hoá khử nhóm amin của nhóm ∈- NH2 của lysine và hydroxylysine bằng một ion Cu phụ thuộc enzym oxi hoá lysine (Siegel, 1974, 1979). Kết quả hợp chất carbonyl sau khi phản ứng với nhóm ∈- NH2 của lysine hay hydroxy hoặc glycosylate của hydroxylysine có ở phân tử bên cạnh. Các liên kết ngang nội phân tử được hình thành bởi một chuỗi aldimine hay ketoimine ( dạng Schiff) và phản ứng ngưng tụ aldol, dẫn tới hình thành tính bền cao của hợp chất pyridinium chẳng hạn như desmosine và isodesmosine (Gallop và cộng sự, 1972; Robins và cộng sự, 1973; Bailey và cộng sự, 1974; Tanzer, 1976); số lượng của chúng tăng theo tuổi của động vật. Các liên kết ngang này được xác định bằng một phản ứng giảm nhẹ sợi cơ collagen bằng borohydride, chất này làm bền các liên kết và làm tách riêng các liên kết acid amin thích hợp. Tuy nhiên, Bailey và cộng sự (1974) cho rằng việc xác định các hợp chất này bằng cách xử lý collagen bằng borohydride có thể không đưa ra những minh chứng cần thiết về các dạng không bị cắt giảm của chúng hoạt động như các liên kết nội phân tử trong cơ thể sống, bởi vì phản ứng ngưng tụ ban đầu dễ xảy ra trong điều kiện ít kiềm. Dựa vào trình tự các acid amin trên chuỗi α1 (I), người ta cho rằng đầu C tận cùng của lysine có thể phản ứng với hydroxylysine ở vị trí 87 và với lysine ở vị trí 327, trong khi đó nhóm amin đầu N tận cùng chỉ hình thành một liên kết với hydroxylysine ở vị trí 927. Một liện kết side –to-side chỉ là kết quả của phản ứng giữa đầu C tận cùng với vùng 327 và 564 (Kang, 1972; Miller, 1971b; Dixit và Bensusan, 1973; Becker và cộng sự, 1975ª). Tiếp theo là một số phản ứng quan trọng mà được xem là xuất phát từ sự ngưng tụ của nguồn carbonyl (α-aminoapidic 17 acid δ-semialdehyde) với các nhóm chức năng khác của acid amin qua một loạt các cơ chế phức tạp (Hình I.13 và I.14). Nhóm 1. Hydroxylysinonorleucine: Những liên kết ngang này có thể phát triển qua hai phản ứng: phản ứng thứ nhất, do sự ngưng tụ hydroxylysine và αaminoadipic acid δ-semialdehyde; phản ứng thứ hai, do sự ngưng tụ của lysine và δhydroxy α-aminoadipic acid δ-semialdehyde. Các liên kết được phát hiện đầu tiên bởi Bailey và Peach (1968) ở collagen nguồn gốc từ gân bê và chuột. Sau này nhiều nghiên cứu chứng minh các liên kết này được tìm thấy ở da (Franzblau và cộng sự, 1970; Tanzer và cộng sự, 1970; Bensusan, 1972; Bailey và Lapiere, 1973). Trong trường hợp da bê, hydroxylysine và α-aminoadipic acid δ-semialdehyde chủ yếu xoay quanh liên kết ngang (Tanzer và Mechanic, 1970; Nicholls và Bailey, 1980). Nhóm 2. Lysinonorleucine: Các liên kết lysinonorleucine đã được biết trong collagen của da một số loài khác (Bailey, 1970; Kang và cộng sự, 1970; Mechanic và Tanzer, 1970; Bensusan, 1972), gân (Shimokomaki và cộng sự, 1972; Cannon và Davison, 1973) và màng sừng (Tanzer và Kefalides, 1973). Nhóm 3. Dihydroxylysinonorleucine: sự xuất hiện của các liên kết ngang trong collagen tạo thành từ xương và ngà được Bailey và cộng sự đưa ra năm 1969; David và Bailey (1971) xác định cấu trúc thực của nó. Các nghiên cứu sau này công bố sự hiện diện của các liên kết ngang trong collagen của da và gân (Mechanic và cộng sự, 1971; Bensusan, 1972; Eyre và Glimcher, 1972; Forrest và cộng sự , 1972; Bailey và Lapiere, 1973). Nhóm 4. Aldol histidine: Sự có mặt của các liên kết ngang aldol histidine đã được thừa nhận trong da bò và màng sừng mà không có ở các loại collagen khác (Fairweather và cộng sự, 1972; Tanzer và cộng sự, 1973b). Kiểu này của liên kết không bị làm yếu thì rất dễ bị phá huỷ trong acid (Kang và cộng sự, 1970; Davison và cộng sự, 1972; Robins và Bailey, 1973b, 1975). Nhóm 5. Hydroxyaldol histidine: Housley và cộng sự (1975) đã công bố sự có mặt của các liên kết hydroxyaldol histidine trong collagen, chúng không bị làm yếu và rất bền vững. Chúng liên quan đến sự ngưng tụ của allysine, hydroxylysine và histidine (Tanzer và cộng sự, 1973b). Nhóm 6. Hydroxypyridinium: gần đây, Eyre và Oguchi (1980) đã xác định các liên kết ngang hydroxypyridinium trong khung collagen. Sự hình thành các liên kết ngang xoay quanh hai aldehyde ở giữa, tạo thành từ acid amin hydroxylysine. 18 Hình I.4: Các tương tác liên kết ngang của lysine xảy ra trong môi trường 19 Hình I.5: Các tương tác liên kết ngang của hydroxylysine xảy ra trong môi trường 20