Tài liệu Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI ---------oOo--------- NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI ---------------------- NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ 2. PGS.TSKH. Nguyễn Lê Trang HÀ NỘI - 2011 -i- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Nguyệt Thu - ii - LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ, nguyên Viện Trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS.TSKH. Nguyễn Lê Trang, nguyên Trưởng phòng Hóa Miễn dịch Viện Pasteur TP.HCM, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án. Ban Giám đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án đúng thời gian quy định. PGS.TS. Trương Thị Xuân Liên, nguyên Viện phó Viện Pasteur TP.HCM đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Các anh chị Viện Vệ sinh Y tế Công cộng, Khoa Y học cổ truyền trường Đại học Y Dược, và Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm TP.HCM đã cung cấp các mẫu thực phẩm, dược liệu và thuốc đông dược để tôi thực hiện đề tài. Các thầy, và các anh chị Bộ môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Hóa lý và phòng Hóa Miễn Dịch - Viện Pasteur TP.HCM đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong công việc. Nguyễn Thị Nguyệt Thu - iii - MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ............................................................................................................... i Lời cảm ơn ..................................................................................................................ii Mục lục.......................................................................................................................iii Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... viii Danh mục hình ........................................................................................................... x Danh mục bảng........................................................................................................ xiv ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN ...................................................................... 4 1.1.1. Phát hiện aflatoxin...................................................................................... 4 1.1.2. Aspergillus flavus và aflatoxin..................................................................... 4 1.1.3. Tính chất hóa, lý của aflatoxin.................................................................... 5 1.1.4. Độc tính của aflatoxin.................................................................................. 8 1.1.5. Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm .................................................. 10 1.1.6. Giới hạn aflatoxin trong dược liệu............................................................ 12 1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN........................................... 12 1.2.1. Lấy mẫu ..................................................................................................... 12 1.2.2. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 12 1.2.3. Phân tích mẫu............................................................................................ 16 - iv - 1.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH CHO AFLATOXIN .................................................................................................. 23 1.3.1. Kháng thể................................................................................................... 23 1.3.2. Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin – BSA ................................................ 24 1.3.3. Tạo kháng thể kháng aflatoxin ................................................................. 26 1.3.4. Tinh chế kháng thể .................................................................................... 30 1.3.5. Cố định kháng thể vào pha rắn................................................................. 31 1.3.6. Các đặc tính chiết xuất pha rắn của chất hấp thụ ái lực miễn dịch ........ 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 38 2.1. VẬT LIỆU........................................................................................................ 38 2.1.1. Thiết bị ....................................................................................................... 38 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................... 38 2.2. PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................. 40 2.2.1. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể kháng aflatoxin ................... 40 2.2.2. Phương pháp khuếch tán kép trên thạch ................................................. 41 2.2.3. Phương pháp tinh chế kháng thể dùng muối amoni sulfat...................... 42 2.2.4. Phương pháp thẩm tích (đưa protein ở dạng tủa trở lại dạng dung dịch)42 2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có natri dodecyl sulfat ..... 43 2.2.6. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford ......................... 45 2.2.7. Cộng hợp protein vào gel sepharose CL-4B hoạt hóa với CNBr............. 45 -v- 2.2.8. Phương pháp nén cột................................................................................. 45 2.2.9. pháp sắcaflatoxin ký ái lựcchuẩn miễn ............................................................... dịch……………………………………..46 2.2.10.Phương Pha dung dịch 46 2.2.11. Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột IAC........ 47 2.2.12. Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột SPE C18 . 47 2.2.13. Phương pháp làm giả mẫu nhiễm aflatoxin ........................................... 48 2.2.14. Phương pháp tạo dẫn xuất các aflatoxin ................................................ 48 2.2.15. Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phân tích aflatoxin .......................... 48 2.2.16. Phương pháp khảo sát các thông số kỹ thuật của cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin ............................................................................................................... 48 2.2.16.1. Độ lặp lại của các cột ......................................................................... 48 2.2.16.2. Dung lượng cột .................................................................................. 49 2.2.16.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ........................................... 49 2.2.16.4. Xác định độ tuyến tính ....................................................................... 50 2.2.16.5. Xác định hiệu suất thu hồi................................................................. 50 2.2.16.6. Theo dõi độ ổn định của cột............................................................... 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .......................................................................................... 52 3.1. CHẾ TẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN ............................... 52 3.1.1. Sản xuất kháng thể kháng aflatoxin ......................................................... 52 3.1.1.1. Gây miễn dịch trên thỏ......................................................................... 53 3.1.1.2. trasắc đápkýứng miễn ………………………………………….. 54 3.1.2. ChếKiểm tạo cột ái lực bắtdịch aflatoxin ...................................................... 58 3.1.2. Chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin……………………………………..59 - vi - 3.1.2.1. Chọn nồng độ kháng thể liên kết với gel ái lực ................................... 59 3.1.2.2. Khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur ........................... 63 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU........................... 68 3.2.1. Khảo sát trên mẫu thực phẩm .................................................................. 68 3.2.1.1. Khảo sát trên mẫu ngô......................................................................... 68 3.2.1.2. Khảo sát trên mẫu lạc .......................................................................... 76 3.2.2. Khảo sát trên mẫu dược liệu..................................................................... 81 3.2.2.1. Khảo sát trên mẫu cam thảo ................................................................ 81 3.2.2.2. Khảo sát trên mẫu gừng....................................................................... 87 3.3. SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC .............................. 92 3.3.1. So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C18 ........................... 92 3.3.1.1. Trên nền mẫu thực phẩm .................................................................... 92 3.3.1.2. Trên nền mẫu dược liệu....................................................................... 96 3.3.2. So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột sắc ký ái lực của hãng Vicam................................................................................................................... 99 3.3.2.1. So sánh trên mẫu cộng chuẩn ............................................................. 99 3.3.2.2. So sánh trên mẫu thực ....................................................................... 103 3.4. ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR LÀM SẠCH MẪU ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRÊN MỘT SỐ NỀN MẪU THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU.... 105 3.4.1. Trên một số nền mẫu thực phẩm............................................................ 105 - vii - 3.4.2. Trên một số nền mẫu dược liệu .............................................................. 106 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 107 4.1. BÀN LUẬN VỀ CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN..107 4.1.1. Về sản xuất kháng thể kháng aflatoxin .................................................. 107 4.1.1.1. Về gây miễn dịch trên thỏ…………………………………………….107 4.1.1.2. Về kiểm tra đáp ứng miễn dịch .......................................................... 109 4.1.2. Về chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin................................................ 111 4.1.2.1. Về chọn nồng độ kháng thể liên kết vào gel ái lực ............................ 111 4.1.2.2. Về khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur …………..112 4.2. BÀN LUẬN VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU ............. 114 4.3. BÀN LUẬN VỀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC 118 4.3.1. Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C18 ...................................... 118 4.3.2. Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột IAC của hãng Vicam................. 121 4.4. BÀN LUẬN VỀ ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR ĐỂ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU ................... 122 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 125 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ...................................................... 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - viii - DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AFM1 Aflatoxin M1 AOAC Association of Official Analytical Chemists BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) CD Cyclodextrin CNBr Cyanogen bromide EU European Union (Liên minh châu Âu) FDA US Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) Fab Antigen binding fragment (Mảnh gắn kháng nguyên) Fc Crystalizable fragment ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay HPLC High-performance liquid chromatography HCC Hepatocellular carcinoma HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HBsAg Hepatitis B surface Antigen IAC Immuno Affinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch) IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Liên đoàn quốc tế về hoá học thuần túy và ứng dụng) - ix - LC-MS Liquid chromatography with mass spectrometry mAb Monoclonal antibody NP-HPLC Normal-phase high-performance liquid chromatography ppb parts per billion RP-HPLC Reversed phase high-performance liquid chromatography SPE Solid Phase Extraction TFA Trifluoro acetic acid TLC Thin layer chromatography -x- DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus.......... 4 Hình 1.2 Ngô và lạc nhiễm vi nấm Aspergillus flavus.............................................. 5 Hình 1.3 Bào thai thỏ (0,1mg AFB1/kg) có hốc mắt bị rộng so với nhóm chứng...... 8 Hình 1.4 Mối liên hệ giữa nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin và ung thư tế bào gan ...... 9 Hình 1.5 Cấu trúc điển hình của cột chiết xuất pha rắn ........................................ ..13 Hình 1.6 Làm sạch mẫu bằng cột mycosep đa chức năng ...................................... 14 Hình 1.7 Làm sạch mẫu bằng cột IAC ................................................................... 15 Hình 1.8 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều. Thí nghiệm được thực hiện trên hai hệ thống dung môi khác nhau, được trình bày trên hai hướng vuông góc với nhau................................................................................................... 17 Hình 1.9 Quá trình tạo dẫn xuất biến AFB1 và AFG1 thành AFB2a và AFG2a ......... 19 Hình 1.10 Phản ứng tạo dẫn xuất của aflatoxin với Brom ........................................ 21 Hình 1.11 So sánh sắc ký đồ của quá trình phân tích aflatoxin khi có và không có tạo dẫn xuất với cyclodextrin: (A) không tạo dẫn xuất; (B) tạo dẫn xuất với 10-2M -CD; (C) tạo dẫn xuất với 10-2M DM--CD .......................... 21 Hình 1.12 Điện di đồ của quá trình phân tích aflatoxin bằng kỹ thuật điện di mao quản MEKC pha ngược ........................................................................... 22 Hình 1.13 Cấu tạo của phân tử kháng thể ................................................................. 23 Hình 1.14 Các dạng liên kết hóa học giữa hai phân tử kháng nguyên và kháng thể .. 23 Hình 1.15 Tạo kháng thể đa dòng............................................................................. 24 Hình 1.16 Phản ứng cộng hợp AFB1 với BSA.......................................................... 25 Hình 1.17 Các hướng sử dụng để cộng hợp aflatoxin vào protein............................. 26 Hình 1.18 Các giai đoạn tạo kháng thể đơn dòng ..................................................... 28 Hình 1.19 Cấu trúc kháng thể và các phân mảnh của nó.......................................... 29 Hình 1.20 Vị trí liên kết của kháng thể vào protein A, G, L và lectin ...................... 31 - xi - Hình 1.21 Cố định kháng thể qua nhóm amin bậc 1 trên gel hoạt hóa có nhóm carbonyldiimidazol (CDI) ........................................................................ 33 Hình 1.22 Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào pha rắn..................................................................................................... 34 Hình 2.1 Nguyên tắc thẩm tích ............................................................................... 42 Hình 2.2 Nguyên tắc điện di................................................................................... 44 Hình 3.1 Sơ đồ các bước tạo kháng thể kháng aflatoxin ......................................... 52 Hình 3.2 Gây miễn dịch trên thỏ với cộng hợp AFB1-BSA và các giai đoạn lấy máu ......................................................................................................... 53 Hình 3.3 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch giữa BSA và huyết thanh thỏ........... 54 Hình 3.4 Kiểm tra kháng thể sau tinh chế............................................................... 55 Hình 3.5 Loại kháng thể kháng BSA ...................................................................... 56 Hình 3.6 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch......................................................... 56 Hình 3.7 (a) AFB1 chuẩn, tR=4,32 phút (b) AFB1 sau khi qua cột IAC, tR=4,31 phút ......................................................................................................... 57 Hình 3.8 (A ) Mô hình kháng thể liên kết vào hạt gel Sepharose, (B) Nguyên tắc cộng hợp protein vào gel Sepharose được hoạt hóa với –CNBr................ 59 Hình 3.9 Cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin tự chế tạo.................................................. 63 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin từ 0,625 ng đến 10 ng cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ.. 65 Hình 3.11 Theo dõi độ ổn định của cột IAC trong 2 năm ......................................... 66 Hình 3.12 (a) Sắc ký đồ của mẫu ngô không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của mẫu ngô không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin .................... 68 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu ngô ..................................................................................... 69 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu ngô ........... 72 - xii - Hình 3.15 (a) Sắc ký đồ của mẫu lạc không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của mẫu lạc không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin...................... 76 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu lạc ...................................................................................... 77 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu lạc ............ 79 Hình 3.18 (a) Sắc ký đồ của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin thêm 10 ng chuẩn aflatoxin..... 81 Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ nền mẫu cam thảo.................................................................................... 82 Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu cam thảo.. 84 Hình 3.21 (a) Sắc ký đồ của mẫu gừng không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của mẫu gừng không nhiễm aflatoxin được thêm 10 ng chuẩn aflatoxin......... 87 Hình 3.22 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu gừng ................................................................................... 88 Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu gừng......... 90 Hình 3.24 Sắc ký đồ của mẫu cà phê làm sạch bằng cột IAC và cột SPE C18 ........... 93 Hình 3.25 Sắc ký đồ so sánh độ chọn lọc giữa hai phương pháp làm sạch mẫu bằng cột SPE C18 và cột IAC trên một số nền mẫu thực phẩm ................. 94 Hình 3.26 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm sạch bằng phương pháp IAC.................................................................... 96 Hình 3.27 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm sạch bằng phương pháp SPE C18 .............................................................. 97 - xiii - Hình 3.28 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB1 thu được sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 100 Hình 3.29 So sánh hiệu suất thu hồi AFB1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 100 Hình 3.30 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB2 thu được sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 101 Hình 3.31 So sánh hiệu suất thu hồi AFB2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 101 Hình 3.32 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 thu được sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 102 Hình 3.33 So sánh hiệu suất thu hồi AFG1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 102 Hình 3.34 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG2 thu được sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 103 Hình 3.35 So sánh hiệu suất thu hồi AFG2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 103 Hình 4.1 Các u hạt gây ra do tá chất Freund ......................................................... 108 Hình 4.2 Vị trí cộng hợp BSA vào phân tử AFB1 ................................................. 110 - xiv - DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các nhóm chức hóa học của các aflatoxin................................................ 6 Bảng 1.2 Giá trị TD50 gây ung thư của AFB1 .......................................................... 9 Bảng 1.3 Mối liên hệ giữa tiếp xúc với aflatoxin, nhiễm HBV và HCC ................ 10 Bảng 3.1 Phản ứng giữa kháng thể đa dòng kháng AFB1 và AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 ..................................................................................................... 58 Bảng 3.2 Số liệu thu được khi cho AFB1 qua cột Vicam và cột Pasteur ................ 61 Bảng 3.3 a Hiệu suất thu hồi đối với AFB1 .............................................................. 61 Bảng 3.3 b Hiệu suất thu hồi đối với AFB2 .............................................................. 61 Bảng 3.3 c Hiệu suất thu hồi đối với AFG1 .............................................................. 62 Bảng 3.3 d Hiệu suất thu hồi đối với AFG2 .............................................................. 62 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin ở lượng 20 ng/cột............................. 62 Bảng 3.5 Độ lặp lại của các cột............................................................................. 63 Bảng 3.6 Dung lượng cột ...................................................................................... 64 Bảng 3.7 Kết quả xét nghiệm tìm LOD và LOQ trên cột IAC ............................... 64 Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các loại aflatoxin ........... 66 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra độ ổn định của cột IAC ............................................... 67 Bảng 3.10 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền mẫu ngô ........................... 70 Bảng 3.11 Kết quả xét nghiệm độ tuyến tính trên nền mẫu ngô............................... 71 Bảng 3.12 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu ngô .......................................................................................... 71 Bảng 3.13 a Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFB1 đơn trên nền mẫu bột ngô...... 73 Bảng 3.13 b Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFB2 đơn trên nền mẫu bột ngô...... 73 Bảng 3.13 c Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFG1 đơn trên nền mẫu bột ngô ..... 74 Bảng 3.13 d Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFG2 đơn trên nền mẫu bột ngô ..... 74 Bảng 3.14 Phân bố của từng lượng aflatoxin đơn trong aflatoxin tổng số................ 75 - xv - Bảng 3.15 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu bột ngô ........... 76 Bảng 3.16 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền lạc.................................... 78 Bảng 3.17 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin......... 78 Bảng 3.18 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu lạc.................. 80 Bảng 3.19 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu lạc .................. 80 Bảng 3.20 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền mẫu cam thảo................... 83 Bảng 3.21 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu cam thảo .................................................................................. 83 Bảng 3.22 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu cam thảo ........ 85 Bảng 3.23 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng trên nền mẫu cam thảo ............. 85 Bảng 3.24 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng trên nền mẫu cam thảo (làm sạch bằng cột Vicam)............................................................................. 86 Bảng 3.25 Hiệu suất thu hồi của aflatoxin tổng số khi cho lượng mẫu là 0,5 gam ... 86 Bảng 3.26 LOD và LOQ của aflatoxin trên nền mẫu gừng...................................... 89 Bảng 3.27 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu gừng ........................................................................................ 89 Bảng 3.28 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu gừng .............. 91 Bảng 3.29 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu gừng............... 91 Bảng 3.30 So sánh hiệu suất thu hồi aflatoxin của hai phương pháp làm sạch mẫu: SPE C18 và IAC trên nền mẫu ngô ......................................................... 92 Bảng 3.31 Hiệu suất thu hồi AF khi làm sạch bằng cột IAC trên nền mẫu cà phê ... 93 Bảng 3.32 Các mẫu dương tính với cả hai phương pháp làm sạch........................... 95 Bảng 3.33 Hàm lượng aflatoxin thu được trên các mẫu làm sạch bằng cột SPE C18 98 Bảng 3.34 Hiệu suất thu hồi của aflatoxin trên mẫu dược liệu có thêm chuẩn ......... 99 Bảng 3.35 Kết quả định lượng 11 mẫu dược liệu và thuốc đông dược bằng 2 phương pháp làm sạch: qua cột IAC Vicam và cột IAC Pasteur........... 102 Bảng 4.1 Qui định về hàm lượng aflatoxin trong thức ăn gia súc ........................ 114 -1- ĐẶT VẤN ĐỀ Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vi nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin. Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám … Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin. Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 10-15 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này [79]. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thể gây chết người. Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan. Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến [26][93]. Ảnh hưởng quan trọng nhất dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm là khả năng gây ung thư tế bào gan nguyên phát. Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) đã xếp aflatoxin vào nhóm I: các chất gây ung thư cho người [56]. Do độc tính của aflatoxin, đã có ít nhất 99 quốc gia trên thế giới (trong đó có Việt Nam) đưa ra các tiêu chuẩn về giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm [28] đồng thời quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng. Tất cả các kỹ thuật dùng định lượng aflatoxin, trừ kỹ thuật miễn dịch men (ELISA), đều cần phải có giai đoạn làm sạch mẫu. Để tránh bất lợi của phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng, xu thế hiện nay là thay thế nó bằng phương pháp chiết xuất pha rắn (SPE). Các pha rắn khác nhau đã được sử dụng cho mục đích này như: Florisil, -2- silicagel-C18 và gần đây nhất là cột Mycosep đa chức năng. Chiết xuất pha rắn có ưu điểm hơn chiết xuất lỏng-lỏng là dễ thao tác hơn và cho kết quả có độ lặp lại cũng như độ thu hồi tốt hơn. Bất lợi chủ yếu của phương pháp này là độ chọn lọc thấp. Gần đây, cột sắc ký ái lực miễn dịch dựa trên kháng thể (Immuno affinity column-IAC) đã được phát triển để thay thế cho các phương pháp làm sạch pha rắn cổ điển. Ngoài các ưu điểm như dễ thao tác, độ thu hồi và độ lặp lại cao, cột IAC có ưu điểm vượt trội so với cột SPE là có độ chọn lọc cao, giúp phân tách dễ dàng aflatoxin trên các nền mẫu phức tạp từ mẫu thức ăn, mẫu sinh học đến mẫu mô động vật. Phương pháp làm sạch này ngày càng được sử dụng nhiều trong phân tích aflatoxin và là phương pháp bắt buộc sử dụng đối với các sản phẩm xuất khẩu. Sau giai đoạn làm sạch mẫu, người ta phát hiện aflatoxin dựa trên đặc tính phát huỳnh quang của nó. AFB1 và AFG1 cần biến đổi thành dẫn xuất AFB2a và AFG2a có khả năng phát huỳnh quang mạnh hơn. Phương pháp tạo dẫn xuất đơn giản nhất là sử dụng acid trifluoroacetic (TFA) để xúc tác phản ứng [123]. Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang là phương pháp phát hiện aflatoxin chính xác và hiệu quả. Song song với việc cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân Việt Nam, nhu cầu đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng cao. Số lượng và chủng loại mẫu được yêu cầu kiểm tra aflatoxin ngày càng nhiều và đa dạng. Qui trình kiểm tra aflatoxin sẽ đơn giản và chính xác hơn khi sử dụng cột IAC để làm sạch mẫu. Hiện nay, cột IAC cho aflatoxin dùng tại Việt Nam đều được nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao. Đây chính là nguyên nhân làm hạn chế việc thay thế cột SPE bằng cột IAC trong qui trình kiểm tra aflatoxin tại các phòng xét nghiệm trong nước. Do đó, có được qui trình sản xuất cột IAC cho aflatoxin trong nước với giá thành phù hợp là rất cần thiết. Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tiễn về phân tích aflatoxin nêu ở trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài luận án: “Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. -3- Mục tiêu của luận án là: - Nghiên cứu chế tạo cột sắc ký ái lực cho aflatoxin - Đánh giá khả năng phân tích aflatoxin trên mẫu thực phẩm và dược liệu bằng phương pháp làm sạch mẫu với cột sắc ký ái lực miễn dịch và định lượng aflatoxin bằng sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang. Đề tài bao gồm các nội dung sau: 1. Chế tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch cho aflatoxin. 2. Đánh giá khả năng ứng dụng cột sắc ký ái lực cho phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu. 3. So sánh việc xử lý mẫu bằng cột sắc ký ái lực tự chế tạo với một số phương pháp xử lý mẫu khác. 4. Áp dụng cột sắc ký ái lực để xác định aflatoxin trong một số thực phẩm và dược liệu.