Tài liệu Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

Bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o Bé y tÕ Tr−êng ®¹i häc y hμ néi Lª v¨n h−ng Chuyªn ®Ò 2 Sù kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu Chuyªn ®Ò s©u cã liªn quan ®Õn néi dung luËn ¸n tiÕn sü chuyªn ngµnh y häc: "X¸c ®Þnh vi khuÈn lËu vμ ph¸t hiÖn ®ét biÕn gen kh¸ng Ciprofloxacin b»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö t¹i ViÖn Da liÔu Quèc gia tõ n¨m 2005 - 2007" Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt M· sè: 62.72.68.01 Hµ Néi - 2008 Bé gi¸o dôc vμ ®μo t¹o Bé y tÕ Tr−êng ®¹i häc y hμ néi Lª v¨n h−ng Chuyªn ®Ò 2 Sù kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu Chuyªn ®Ò s©u cã liªn quan ®Õn néi dung luËn ¸n tiÕn sü chuyªn ngµnh y häc: "X¸c ®Þnh vi khuÈn lËu vμ ph¸t hiÖn ®ét biÕn gen kh¸ng Ciprofloxacin b»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö t¹i ViÖn Da liÔu Quèc gia tõ n¨m 2005 - 2007" Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt M· sè: 62.72.68.01 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS. TS NguyÔn ThÞ Vinh Hµ Néi - 2008 Môc lôc §Æt vÊn ®Ò 1. Mét sè nghiªn cøu sinh häc vÒ vi khuÈn lËu 1.1. H×nh thÓ cña vi khuÈn lËu 1.2. TÝnh chÊt nu«i cÊy 1.3. TÝnh chÊt sinh vËt hãa häc 1.4. §Þnh týp vi khuÈn 1.4.1 Týp dinh d−ìng 1.4.2 Týp huyÕt thanh 1.4.3. X¸c ®Þnh kiÓu gen 1.5. Mét sè ®Æc ®iÓm vÒ siªu cÊu tróc Protein porin (por) 1.6. HÖ thèng di truyÒn 1.7. C¸c cÊu tróc bÒ mÆt kh¸c 2. BÖnh lËu vμ t×nh h×nh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu 2.1. Kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña vi khuÈn lËu 2.1.1. BÖnh lËu ë ng−êi lín 2.1.2. BÖnh lËu ë trÎ em 2.1.3. NhiÔm trïng lËu lan to¶ 2.2. BÖnh lËu 2.2.1. T×nh h×nh trªn thÕ giíi 2.2.2. T×nh h×nh ë ViÖt Nam 2.3. H−íng dÉn ®iÒu trÞ bÖnh lËu b»ng kh¸ng sinh 2.4 T×nh h×nh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu 2.4.1. T×nh h×nh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu trªn thÕ giíi 2.4.2. T×nh h×nh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu ë ViÖt Nam 2.5. §é nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu ph©n lËp ®−îc t¹i ViÖn Da liÔu Quèc gia tõ n¨m 2005 - 2007 2.5.1. §é nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu n¨m 2005 2.5.2. §é nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu n¨m 2006 2.5.3. §é nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu n¨m 2007 3. Sù ®Ò Kh¸ng kh¸ng sinh cña Neisseria gonorrhoeae 3.1. VÊn ®Ò vµ xu h−íng kh¸ng thuèc hiÖn nay 3.1.1 ViÖc thu thËp, thÈm ®Þnh vµ sù thÝch hîp cña d÷ liÖu vÒ ®é nh¹y c¶m Trang 1 2 2 3 4 7 7 8 8 9 10 12 12 12 12 13 13 13 13 14 14 15 15 16 17 17 18 18 19 20 20 3.1.2 Nguån sè liÖu 3.1.3 Sö dông sè liÖu vÒ ®é nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh trong ph¸c ®å ®iÒu trÞ dùa vµo dÞch tÔ häc 3.2. C¬ chÕ kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu 3.2.1. C¬ chÕ chung 3.2.2. C¬ chÕ kh¸ng nh÷ng thuèc ®−îc dïng trong ®iÒu trÞ bÖnh lËu 3.3. C¸c yÕu tè gãp phÇn lan réng kh¸ng thuèc 3.3.1. Sö dông vµ l¹m dông kh¸ng sinh 3.2.2. DÞch tÔ häc sù lan truyÒn lËu cÇu kh¸ng thuèc 4. KhuyÕn c¸o vÒ sö dông kh¸ng sinh trong ®iÒu trÞ vi khuÈn lËu 21 22 27 27 29 34 34 36 38 Ch÷ viÕt t¾t AAGAP Ala-Ala-Glu-Ala-Pro ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BAC Bacterium artificial chromosomes BSA Bovine Serum Abumin cat chloramphenicol acetyltransferase CDC Centers for Disease Control and Prevention CMRNG Chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae: N. gonorhoeae kh¸ng thuèc qua trung gian nhiÔm s¾c thÓ CSWs Commercial sex workers: g¸i m¹i d©m DGI Disseminated gonococcal infection: nhiÔm vi khuÈn lËu lan táa DMSO Dimethyl sulfoxide Fbp Ferric binding protein: protein g¾n s¾t FDA Food and Drug Administration: C¬ quan qu¶n lý thùc phÈm vµ d−îc phÈm FrpB Fe-regulated protein B: protein ®iÒu hßa s¾t Frps Ferric-repressible proteins: C¸c protein øc chÕ s¾t GASP Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme: ch−¬ng tr×nh gi¸m s¸t toµn cÇu vÒ ®é nh¹y c¶m cña vi khuÈn lËu víi kh¸ng sinh HAM Homosexually active male: ®ång tÝnh luyÕn ¸i nam Hb Hemoglobin KDO Ketodeoxy deoxy octanoic acid LCR Ligase chain reaction: ph¶n øng chuçi ligase LF Lactoferrin LOS lipo-oligosaccharide LPS Lipopolysacharide LTQ§TD L©y truyÒn qua ®−êng t×nh dôc Met Methionin MIC Minimum inhibitory concentration: nång ®é øc chÕ tèi thiÓu mM Mili mole NAG Nonagglutination: Kh«ng ng−ng kÕt PBPs Penicillin-binding proteins: protein g¾n Penicillin PCR Polymerase Chain Reaction: Ph¶n øng chuçi polymerase PFGE Pulsed field gel electrophoresis: ®iÖn di tr−êng xung Por Protein porin PPNG Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: vi khuÈn lËu s¶n sinh men Penicillinase. QRNG Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuÈn lËu kh¸ng Quinolone RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: kü thuËt ®a h×nh chiÒu dµi ®o¹n c¾t giíi h¹n Rmp Reduction modifiable protein: protein cã thÓ biÕn ®æi khö RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: ®iÖn di trªn gel polyacrylamid STD Sexually Transmitted Disease: bÖnh l©y truyÒn qua ®−êng t×nh dôc TEM Transfer Electronic Microscopy: KÝnh hiÓn vi ®iÖn tö dÉn truyÒn TF Transferin Tm Melting temperature: nhiÖt ®é biÕn tÝnh TMA Transcription-mediated amplification: khuÕch ®¹i qua trung gian b¶n sao TRNG Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuÈn lËu kh¸ng tetracycline WHO World Health Organization: tæ chøc Y tÕ thÕ giíi 1 §Æt vÊn ®Ò BÖnh lËu lµ mét trong nh÷ng bÖnh l©y truyÒn qua ®−êng t×nh dôc phæ biÕn hay gÆp ë n−íc ta vµ nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi. BÖnh kh«ng g©y tö vong, nh−ng ®iÒu trÞ kh«ng kÞp thêi, kh«ng ®óng ph¸c ®å sÏ ®Ó l¹i nhiÒu biÕn chøng vµ di chøng lµm ¶nh h−ëng ®Õn x· héi, kinh tÕ, gia ®×nh vµ gièng nßi. T¸c nh©n g©y bÖnh lµ cÇu khuÈn lËu ®øng thµnh ®«i, Gram-©m, cã tªn khoa häc lµ Neisseria gonorrhoeae, ®−îc Neisser m« t¶ n¨m 1879, Leistikow vµ Loeffler nu«i cÊy lÇn ®Çu trªn m«i tr−êng nh©n t¹o n¨m 1882. Theo th«ng b¸o cña WHO (2006): ch−¬ng tr×nh gi¸m s¸t tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu ë khu vùc ch©u ¸ Th¸i B×nh D−¬ng ®· ph©n lËp ®−îc 8.400 chñng t¹i 16 quèc gia. Tû lÖ c¸c chñng vi khuÈn lËu kh¸ng kh¸ng sinh thuéc nhãm quinolon vÉn ë møc ®é cao: Trung Quèc lµ 99,6%, Hång K«ng 97,8%, Hµn Quèc 89,4%, NhËt B¶n 83,4%, Brunei 81,7%, Philippines 69%...[52] ë ViÖt Nam, Lª V¨n H−ng vµ céng sù (2006) cho biÕt tû lÖ c¸c chñng vi khuÈn lËu ®Ò kh¸ng ciprofloxacin lµ 82,1%; penicillin (31,1%); tetracyclin (16,5%); erythromycin (3,8%) vµ azithromycin (1,9%)... ViÖc gi¸m s¸t sù kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu lµ rÊt cÇn thiÕt v× kh«ng nh÷ng gióp cho c¸c ch−¬ng tr×nh gi¸m s¸t tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cÊp Quèc gia vµ Quèc tÕ theo dâi møc ®é kh¸ng thuèc cña vi khuÈn lËu, mµ cßn gióp b¸c sÜ l©m sµng x©y dùng m« h×nh ®iÒu trÞ b»ng kh¸ng sinh hîp lý nh»m gi¶m chi phÝ, gi¶m thêi gian ®iÒu trÞ cho bÖnh nh©n, gi¶m thiÓu nguån l©y cho céng ®ång. XuÊt ph¸t tõ lý do trªn chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: Nghiªn cøu sù ®Ò kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu. Nh»m 2 môc tiªu: 1. Theo dâi møc ®é ®Ò kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu ph©n lËp ®−îc t¹i ViÖn Da liÔu Quèc gia tõ 2005 - 2007. 2. T×m hiÓu c¬ chÕ ®Ò kh¸ng nh÷ng kh¸ng sinh ®−îc dïng trong ®iÒu trÞ bÖnh lËu. 2 1. Mét sè nghiªn cøu sinh häc vÒ vi khuÈn lËu 1.1. H×nh thÓ cña vi khuÈn lËu Vi khuÈn lËu Neisseria gonorrhoeae thuéc hä Neisseriaceae. Trong gièng Neisseria, cã loµi g©y bÖnh, cã loµi ho¹i sinh; chóng kh¸c biÖt nhau vÒ mét sè tÝnh chÊt sinh vËt ho¸ häc (lªn men ®−êng glucose vµ kh«ng sinh h¬i khi sö dông mét sè lo¹i ®−êng). Dùa vµo tÝnh chÊt nµy, ng−êi ta ph©n biÖt vi khuÈn lËu víi mét sè Neisseria ho¹i sinh kh¸c [12]. Trªn tiªu b¶n lÊy mñ tõ bÖnh nh©n bÞ bÖnh lËu vµ nhuém Gram, vi khuÈn lËu lµ nh÷ng cÇu khuÈn h×nh h¹t cµ phª ®øng thµnh ®«i, hai mÆt dÑt quay vµo nhau, b¾t mÇu Gram-©m. Vi khuÈn lËu cã kÝch th−íc 0,6μ m x 0,8 μ m, kho¶ng c¸ch gi÷a hai cÇu khuÈn b»ng 1/5 chiÒu réng. Khi ë trong tÕ bµo b¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh, vi khuÈn lËu lµ lo¹i vi khuÈn ®éc chiÕm tÕ bµo b¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh (cã nã th× kh«ng cã lo¹i vi khuÈn nµo sèng trong tÕ bµo). Ng−êi ta cã thÓ gÆp mét cÆp, hai cÆp, bèn cÆp hoÆc nhiÒu cÆp, cã khi xÕp lÌn chÆt trong lßng tÕ bµo b¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh. Vi khuÈn lËu kh«ng sinh nha bµo, kh«ng cã l«ng, kh«ng cã fibria (tiªm mao), mét sè chñng vi khuÈn lËu cã pili. TÝnh chÊt b¾t mÇu, vÞ trÝ n»m trong lßng b¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh cña vi khuÈn lËu cã gi¸ trÞ lín trong chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh khi kÕt hîp víi tiÒn sö bÖnh vµ triÖu chøng l©m sµng [12]. H×nh 1.1: Vi khuÈn lËu d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö H×nh 1.2: S¬ ®å siªu cÊu tróc tÕ bµo vi khuÈn lËu 3 H×nh 1.3: Vi khuÈn lËu nhuém Gram tõ khuÈn l¹c H×nh 1.4: Vi khuÈn lËu nhuém Gram tõ dÞch 1.2. TÝnh chÊt nu«i cÊy Vi khuÈn lËu khã nu«i cÊy, khi ra khái c¬ thÓ vi khuÈn rÊt dÔ chÕt. Søc ®Ò kh¸ng cña vi khuÈn lËu rÊt kÐm, dÔ bÞ bÊt ho¹t khi ë ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh. Chóng ký sinh b¾t buéc ë vËt chñ, vi khuÈn chÕt rÊt nhanh ë 55oC, chØ sau 5 phót. Trong ®iÒu kiÖn kh« vµ giµu oxy, vi khuÈn lËu chÕt sau 1-2 giê. Víi dung dÞch s¸t khuÈn phenol 1%, formol 0,1%, sublime 0,1%, vi khuÈn chÕt sau 1-5 phót tiÕp xóc [1]. Vi khuÈn lËu mäc tèt trªn m«i tr−êng chän läc Thayer-Martin cã chÊt t¨ng sinh Isovitalex vµ chÊt øc chÕ V-C-N. + Thµnh phÇn chÊt t¨ng sinh (Isovitalex) bao gåm : - Diphosphopyridin nucleotide (coenzyme) - Carboxylase - Para-aminobenzoic acid - Thiamin-HCL - Vitamin B12 - L-glutamine - L-cystine-2HCL - L-cystine-HCL.2H2O - Adenine - Guanin-HCL 4 - Fe(NO3)3.9 H2O - Dextrose + ChÊt øc chÕ (V-C-N) : - Vancomycin (øc chÕ vi khuÈn Gram-d−¬ng) - Colistin (øc chÕ trùc khuÈn Gram-©m) - Nystatin (øc chÕ nÊm) NhiÖt ®é sinh tr−ëng thÝch hîp lµ 35-36oC, ®é Èm >70%, khÝ tr−êng CO2 tõ 3-10%, pH 7,3. Sau 24 giê nu«i cÊy, khuÈn l¹c cã ®−êng kÝnh lµ 0,5-1 mm, trßn, låi, bê khuÈn l¹c ®Òu, nhÇy vµ cã mµu h¬i x¸m, ãng ¸nh nh− giät s−¬ng. Sau 48 giê nu«i cÊy vi khuÈn lËu tù dung gi¶i nhanh chãng, th«ng th−êng khuÈn l¹c to ra, khi nhuém Gram, ta thÊy nh÷ng song cÇu khuÈn ph×nh to h¬n. NÕu ®Ó 48-72 giê khuÈn l¹c cã kÝch th−íc tíi 3 mm. H×nh 5: KhuÈn l¹c vi khuÈn lËu trªn m«i tr−êng Thayer-Martin 1.3. TÝnh chÊt sinh vËt hãa häc - Test Oxidase Dïng ®Çu pipet Pasteur uèn cong trªn ngän löa ®Ìn cån, lÊy khuÈn l¹c nghi ngê phÕt lªn d¶i giÊy thÊm Whatman No1 kÝch th−íc 2,5 x 0,5cm ®· ®−îc lµm Èm b»ng 2-3 giät thuèc thö: tetramethyl p-phenylendiamin hydrochloride 1%. 5 Ph¶n øng d−¬ng tÝnh (cã cytochrom oxidase) : Trong vßng 5 gi©y khuÈn l¹c tõ mµu ®á hång chuyÓn sang mµu tÝm ®Ëm. D−¬ng tÝnh ¢m tÝnh H×nh 6: Test oxidase trªn m«i tr−êng nu«i cÊy - Test Superosol: LÊy 1 lam kÝnh s¹ch nhá lªn 1 giät dung dÞch hydrogenperoxide 30%, dïng que cÊy lÊy 4-5 khuÈn l¹c trªn ®Üa nu«i cÊy hßa trùc tiÕp vµo giät thuèc thö trªn phiÕn kÝnh. Ph¶n øng d−¬ng tÝnh: trong vßng 2-3 gi©y t¹o nhiÒu bät vµ c¸c bãng n−íc. Ph¶n øng ©m tÝnh: kh«ng t¹o bät hoÆc t¹o bät chËm, Ýt, yÕu sau 3 gi©y. - X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng ph©n hñy ®−êng nhanh theo th−êng quy cña WHO (1999). Sö dông bé kit Neisseria 4H M«i tr−êng Neisseria 4H gåm 4 lo¹i ®−êng : + Glucose + Mantose + Fructose + Saccharose 6 - ChuÈn bÞ : ®Ó hép kit ë nhiÖt ®é phßng. Bé kit gåm cã: + PhiÕn thö (Well microplates). + Dung dÞch trén vi khuÈn (Suspensolution): 2ml. + Dung dÞch Mc Farland cña kit: 1ml. + N¾p nhùa ®Ëy phiÕn thö. + Que cÊy vµ micropipet nhá giät cïng chñng vi khuÈn lËu cÇn thö. - C¸c b−íc tiÕn hµnh : + ChuÈn bÞ huyÒn dÞch vi khuÈn: dïng que cÊy v« trïng lÊy khuÈn l¹c vi khuÈn lËu nu«i cÊy sau 18-24 giê. + Hoµ ®Òu vi khuÈn vµo dung dÞch suspensolution cña kit. + So s¸nh víi ®é ®ôc Mc Farland sè 3 cña kit. + Dïng micropipet nhá vµo mçi giÕng 100μl huyÒn dÞch vi khuÈn, trén ®Òu. + §Ëy n¾p vµ ñ ë tñ Êm 37oC, kh«ng cã CO2. + §äc kÕt qu¶ sau 4 giê. - C¸ch ®äc kÕt qu¶ : + Ph¶n øng d−¬ng tÝnh: dung dÞch chuyÓn sang mµu vµng + Ph¶n øng ©m tÝnh: mµu ®á gi÷ nguyªn + KÕt qu¶ ®−îc so s¸nh víi giÕng chøng - KÕt luËn : Neisseria gonorrhoeae H×nh 7: PhiÕn Neisseria 4H x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng ph©n hñy ®−êng nhanh 7 1.4. §Þnh týp vi khuÈn §Ó nghiªn cøu dÞch tÔ häc, cÇn ph¶i ®Þnh týp vi khuÈn. Cã nhiÒu kü thuËt ®· ®−îc triÓn khai vµ ¸p dông thµnh c«ng cho môc ®Ých nµy. 1.4.1 Týp dinh d−ìng Mét hÖ thèng t−¬ng ®èi cång kÒnh ®Ó ph©n biÖt c¸c chñng vi khuÈn lËu dùa vµo kh¶ n¨ng ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng x¸c ®Þnh ®· ®−îc tiÕn hµnh. Ban ®Çu hÖ thèng nµy ®−îc B.W. Catlin triÓn khai vµ ph©n lo¹i dùa vµo kh¶ n¨ng cã thÓ ph¸t triÓn ®−îc kh«ng trong m«i tr−êng kh«ng cã mét sè acid amin, purin hoÆc pyrimidin, hay c¸c chÊt dinh d−ìng ®Æc tr−ng kh¸c [15]. Mét chñng kh«ng thÓ mäc trªn m«i tr−êng dinh d−ìng kh«ng cã prolin ®−îc gäi lµ Provµ mét chñng kh«ng thÓ mäc nÕu trong m«i tr−êng dinh d−ìng kh«ng cã arginin ®−îc gäi lµ Arg-. Vi khuÈn lËu ph©n lËp tõ ng−êi bÖnh biÓu hiÖn tÝnh ®a d¹ng râ rÖt vÒ kh¶ n¨ng sinh tæng hîp, cã thÓ ph¶n ¸nh m«i tr−êng giÇu dinh d−ìng cña vËt chñ, cung cÊp cho vi khuÈn phÇn lín c¸c hîp chÊt cÇn thiÕt cho sù ph¸t triÓn cña chóng. C¸c nghiªn cøu di truyÒn cho thÊy c¸c chñng cã kiÓu h×nh dinh d−ìng nh− nhau (thÝ dô Arg-) cã thÓ cã nhiÒu ®ét biÕn theo mét chu tr×nh hãa sinh nhÊt ®Þnh [47]. HÖ thèng ®Þnh týp dinh d−ìng ®−îc sö dông thµnh c«ng trong c¸c nghiªn cøu dÞch tÔ kh¸c nhau. Mét sè týp dinh d−ìng rÊt quan träng vÒ sinh häc vµ dÞch tÔ häc, thÝ dô, Arg- Hyx- (hypoxanthin-) Ura(uracil-). Týp dinh d−ìng th−êng liªn quan tíi nhiÒu ®Æc tÝnh kh¸c nhau nh− xu h−íng g©y nhiÔm trïng niÖu ®¹o nam kh«ng triÖu chøng, t¨ng kh¶ n¨ng g©y nhiÔm khuÈn huyÕt vµ c¸c ®Æc tÝnh kh¸c [19]. Do sù phøc t¹p cña mét hÖ thèng m«i tr−êng víi tõng hãa chÊt riªng biÖt vµ thêi gian b¶o qu¶n ng¾n, kü thuËt ®Þnh týp dinh d−ìng th−êng kh«ng ®−îc ¸p dông réng r·i trong c¸c phßng xÐt nghiÖm l©m sµng. 8 1.4.2 Týp huyÕt thanh C¸c nhµ nghiªn cøu ®· cè g¾ng ph¸t triÓn mét hÖ thèng ®Þnh týp huyÕt thanh trong nhiÒu thËp kû. HiÖn t¹i kü thuËt ®ang ®−îc dïng phæ biÕn nhÊt cho môc ®Ých nµy lµ dùa vµo kh¸ng thÓ ®¬n dßng ®Æc hiÖu víi c¸c epitope kh¸c nhau trªn protein P.I hoÆc Por cña mµng ngoµi (outer membrane) [32]. Por xuÊt hiÖn trong 2 nhãm huyÕt thanh kh¸c nhau vÒ hãa miÔn dÞch: PorA vµ PorB. Dïng mét bé kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng nh÷ng chñng PorA vµ mét bé kh¸c kh¸ng nh÷ng chñng PorB, cã thÓ ph©n nhá mçi nhãm huyÕt thanh thµnh mét lo¹t c¸c serovar kh¸c nhau (vÝ dô P.IA-6, P.IA-1); chóng kh¸c nhau vÒ kh¶ n¨ng ph¶n øng víi nh÷ng thµnh viªn nhÊt ®Þnh cña mét bé (panel) kh¸ng thÓ ®¬n dßng. Hµng lo¹t serovar ®Æc hiÖu ®· ®−îc x¸c ®Þnh b»ng kü thuËt nµy [27]. 1.4.3. X¸c ®Þnh kiÓu gen ViÖc ®Þnh týp vi khuÈn cã thÓ dùa vµo x¸c ®Þnh ADN nh»m t×m hiÓu cã nh÷ng kh¸c biÖt râ rÖt trong cÊu tróc ADN gi÷a c¸c chñng hay kh«ng. SÏ kh«ng thùc tÕ nÕu muèn lËp b¶n ®å toµn bé bé gen, hoÆc x¸c ®Þnh tr×nh tù mét hay mét vµi gen, song cã thÓ dïng kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Ó ®¸nh gi¸ nhanh sù kh¸c biÖt trong tr×nh tù ADN. Kü thuËt ®Çu tiªn lµ dïng enzyme giíi h¹n endonuclease, dùa vµo ph©n tÝch kiÓu c¸ch c¸c b¨ng ADN trªn gel agarose [21], [42]. Mét ph−¬ng ph¸p kh¸c ®−îc gäi lµ PCR (Polymerase Chain Reaction) ®−îc måi ngÉu nhiªn; ë ®©y dïng c¸c ®o¹n måi ADN ng¾n g¾n víi nhiÒu vÞ trÝ ®Ó t¹o thµnh s¶n phÈm ADN trªn c¬ së ph¶n øng chuçi polymerase. Cã lÏ ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt cho môc ®Ých dÞch tÔ lµ kü thuËt ®Þnh týp Opa: dïng ®o¹n måi PCR cho Opa ®Ó t¹o ADN tõ mçi gen cña kho¶ng 11 gen Opa. Nh÷ng ®o¹n ADN nµy sau ®ã ®−îc c¾t bëi enzyme giíi h¹n vµ kÕt qu¶ cña kiÓu c¸ch ®a h×nh th¸i chiÒu dµi ®o¹n ADN (RFLPRestriction Fragment Length Polymorphism) ®−îc dïng ®Ó so s¸nh c¸c chñng. 9 Phèi hîp víi nh÷ng hÖ th«ng ®Þnh týp kh¸c, x¸c ®Þnh kiÓu gen ®· gãp phÇn gi¶i quyÕt hiÖu qu¶ viÖc ®Þnh týp vi khuÈn. 1.5. Mét sè ®Æc ®iÓm vÒ siªu cÊu tróc Protein porin (por) Khi c¸c protein mµng ngoµi cña vi khuÈn lËu ®−îc hßa tan vµ kiÓm tra b»ng kü thuËt ®iÖn di trªn SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), nhiÒu protein ®· ®−îc thÊy. Th«ng th−êng, protein dÔ thÊy nhÊt trªn SDS-PAGE nµy lµ protein 34kDa-36kDa tr−íc kia ®−îc gäi lµ P.I nh−ng nay ®−îc gäi lµ Por. Por béc lé trªn bÒ mÆt mµng ngoµi vµ ë tr¹ng th¸i tù nhiªn trong mµng, nã tån t¹i nh− mét chÊt tam ph©n [14]. ë trong mµng ngoµi, nã lµ lipo-oligosaccharid (LOS) vµ c¶ protein cã thÓ biÕn ®æi khö (Rmp-Reduction modifiable protein) [26]. - Lipo-olygosacharid (LOS) TÊt c¶ vi khuÈn lËu ®Òu cã LOS trªn bÒ mÆt tÕ bµo, t−¬ng tù lipopolysacharid (LPS) cña c¸c vi khuÈn Gram-©m kh¸c. LOS cña vi khuÈn lËu chøa mét nöa lµ lipid A vµ mét nöa lµ polysacharid lâi gåm KDO (ketodeoxy deoxy octanoic acid), heptose, glucose, galactose vµ glucosamin hoÆc galactosamin. Nh− vËy LOS cña vi khuÈn lËu râ rµng nhá h¬n LPS ®iÓm h×nh cña c¸c vi khuÈn Gram-©m kh¸c. Nh÷ng ®−êng cèt lâi cña LOS t¹o nªn kh¸ng nguyªn cña vi khuÈn, do vËy nã cã vai trß quan träng ®èi víi ph¶n øng miÔn dÞch diÖt khuÈn; nh÷ng kiÓu h×nh kh¸c nhau cña kh¸ng nguyªn l¹i cã thÓ lµ quan träng trong sinh bÖnh häc. Qu¶ thùc, nhiÒu chøng cø cho r»ng vi khuÈn lËu víi LOS "ng¾n" th× nh¹y c¶m huyÕt thanh nh−ng l¹i cã thÓ x©m nhËp tÕ bµo chñ; cßn nh÷ng vi khuÈn lËu víi nh÷ng LOS "dµi" th× ®Ò kh¸ng huyÕt thanh vµ kh«ng x©m nhËp ®−îc. - Protein cã thÓ biÕn ®æi khö (Rmp) Vi khuÈn vµ tÊt c¶ Neissseria g©y bÖnh ®Òu cã mét protein Rmp mang tÝnh 10 kh¸ng nguyªn (tr−íc ®©y gäi lµ protein III hoÆc P.III) víi träng l−îng ph©n tö thay ®æi tõ 30-36kDa trªn SDS-PAGE ë tr¹ng th¸i khö. Protein nµy rÊt ®¸ng quan t©m ®èi víi sinh bÖnh häc v× rÊt nhiÒu kh¸ng thÓ cã ho¹t tÝnh diÖt khuÈn trong huyÕt thanh chèng l¹i kh¸ng nguyªn nµy. Gen cÊu tróc Rmp ®· ®−îc t¹o dßng vµ gi¶i tr×nh tù. Nh− vËy, Por thùc hiÖn nhiÒu chøc n¨ng ®èi víi vi khuÈn lËu, trong ®ã cã viÖc t¹o ra mét ®Æc hiÖu anion qua mµng ngoµi giÇu lipid. Por tån t¹i trong 2 líp hãa häc vµ miÔn dÞch quan träng riªng ®−îc gäi lµ PorA vµ PorB. Mét chñng nhÊt ®Þnh chØ cã PorA hoÆc PorB vµ kh«ng bao giê cã c¶ hai. Chóng biÓu hiÖn nhiÒu kh¸ng nguyªn cña 2 líp protein porin quan träng nµy [32]. CÊu tróc ban ®Çu cña nhiÒu protein Por ®· ®−îc x¸c ®Þnh b»ng gi¶i tr×nh tù ADN. CÊu tróc nµy gièng víi c¸c protein porin ë c¸c vi khuÈn Gram-©m kh¸c. So s¸nh tr×nh tù cña protein PorA vµ PorB ph¸t hiÖn cã mét sè vïng, ë c¶ 2 lo¹i protein vµ mét sè vïng cã sù kh¸c biÖt thay ®æi lín [24]. Nh÷ng thay ®æi kh¸c biÖt nµy cã thÓ lµ biÓu hiÖn cho tÝnh ®a d¹ng cña kh¸ng nguyªn. Gen PorA vµ PorB lµ hai allen cña mét vÞ trÝ (locus). 1.6. HÖ thèng di truyÒn Cã 2 hÖ thèng chñ yÕu ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch chÊt liÖu di truyÒn cña vi khuÈn lËu lµ biÕn n¹p vµ tiÕp hîp (transformation and conjugation). Ng−êi ta ch−a t×m thÊy phage vµ vai trß lín cña transposon ®èi víi sù ®Ò kh¸ng ë vi khuÈn lËu. §Õn nay ph¸t hiÖn thÊy transposon g©y nh÷ng biÕn ®æi nhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn lËu. V× vËy, Seifertso vµ céng sù ®· triÓn khai mét hÖ thèng ®ét biÕn gen "con thoi" rÊt h÷u Ých cho nghiªn cøu di truyÒn, trong ®ã gen chloramphenicol acetyltransferase (cat) (hoÆc mét gen kh¸ng kh¸ng sinh kh¸c) thÕ chç β-lactamase (penicilinase) trªn transposon Tn3 [46]. C¸c hÖ thèng ®ét biÕn gen "con thoi" t¹o ra nh÷ng ®ét biÕn ë mét ®o¹n trªn ADN cña vi khuÈn lËu ®−îc nh©n b¶n ë E. coli vµ dïng hÖ thèng nµy chuyÓn ADN ®· 11 - Plasmid Vi khuÈn lËu chøa mét plasmid tù truyÒn (tiÕp hîp ®−îc), cã träng l−îng ph©n tö 36kb. C¸c dÉn xuÊt lín h¬n mét chót cña plasmid 36kb ®· ®−îc ph©n lËp, cã chøa transposon tetM kh¸ng tetracyclin [40]. NhiÒu plasmid β-lactamase (kh¸ng penicilin) kh¸c nhau cña vi khuÈn lËu ®· ®−îc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh ®Æc ®iÓm. 2 plasmid hay gÆp nhÊt lµ kho¶ng 5,3 hoÆc 7,2kb [41]. PhÇn lín lËu cÇu còng chøa mét plasmid 4,2kb nh−ng ch−a râ chøc n¨ng (cryptic plasmid). Chuçi ADN cña plasmid nµy ®· ®−îc x¸c ®Þnh. §«i khi cã thÓ ph©n lËp ®−îc vi khuÈn lËu kh«ng chøa plasmid 4,2kb sao chÐp tù do nµy nh−ng chóng vÉn cã vÎ b×nh th−êng vÒ c¸c ®Æc tÝnh sinh häc. - C¬ chÕ biÕn ®æi Opa TÊt c¶ c¸c gen Opa tõ c¸c chñng vi khuÈn lËu ®Òu ®−îc xÕp nhãm vµ xÕp chuçi [17], [49]. Khi lai gièng ph−¬ng Nam ®−îc thùc hiÖn víi gen Opa ®· ph©n nhãm, cã thÓ nh×n thÊy tíi 12 m¶nh giíi h¹n liªn quan tíi Opa cña ADN nhiÔm s¾c thÓ, cho thÊy cã mét hä c¸c gen Opa trong nhiÔm s¾c thÓ [17], [49]. Mçi gen Opa lµ mét gen hoµn h¶o víi c¸c ho¹t chÊt cña nã vµ mçi gen ®−îc sao chÐp sang ARN bÊt cø lóc nµo [50]. Thay ®æi biÓu hiÖn cña c¸c gen nµy ®¹t ®−îc nhê thay ®æi ®¬n vÞ lÆp l¹i pentameric gièng nhau (CTCTT) ®−îc ®Þnh vÞ xu«i dßng ngay tõ ATG b¾t ®Çu codon, trong kho¶ng thêi gian ADN m· hãa chuçi tÝn hiÖu kþ n−íc, vµ ng−îc dßng c¸c chuçi m· hãa cho protein cÊu tróc hoµn thiÖn [17]. Khi nhiÒu ®¬n vÞ lÆp l¹i nµy chia ®Òu c¸ch 3 (thÝ dô: 9, 12, 15 ...) gen tÞnh tiÕn trong cÊu tróc vµ biÓu thÞ mét protein Opa. NhiÒu ®¬n vÞ lÆp l¹i pentameric kiÓu kh¸c (thÝ dô: 8, 10, 11, 13, 14 ...) do sao chÐp gen tÞnh tiÕn ngoµi cÊu tróc, vµ kh«ng cã biÓu hiÖn Opa. NhiÒu ®¬n vÞ lÆp l¹i 12 1.7. C¸c cÊu tróc bÒ mÆt kh¸c Peptidoglycan vi khuÈn lËu gièng víi peptidoglycan cña vi khuÈn gram-©m kh¸c, chøa thµnh phÇn chÝnh cña acid muramic vµ N-acetylglucosamin, nh−ng O-acetyl hãa Ýt h¬n. §iÒu nµy cã thÓ phï hîp víi kh¶ n¨ng nh¹y c¶m cña c¸c m¶nh peptidoglycan dÔ bÞ ph©n hñy vµ c¸c ®Æc tÝnh sinh häc kh¸c. Vi khuÈn lËu kh«ng cã vá polysaccharid thùc sù, mÆc dï mét vµi b¸o c¸o tr−íc ®©y cho kÕt qu¶ tr¸i ng−îc. Tuy nhiªn, vi khuÈn lËu s¶n sinh polyphosphat bÒ mÆt, cã thÓ phï hîp víi mét sè chøc n¨ng cña vá polysaccharid, bao gåm dù phßng bÒ mÆt tÕ bµo hót n−íc vµ kh«ng tÊn c«ng. HiÖn vÉn ch−a biÕt vai trß polyphosphat "vá gi¶" trong sinh häc vµ bÖnh sinh cña vi khuÈn lËu. Vi khuÈn lËu còng g¾n polyanion tÊn c«ng víi protein Opa, lµm thay ®æi sù tÊn c«ng bÒ mÆt tÕ bµo vµ còng cã kh¶ n¨ng bÞ giÕt bëi huyÕt thanh ng−êi b×nh th−êng [16]. 2. BÖnh lËu vμ t×nh h×nh kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn lËu 2.1. Kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña vi khuÈn lËu 2.1.1. BÖnh lËu ë ng−êi lín Vi khuÈn lËu cã mét vËt chñ duy nhÊt lµ ng−êi. BÖnh liªn quan chÆt chÏ víi ho¹t ®éng t×nh dôc. Vi khuÈn lËu g©y viªm niÖu ®¹o cho c¶ nam vµ n÷. TriÖu 13 ë phô n÷ triÖu chøng phøc t¹p h¬n: tiÕt dÞch niÖu ®¹o, ©m ®¹o. VÞ trÝ bÞ bÖnh cña phô n÷ th−êng ë niÖu ®¹o, cæ tö cung, tuyÕn SkÌne, tuyÕn Bartholin, cã khi tíi c¶ tö cung, vßi trøng, buång trøng [36]. Viªm trùc trµng: th−êng gÆp ë nh÷ng ng−êi ®ång tÝnh luyÕn ¸i nam. TriÖu trøng viªm trùc trµng do vi khuÈn lËu th−êng kh«ng ®iÓn h×nh. NhiÔm vi khuÈn lËu ë häng th−êng gÆp ë bÖnh nh©n ®ång tÝnh luyÕn ¸i nam vµ quan hÖ ®−êng miÖng [13]. 2.1.2. BÖnh lËu ë trÎ em Th−êng biÓu hiÖn bÖnh ë m¾t do l©y vi khuÈn lËu tõ mÑ trong thêi kú sinh con, phæ biÕn nhÊt lµ ch¶y mñ kÕt m¹c sau ®Î 1-7 ngµy. NÕu kh«ng ®−îc ®iÒu trÞ kÞp thêi, cã thÓ dÉn tíi mï loµ. Cã thÓ gÆp viªm ©m hé, ©m ®¹o, niÖu ®¹o do vi khuÈn lËu ë c¸c bÐ g¸i do dïng chung chËu víi bè mÑ bÞ bÖnh lËu. 2.1.3. NhiÔm trïng lËu lan to¶ BÖnh th−êng gÆp ë nh÷ng ng−êi bÞ bÖnh lËu nh−ng kh«ng ®−îc ®iÒu trÞ kÞp thêi, ®óng ph¸c ®å. HÇu hÕt nhiÔm vi khuÈn lËu lan to¶ x¶y ra ë phô n÷. BiÓu hiÖn cña bÖnh nh−: viªm khíp, viªm gan, viªm c¬ tim, viªm néi t©m m¹c, viªm mµng n·o, nhiÔm vi khuÈn lËu trªn da [2]. 2.2. BÖnh lËu 2.2.1. T×nh h×nh trªn thÕ giíi - Theo thèng kª cña WHO, hµng n¨m trªn thÕ giíi cã h¬n 60 triÖu ng−êi bÞ bÖnh lËu. Riªng ë Mü hµng n¨m, cã kho¶ng 2 triÖu ng−êi míi m¾c, tû lÖ phô n÷ cã thai nhiÔm vi khuÈn lËu lµ 6%. ë London (Anh), theo dâi 516 thai phô trong 2 n¨m, ng−êi ta thÊy thÊy tû lÖ nhiÔm vi khuÈn lËu lµ 0,4% [56]. - Tû lÖ l©y lan ë c¸c n−íc còng kh¸c nhau: BØ lµ 0,3%, Uganda 3,4%, ch©u Mü La tinh 1,2% [55]. 14 - ë ch©u Phi, tû lÖ viªm kÕt m¹c m¾t ë trÎ s¬ sinh do vi khuÈn lËu lµ 5-10/1000 trÎ s¬ sinh sèng, trong khi ®ã ë Mü tû lÖ nµy lµ 0,1-0,6/1000 trÎ s¬ sinh sèng [58]. 2.2.2. T×nh h×nh ë ViÖt Nam Sau ngµy gi¶i phãng miÒn Nam, bÖnh hoa liÔu nãi chung vµ bÖnh lËu nãi riªng lan trµn kh¾p n¬i. N¨m 1977, phßng kh¸m khoa Da liÔu bÖnh viÖn B¹ch Mai ®iÒu trÞ cho 276 ng−êi bÞ lËu. Theo thèng kª cña ngµnh Da liÔu tõ n¨m 1999 ®Õn n¨m 2007 sè bÖnh nh©n bÞ bÖnh lËu mçi n¨m lµ: N¨m 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Sè bÖnh nh©n 6.747 6.375 5.581 5.699 6.740 6.409 5.233 5.526 5.491 T×nh h×nh lËu m¾t ë trÎ s¬ sinh : N¨m 1996 1998 2000 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Sè bÖnh nh©n 140 66 21 22 18 10 04 13 13 2.3. H−íng dÉn ®iÒu trÞ bÖnh lËu b»ng kh¸ng sinh - Kh¸ng sinh hµng ®Çu Bao gåm: penicillin, ceftriaxone, ciprofloxacin, spectinomycin, tetracyclin. Dùa vµo kÕt qu¶ nu«i cÊy vµ kh¸ng sinh ®å cña vi khuÈn lËu, ng−êi ta chän ra nh÷ng thuèc kh¸ng sinh cã t¸c dông ®iÒu trÞ víi liÒu duy nhÊt, vÝ dô nh−: ceftriaxone, spectinomycin. - Kh¸ng sinh hµng thø hai Bao gåm: cephalothin, chloramphenicol, erythromycin, azithromycin, cefotaxime. Dùa vµo kÕt qu¶ nu«i cÊy vµ kh¸ng sinh ®å cña vi khuÈn lËu mµ ng−êi ta lùa chän kh¸ng sinh cho phï hîp t×nh h×nh tõng quèc gia nh−: cefotaxime, erythromycin, azithromycin.