Tài liệu So sánh kết quả phát hiện monodon baculovirus trên tôm sú (penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm malachite green, nhuộm haematoxylin và eosin, polymerase chain reaction

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Ø Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Cô Đặng Thị Hoàng Oanh, Chị Trần Việt Tiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Ø Tôi xin cảm ơn đến tất cả các thầy, cô, anh chị cán bộ khoa Thủy SảnTrường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này. Ø Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến các bạn lớp Bênh Học Thủy Sản K31 và các bạn bè xung quanh đã quan tâm, giúp đở tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Ø Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã hết lòng quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2009 Quảng Thị Mỹ Duyên i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm so sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. Đối với 30 mẫu tôm giống được phân tích bằng 3 phương pháp này thì có 8/30 mẫu (chiếm 27%) cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp và 22/30 mẫu (chiếm 73%) có sự khác biệt ở 3 phương pháp. Đối với 11 mẫu tôm thịt thì có 3/11 mẫu cho kết quả dương tính ở 2 phương pháp nhuộm Malachite Green và Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin thì 11/11 mẫu đều cho kết quả tế bào gan tụy bình thường. Qua kết quả này cho thấy ở phương pháp Polymerase Chain Reaction thì tiện lợi hơn phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, nhưng ở phương pháp nhuộm Malachite Green thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp phát hiện bệnh cho phù hợp. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ .................................................................................................. i TÓM TẮT ........................................................................................................ ii MỤC LỤC ..................................................................................................... . iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. .. v DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... ..vi DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... vii CHƯƠNG1: ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................ 1 1.1 Giới thiệu..................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.3 Nội dung ...................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới................................................................... 3 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................... 3 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó ............................................ 4 2.4 Bệnh MBV .................................................................................................. 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ............................................................................... 7 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý.................................................................................. 8 2.4.3 Phân bố ............................................................................................... 8 2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ............................................................... 9 2.4.5 Phương thức lây nhiễm ........................................................................ 9 2.4.6 Chẩn đoán bệnh ................................................................................... 9 2.4.7 Phòng bệnh .......................................................................................... 10 2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................................ 10 2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) ................................ 10 2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học ............................................................. 10 2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản .......................................... 11 2.7 Phương pháp PCR ...................................................................................... 12 2.7.1 Sơ lược về PCR ................................................................................... 12 2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ............................................ 13 2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản ................................. 14 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 15 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 15 3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu ........................................................... 15 3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Malachite Green............ 15 3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin . 15 3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR .......................................... 15 3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu .......................................................... 16 3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................... 16 3.2.3.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin ................................. 16 3.2.3.3 Phương pháp PCR.......................................................................... 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 16 3.3.1 Phương pháp thu mẫu .......................................................................... 16 3.3.2 Phương pháp phân tích ........................................................................ 17 3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................... 17 3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin ................................. 17 3.3.2.3 Phương pháp PCR.......................................................................... 20 3.4 Phương pháp xữ lý số liệu............................................................................ 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 23 4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộmH&E và PCR. ......................................................................................... 23 4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG ...................... 23 4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E .................... 25 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR. ................................ 26 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR.. .......................................................... 28 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................... 32 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 32 5.2 Đề xuất ....................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 36 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng sông cửu Long NTTS Nuôi Trồng Thủy Sản NCTS Nghiên Cứu Thủy Sản PL Postlarvae MBV Monodon Baculovirus WSSV White Spot Syndrome Virus MG Malachite Green H&E Haematoxylin và Eosin PCR Polymerase Chain Reaction v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson’s AFA ..................... 17 Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu ...................................... 18 Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu ............................. 19 Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, H&E và PCR ................................................................. 30 Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp nhuộm MG, H&E và PCR ................................................................. 31 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau .............. 23 Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm MG................................................................................ 23 Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV ............................................................ 24 Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG .............................. 24 Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG.................................. 25 Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E .............................................................................. 26 Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E .................................................................................................. 26 Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E .................................................................................................. 26 Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR ....... 27 Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR ................................................................................................... 27 Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR ......... 28 Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR ................................................................................................... 28 vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng và trên 60% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (Nguyễn Chu Hồi, 2008). Trong các đối tượng nuôi chính thì tôm sú là đối tượng nuôi đã đem lại hiệu quả kinh tế rất cao trong công tác xóa đói giảm nghèo và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân của vùng. Phong trào nuôi tôm sú thương phẩm ở ĐBSCL phát triển rầm rộ từ năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09. Diện tích tôm nuôi hiện nay đã tăng gấp đôi so với năm 2000 (từ 250.000 ha lên 540.000 ha và chủ yếu là tôm sú (538.800 ha) tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh, Tiền Giang, Bến Tre (Bộ NN&PTNN, 2008). Song song với việc gia tăng diện tích, sản lượng tôm nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn biến phức tạp và gây ra những tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Những bệnh chính thường xuất hiện trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL gồm bệnh do vi khuẩn như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, nghiêm trọng hơn là các bệnh do virus như White Spot Syndrome Virus (WSSV), Monodon Baculovirus (MBV), Yellow Head Disease (YHD),… Trong đó, Monodon Baculovirus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm sú, đặc biệt là gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng, đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của Monodon Baculovirus còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Liao et al., 1992 được trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo, 1997). Do hiện nay chưa có thuốc đặc trị nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp như nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin giúp cho việc chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bệnh lý dưới mức độ vi thể của tổ chức cơ quan. Bên cạnh đó, phương pháp Polymerase Chain Reaction chẩn đoán bệnh ở cấp độ phân tử, giúp phát hiện kịp thời nhằm hạn chế rũi ro do dịch bệnh ở mức thấp nhất. Do đó đề tài “So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction” được thực hiện. 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1.2 Mục tiêu So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction. 1.3 Nội dung Đề tài được thực hiện với các nội dung sau: (i) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. (ii) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm thịt bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, trên thế giới hai khu vực nuôi tôm lớn nhất là Đông Nam Á và Châu Mỹ. Sản lượng tôm nuôi ở Châu Á chiếm khoảng 80% sản lượng toàn cầu. Các nước chiếm sản lượng tôm nuôi cao là: Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Philippin, In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Hàn Quốc, Bănglađet, Việt Nam, Nauy...; có khoảng 20 loài tôm được nuôi trên thế giới. Trong đó, các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm nương (Penaeus chinensis), tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Sản lượng tôm nuôi năm 2000 của thế giới là 1.087.111 tấn chiếm khoảng 66% giáp xác nuôi, giá trị 6,880 tỷ USD, chiếm 73,4% trong giá trị nuôi giáp xác. Năm 2001 sản lượng đạt 1.270.875 tấn, giá trị 8,432 tỷ USD. Tổng sản lượng tôm nuôi chiếm 25% sản lượng tôm nói chung của thế giới ( trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006). 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Theo Ling (1973) và Rabanal (1974) thì nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã tồn tại từ thập niên 70 với hình thức nuôi tôm quảng canh. Trong đó, diện tích tôm nuôi ở ĐBSCL ở thời kì này đạt khoảng 70.000 ha. Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thật sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển mạnh vào những năm đầu thập kỹ 90. Tuy nhiên, sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hóa sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001. Song song, với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000 Việt Nam đã trở thành một trong năm nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất thế giới (Bộ thủy sản, 2006). Năm 2003 tổng diện tích tôm nuôi khoảng 518.557 ha đạt sản lượng hơn 258.034 tấn. Theo báo cáo sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích nuôi tôm của cả nước khoảng 625.600 ha đạt sản lượng khoảng 315.435 tấn. Trong đó, ĐBSCL là vùng có diện tích và sản lượng tôm chiếm khoảng 60-80% diện tích và sản lượng cả nước (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). Các loài tôm được nuôi chính ở Việt Nam là Tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Gần đây tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cũng được nhập về nuôi ở nước ta (trích dẫn từ Bộ Thủy sản, 2006). 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó Cùng với sự phát triển, tốc độ gia tăng diện tích và sản lượng tôm nuôi là tình hình dịch bệnh không ngừng bùng phát. Đây cũng là một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi. Tại Thái Lan nghề nuôi tôm năm 1992 bị thiệt hại 30 triệu USD (Nash et al., 1995); năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD (Wei Qi, 2001); năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu USD (Subasinghe et al., 1995); năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD (Chanratchakool et al., 2001); năm 1999 bệnh tôm đã làm Ecuador thiệt hại 280 triệu USD (Alday de Graindorge and Griffith 2001). Theo Lightner (1996) thì virus là tác nhân ch ủ yếu và đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. Chẳng hạn như bệnh do virus đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHD), hội chứng Taura đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Châu Mỹ La tinh hoặc bệnh MBV cũng đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú ở Đài Loan năm 1987 và 1988 (Chen et al., 1988). Thiệt hại hàng năm do bệnh dịch thủy sản gây ra cho thế giới là khoảng 3 tỷ USD (Rosenberry, 1996) (trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006) Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn của MBV trong cơ quan gan tụy của Postlarvae (PL) ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) (Rosenberry, 1997). Theo kết quả nghiên cứu của Liao (1999) thì quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987 nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%. Loài virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987-1988 (Liao et al., 1992). Natividad (1992) cho biết, ở Philippine đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn PL của tôm sú không nhiễm MBV (trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo,1997). MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981). Virus này gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et al., 1992). Còn theo Lightner (1996) thì MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius có tính trơ với virus. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (trích dẫn từ Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). Theo Phan Lương Tâm (1994) thì tại Việt Nam trong hai năm 1994-1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng. Các công trình nghiên cứu liên quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ở ĐBSCL cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1997). Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho thấy tại các tỉnh miền Trung có khoảng 70% bể PL có MBV dương tính. Khi đưa PL xuống ao đất để ương thành tôm giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90% ao ương nhiễm MBV. Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở miền Trung bị nhiễm MBV từ 60 – 70%. Đầu năm 2001, tôm sú đã chết hàng loạt, trên diện rộng ở ĐBSCL, được coi là “đại dịch tôm sú’'. Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại; một số vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80%. Nôn nóng chuyển đổi tự phát, không có kỹ thuật, hạ tầng thuỷ lợi chưa có là những nguyên nhân chính làm cho bệnh đốm trắng phát tán và lan tràn. Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái diễn ở ĐBSCL, được xác định là do hạ tầng chưa cải thiện, môi trường nuôi quá xấu. Đến hết tháng 9/2003, số diện tích nhiễm bệnh ở Kiên Giang là hơn 8.000 ha, Cà Mau bị hơn 232 ha; nhất là Miền Trung thất bại nặng nề khi Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận có hàng nghìn ha tôm bị nhiễm bệnh. Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định 40 tỷ. Khảo sát của Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản (NCTS) III cho thấy, nếu tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh, tôm giống có nguy cơ nhiễm cao, đặc biệt với bệnh MBV. Tôm giống sản xuất trong nước hiện tập trung ở miền Trung. Trong đó, riêng Khánh Hoà đã có hơn 1.000 trại, cung cấp khoảng 7 tỷ tôm PL cho cả nước. Với mật độ xây dựng trại giống ngày càng dầy, việc tuân thủ quy hoạch và các tiêu chuẩn xử lý thải hạn chế, ấu trùng tôm có nguy cơ nhiễm bệnh cao. Phòng bệnh học của Trung tâm NCTS III, đã phát hiện 30/54 mẫu kiểm tra 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tôm bố mẹ nhiễm MBV, với mẫu tôm PL bị nhiễm là 40,5% (trích dẫn từ Mai Phương và Hà Yên, 2003). Báo cáo kết quả của ngành NTTS năm 2003 thì cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm. Trong đó, diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra với tôm cũng chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm qua do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng từ 25-46,6%, trung bình 38,9% tỷ lệ nhiễm MBV từ 43,3-60%. Và trong số 4 nguồn cung cấp giống về cho 2 tỉnh vùng Ðông Bắc Bộ này, có tới 3 nguồn có quá nửa số giống bị nhiễm bệnh MBV. Tại các tỉnh Nam Bộ theo báo cáo năm 2003 của Viện NTTS II thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50% (Hà Anh, 2007). Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Quản lý bệnh thủy sản Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ từ năm 2001-2003 thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên tôm giống tại các tỉnh ĐBSCL là 13,1% và MBV là 33,8% (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004). Năm 2005 theo phòng kiểm dịch giống thủy sản Cà Mau cho biết qua số mẫu kiểm dịch đã có tới 83% mẫu tôm giống ở tỉnh bị nhiễm MBV. Trung tâm khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu năm 2006 đã xét nghiệm 2.326 mẫu tôm phát hiện có gần 50% số mẫu kém chất lượng; trong đó có 941 mẫu nhiễm MBV,184 mẫu nhiễm virus đốm trắng. còn ở Trung tâm khuyến ngư Kiên Giang thì qua kiểm tra 100 mẫu tôm giống, số lượng tôm bị nhiễm bệnh còi chiếm đến 40% lượng tôm sú giống nhập về (Cung Diễm, 2006). Trong đầu vụ nuôi tôm sú năm 2008, hiện đã có gần 100.000 ha nuôi tôm sú ở Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh… bị chết, mức độ thiệt hại từ 30-90% . Riêng ở Kiên Giang ước lượng mức thiệt hại do tôm chết đã trên 15 tỷ đồng. Trong đó, điển hình như huyện Vĩnh Thuận là 17.247 ha chiếm 88,98%; huyện An Minh 15.904 ha chiếm 50,25%; huyện U Minh hượng 3.653 ha chiếm 52,35%; và An Biên 2.475 ha chiếm 30,11% diện tích thả nuôi (Song Huỳnh, 2008). 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Tại huyện Mỹ Xuyên-Sóc Trăng là nơi có mô hình nuôi tôm-lúa được các nhà khoa học ở các viện, trường đại học trong cả nước đánh giá mang tính bền vững cao. Tuy nhiên, đến khoảng trung tuần tháng 4-2008, nơi đây có hơn 2.500 ha tôm nuôi bị chết, chiếm gần 80% diện tích. Nhiều hộ nuôi tôm ở Trà Vinh cũng lâm vào cảnh tương tự. Khi tôm được 2,5 tháng tuổi thì bị bệnh đốm trắng, đầu vàng… tình trạng tôm chết hàng loạt cũng đang diển biến phức tạp tại các huyện Châu Thành. Cầu Ngang, Duyên Hải…Cùng thời gian này, tại các Trạm kiểm dịch động vật thủy sản thuộc Chi cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản tỉnh Trà Vinh đã phát hiện và vận động các hộ sản xuất, kinh doanh tự tiêu huỷ hơn 24,5 triệu con tôm sú giống có mang mầm bệnh MBV, đỏ thân, phát sáng... Trong đó, có trên 22,2 triệu con con tôm giống sản xuất tại địa phương và gần 2,3 triệu con nhập ngòai tỉnh (Duy Hoàng, 2008). Phần lớn các diện tích tôm bị chết là do người nuôi thả giống trước lịch thời vụ. Trong thời gian đầu, tôm phát triển tốt, nhưng sau đó thì bị bệnh đốm trắng, một số khác thì bị đỏ thân. Hiện nay, ĐBSCL mỗi năm cần khoảng 22 đến 25 tỷ con giống. Trong khi đó, nguồn tôm giống ở các địa phương chỉ đáp ứng khoảng 30 đến 35%, còn lại phải thu mua con giống từ các tỉnh miền Trung nhưng theo thống kê thì nguồn tôm giống ở các tỉnh này có tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao từ 65-70%. Theo Sở Thủy sản Bạc Liêu, qua kiểm tra trên 355 mẫu tôm giống tại các cơ sở bán tôm giống đã phát hiện có 52,4% (186/355) mẫu bị nhiễm bệnh MBV; 10,4% (37/355) mẫu bị nhiễm bệnh đốm trắng; 11% (39/355) mẫu bị nhiễm bệnh đầu vàng (Nguyễn Kiểm, 2008). Theo báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn tiếp tục chết tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện tích tôm chết từ đầu năm đến nay trên 120.000ha, nhiều gần 3 lần tháng 32008, tập trung tại Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha (Thảo An, 2008). 2.4 Bệnh MBV 2.4.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh MBV là virus type A baculovirus monodon, có cấu trúc nhân là ADN hai mạch, có lớp vỏ bao, dạnh hình que (Lightner, 1996). Chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ±15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng MBV của tôm (P. plebejus, P. monodon, P. merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260- 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm (Mari et al., 1993 được trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006). Virus ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tụy và tế bào biểu bì phía trước ruột giữa, virus tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn tiềm ẩn: sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất biến đổi. Giai đoạn 1: Nhân tế bào trương nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển ra sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt mỡ. Virus bắt đầu gây ảnh hưởng. Giai đoạn 2: Nhân trương to, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn trong nhân. Giai đoạn 3: tế bào bị bệnh, nhân tăng lên 2 lần đường kính, 6 lần thể tích. Bên trong nhân có một đến nhiều thể ẩn, trong thể chứa đầy các virus. Các virus phá hũy tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang các tế bào khác hoặc theo chất bài tiết của tôm ra môi trường, tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn và nước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2008) thì khi tôm mới nhiễm MBV, dấu hiệu bệnh không biểu hiện rõ ràng. Khi tôm nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có biểu hiện một số dấu hiệu sau: Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh trưởng chậm. Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám như: ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi. Gan tụy teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh. Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao. 2.4.3 Phân bố Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú đưa từ Đài Loan đến nuôi ở Mêhico (Lightner et al., 1981,1983). Tiếp theo các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh MBV có xuất phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc…Theo Chen et al. (1989) thì những năm 1987 và 1988 ở Đài Loan bệnh MBV đã gây 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com thiệt hại nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm sú (trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006). Cho đến nay bệnh MBV đã phân bố rộng rãi ở tôm nuôi và tôm tự nhiên khu vực Đông bán cầu và hiện nay ghi nhận ở Úc, Đông Á, Trung Á, Đông Nam Á, Ấn Độ, Đông Châu Phi. 2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm Tôm sú là loài thường xuyên nhiễm bệnh MBV, các loài tôm khác cũng khả năng bị nhiễm MBV như: P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. vannamei (Lightner, 1996). MBV nhiễm từ giai đoạn Post đến giai đoạn tôm trưởng thành, ngoại trừ trứng, ấu trùng Nauplius (Lightner, 1996). 2.4.5 Phương thức lây nhiễm Bệnh MBV lan truyền từ tôm bị nhiễm bệnh sang tôm khỏe (chủ yếu là tôm khỏe ăn tôm bệnh hoặc nhiễm virus theo chất thải của tôm). (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008) 2.4.6 Chẩn đoán bệnh Có thể chẩn đoán sơ bộ bệnh MBV thông qua các dấu hiệu chính của bệnh như đã mô tả ở phần trên. Áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mẫu mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng Malachite green, dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X. Dưới kính hiển vi, có thể nhận biết sự hiển diện của virus này thông qua sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu, ít bắt màu thuốc nhuộm, nằm trong các nhân phình to của tế bào biểu mô gan tụy. Có thể dùng phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin để phát hiện các thể ẩn hình cầu, bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, ở độ phóng đại ≥ 40X. Ngoài ra, cũng có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặc trưng của MBV, dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các vi thể virus MBV trong nhân tế bào biểu mô gan tụy hay các kỹ thuật như ELISA, lai tại chổ... (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.4.7 Phòng bệnh Không dùng tôm giống có nhiễm mần bệnh MBV. Kiểm tra đàn tôm bố mẹ trước khi cho đẻ. Cải tạo ao thật kỹ trước mỗi vụ nuôi. Nuôi tôm đúng mùa vụ, quản lý, chăm sóc tốt, cung cấp đầy đủ thức ăn về chất và lượng. Không để tôm sốc trong quá trình nuôi. Xử lý nước bằng ozon và các chất sát trùng Benzalkon clorua trước khi ấp trứng thì có thể sản xuất được đàn tôm PL không bị nhiễm MBV (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). 2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green Phương pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green 0,05-0,1% được Lightner et al. đề ra năm 1983 nhằm phát hiện các thể ẩn của MBV trong vòng 5 phút. Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này thì hạn chế, nó chỉ có thể kiểm tra được những con tôm bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trước cấp tính trong một quần đàn có tỷ lệ nhiễm cao (Lightner et al., 1989). 2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) 2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học Mô học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhock (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỷ XVIII Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Tiếp theo lĩnh vực nghiên cứu này là Xanvier Bichat (1771-1802), một giảng viên dạy giải phẩu học và phẩu thuật tại một trường đại học ở Pari đã đưa ra khái niệm chung đầu tiên về mô học trên động vật, và từ đó mô học trở thành một phần của môn giải phẩu học dạy cho sinh viên y khoa. Tiếp theo đó, các nhà động vật học đã vận dụng công cụ mới này vào nghiên cứu của họ trên nhiều động vật khác nhau (trích dẫn từ Tài Hoàng Nhật Quang, 2008). Để góp phần vào sự phát triển của mô học, nhà bệnh học người Đức Rudolph Virchow (1821-1902) đã đề xuất ý tưởng “bệnh có thể được đặc trưng bởi những biến đổi ở cấp độ tế bào”. Ý tưởng này đã đóng góp to lớn cho học thuyết tế bào và sự phát triển của mô bệnh học. Từ đó, mô học không chỉ được 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ứng dụng trong việc nghiên cứu cấu trúc mô bình thường mà còn được áp dụng trong nghiên cứu những biến đổi cấu trúc của cơ quan bệnh. Theo Lightner và Bell (1989) thì mô học là khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào, như mô thần kinh, mô da. Những biến đổi bệnh lý ở các mô và tế bào được gọi là những tổn thương vi thể. Nghiên cứu các tổn thương có nghĩa là mô tả đầy đủ mọi chi tiết của tổn thương đó ở mức độ vi thể rồi kết luận nó thuộc nhóm bệnh gì. Mô tả bệnh không chỉ mô tả tổn thương mà còn là công việc so sánh đối chiếu các tổn thương đó đối với những biểu hiện lâm sàng của tôm, cá. Nghĩa là tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa những biến đổi hình thái với các rối loạn chức năng trên cơ sở xác định việc chẩn đoán (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). 2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng mô học trong việc hệ thống các bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et al., 1992). Năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện diện virus đốm trắng trên Penaeus monodon và Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử. Kế đến năm 1998, Sudha et al. bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) . Ở Việt Nam, năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR và năm 2000 ông cũng ứng dụng tiếp 2 phương pháp này trong nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bệnh đỏ mang trên tôm sú bố mẹ, bệnh phát sáng, bệnh đục thân và bệnh đốm trắng trên ấu trùng tôm sú giống tại các trại giống thuộc các khu vực Miền Trung và Nam Bộ”. Năm 2001, Hòa cũng đã ứng dụng mô học trong việc xác định cường độ cảm nhiễm MBV. Đến năm 2003, Bùi Quang Tề cũng đã ứng dụng phương pháp này vào việc chẩn đoán bệnh tôm và đưa ra phương pháp phòng trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo đã ứng dụng phương pháp mô học và PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm giống và tôm thịt. Theo Nguyễn Anh Tuấn và ctv (2003) thì phương pháp này là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đoán được bệnh bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó cũng có những hạn chế là thao tác tương đối chậm và chỉ phát hiện bệnh khi tôm đã nhiễm nặng. Đồng thời khi sử dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh nên kết hợp với 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm vì đôi khi những hình thái tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau (trích dẫn từ Phùng Thúy An, 2005). 2.7 Phương pháp PCR 2.7.1 Sơ lược về PCR Polymerase Chain Reaction là phương pháp được Kary Mullis et al. phát minh năm 1985 đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử nói chung đạt được những thành tựu to lớn. PCR là kỹ thuật khuếch đại từ một đoạn ADN bất kỳ có thể nhân lên hàng tỷ lần nhanh chóng nhờ sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (primer) chuyên biệt (oligonucleotides) dài khoảng 17 đến 30 nucleotite có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn ADN gốc, enzyme tổng hợp ADN, các nucleotide tự do và dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần virus. Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này (Trần Việt Tiên, 2007). Hiện nay, PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền, phân tích pháp y,… Theo Khuất Hữu Thanh (2006) thì PCR là một chuổi chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép (dNTP, enzyme ADN polymerase, Mg2+…), phân tử ADN được biến tính cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn lai (anealation): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các đoạn mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 600C-700C, tùy theo độ lớn và Tm của các đoạn mồi sử dụng và thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho ADN polymerase tổng hợp tốt nhất (thường dùng Taq ADN polymerase tách chiết từ̀ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus). Thời gian của các bước này tùy thuộc độ dài của ADN cần khuếch đại, thường 30 giây đến nhiều phút. 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com