Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xathin oxidase in vitro

  • Số trang: 108 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 17 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI H ÀNG TH TH NH TH ÀNG ỌC C C C TH C I TN C T C D NG C CH XANTHIN OXIDASE IN VITRO ẬN ĂN THẠC Ĩ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI H ÀNG TH TH NH TH ÀNG ỌC C C C TH C I TN C T C D NG C CH XANTHIN OXIDASE IN VITRO ẬN ĂN THẠC Ĩ DƯỢC HỌC C Y GÀ D C VÀ D Ã Ố: 60720405 C À G gười hướng dẫn khoa học: T . Nguyễn Thùy Dương T . Nguyễn u nh Chi HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thuỳ Dương và TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS. Nguyễn Hoàng Anh những người thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này. in chân thành cám ơn T . hương Thi n Thương và các cán bộ i n ược li u đã h trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu nghiên c u. in chân thành cảm ơn Đại h c .T . guy n Th oài – hoa ược, Trường ược uế đã h trợ tôi trong quá trình chiết xuất phân đoạn và phân lập chất nghiên c u. in chân thành cảm ơn các thầy, cô, các anh ch kỹ thuật viên, các bạn sinh viên Bộ môn ược lực đã giúp đỡ và tạo điều ki n cho tôi trong suốt quá trình nghiên c u và thực hi n đề tài. in chân thành cảm ơn các cán bộ phòng đào tạo sau đại h c, các bộ môn, phòng ban khác của Trường Đại h c ược à ội. Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, đồng nghi p những người đã luôn luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này. à ội, tháng 10, năm 2013. H c viên Hoàng Thị Thanh Thảo MỤC LỤC N MỤC C C C N MỤC N N MỤC ÌN N ........................................................................................................... 1 Chương 1. ỔN QU N 1.1. Acid u i L U ..................................................................... 3 tăng acid uric .................................................................. 3 1.1.1. Acid uric ........................................................................................................... 3 1.1.2. Tăng acid uric m u .......................................................................................... 5 1.2. Enzym xanthin oxidase ..................................................................................... 8 1.2.1. Cấu trúc, cơ chế hoạt động v động h c c 1.2.2. C c yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động c 1.3. C hương h nh gi t x nthin oxid se ......................... 8 xanthin oxidase ............................. 10 ng ứ h nthin i in vitro ........ 14 1.3.1. Phương ph p đo qu ng ................................................................................... 14 1.3.2. Phương ph p đo p ........................................................................................ 15 1.3.3. Phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng c o với detector huỳnh qu ng ............. 16 1.4. C h nghi n ứ t nthin i PN ư i t ng h i i th ng ứ ................................................................................................ 16 Chương . N U P i N L U N UN P N N P N N CỨU ............................................................................................ 18 2.1. Ng y n ật i ............................................................................................... 18 2.1.1. ư c liệu nghi n c u .................................................................................... 18 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghi n c u ............................................................................. 19 2.1.3. Thuốc h 2.1.4. 2.2. N i chất ............................................................................................. 25 y m c, thiết bị d ng c ........................................................................... 26 ng nghi n ứ ...................................................................................... 27 2.3. Phương h nghi n ứ ............................................................................... 28 2.3.1. Tri n kh i phương ph p đ nh gi t c d ng c chế x nthin oxid se in vitro tr n đ UV giếng Costar 3635 .......................................................................... 28 2.3.2. Áp d ng đ nh gi t c d ng c chếx nthin oxid se in vitro tr n đ giếng Costar 3635 c UV 96 c c dư c liệu đư v o s ng l c ........................................... 32 2.3.3. Phương ph p x c định cơ chế c chế x nthin oxid se in vitro c chất c t c d ng ......................................................................................................................... 34 2.3.4. Phương ph p x lý số liệu ............................................................................. 35 Chương 3. K .1. K t QU ........................................................................................... 36 t i n h i hương h oxidase in vitro t n nh gi t ng ứ h xanthin gi ng Costar 3635 .............................................. 36 UV 3.1.1. Kết quả khảo s t động h c enzym ................................................................. 36 3.1.2. ết quả x y d ng đ thị inewe rver – urk c x nthin oxid se .............. 36 ết quả thẩm định phương ph p th ng qu đ nh gi t c d ng c chế XO in 3.1.3. vitro c llopurinol ................................................................................................. 37 3.2. K t ng ư t ng h acid uric th ng ứ h nthin oxidase in vitro ....................................................................................................... 40 ết quả đ nh gi t c d ng c chế xanthin oxidase in vitro c 3.2.1. c c c o dư c liệu ......................................................................................................................... 40 3.2.2. ết quả x c định C50 c . .K t M n nh gi t c c dư c liệu tiềm năng ....................................... 47 ng ơ h ứ h nthin i in vitro ủ (Archidendron clyearia) .......................................................................... 48 3.3.1. ết quả x c định C50 c c c ph n đoạn 3.3.2. ết q c c chất tinh khiết t ch từ ph n đoạn ACE ........ 49 x c định C50 c 3.3.3. ết quả x c định cơ chế c Chương 4. K nđ ....................................... 48 ACE .............................................................. 50 N LU N ......................................................................................... 52 LU N ............................................................................................................ 60 U L ............................................................................................................... 61 U P Ụ LỤC MK O N MỤC C C C ABCG2 ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABT 2 2’-azino-di (3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate AHP 2-amino-4-hydroxypteridin ATP Adenosin triphosphat BCRP Breast cancer resistance protein CCTT Chư c th ng tin DMSO Dimethyl sulfoxid EULAR The European League Against Rheumatism HGPRT Hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase IC50 ng độ c chế 0 hoạt độ enzym IXP Isoxanthopterin OXH Oxy h PRPP Phosphoribosyl pyrophosphate PT Đ Ph n tr n m t đất SLC2A9 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9 protein URAT1 Urate transporter 1 XO Xanthine oxidase N ng 1.1 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 MỤC N n b ng Trang ối li n qu n giữ cơ chế c chế v c c th ng số Vmax bi u kiến m bi u kiến nh s ch dư c liệu đư v o s ng l c 19 ố trí hỗn h p phản ng trong từng giếng ết quả đ nh gi t c d ng 32 c chế x nthin oxid se c llopurinol ở c c n ng độ kh c nh u Ảnh hưởng c c c dịch chiết l n hoạt độ XO in vitro tại c c n ng độ 100 µg/ml ng độ c chế 0 0 µg/ml 10 µg/ml hoạt độ xanthin oxidase (IC50) c c c dư c liệu tiềm năng ng độ c chế 0 hoạt độ XO ( C50) c c c ph n đoạn hoạt độ XO ( C50) c một số chất từ nđ ng độ c chế 0 nđ Th ng số động h c enzym XO khi c m t v kh ng c m t ACE8 13 38 41 47 48 49 51 N nh MỤC ÌN n h nh Trang 1.1 Qu tr nh h nh th nh acid uric trong cơ th 3 1.2 C c k nh v n chuy n acid uric ở ống th n 4 1.3 C c nguy n nh n g y tăng acid uric m u 5 1.4 Cấu trúc x nthin oxid se 9 1.5 Cơ chế hoạt động c 10 1.6 Đ thị h m số ngư c 1/v đối với [S] 13 2.1 Quy tr nh thí nghiệm khảo s t động h c enzym 29 2.2 Quy tr nh thí nghiệm x y d ng đ thị Linewearver-Burk 30 2.3 2.4 x nthin oxid se Quy tr nh thí nghiệm đ nh gi t c d ng c chế x nthin oxid se c llopurinol Đ thị bi u di n t c d ng c chế x nthin oxid se c llopurinol ở c c n ng độ kh c nh u Đ thị bi u di n s ph thuộc theo th i gi n c 3.1 31 34 lư ng cid uric tạo th nh (bi u di n th ng qu O ) với c c dung dịch enzym c 36 hoạt độ kh c nh u 3.2 3.3 3.4 Đ thị inewe rver – urk c x nthin oxid se tr n đ UV giếng Costar 3635 Đ thị bi u di n t c d ng c chế x nthin oxid se c llopurinol ở c c n ng độ kh c nh u Đ thị phương tr nh inewe ver – Burk c oxid se khi c m t v kh ng c m t chất c chế enzym x nthin 37 39 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid uric là sản phẩm của quá trình chuyển hóa protein có nhân purin trong cơ thể. Acid uric có vai trò quan trọng với cơ thể con người liên quan tới duy trì huyết áp, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch [39], [44], [53], [74]. Tuy nhiên, tăng acid uric máu, đặc biệt tăng acid uric máu mạn tính, lại là nguyên nhân dẫn tới nhiều vấn đề về sức khỏe như gút, tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh thận, bệnh đái tháo đường typ II [44], [74], [84]. Trong đó gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất, ảnh hưởng đến 2,13% dân số Mỹ trong năm 2009 [23]. Theo các nghiên cứu gần đây, gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu ngày càng trở nên phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà cả các nước đang phát triển [24], [34], [86], [109]. Theo một nghiên cứu năm 2000, tỷ lệ mắc bệnh gút ở Việt Nam ước tính là 0,14% dân số và tỷ lệ này ngày một tăng cao [10], [73]. Hạ acid uric là mục tiêu hàng đầu trong phòng, điều trị gút và các bệnh liên quan đến tăng acid uric máu [39]. Hiện nay, hai nhóm thuốc hạ acid uric máu gồm các thuốc làm tăng thải acid uric qua thận và nhóm thuốc làm giảm tổng hợp acid uric. Các thuốc gây tăng thải acid uric như probenecid, sulfinpyrazon có hiệu quả tốt trong việc làm hạ acid uric máu, đặc biệt làm giảm kích thước cũng như số lượng các hạt tophi. Tuy nhiên, thuốc tỏ ra kém hiệu quả trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận và có thể gây ra sỏi thận urat cũng như nhiều tác dụng phụ khác [2], [72], [83], [107]. Các thuốc làm giảm tổng hợp acid uric như allopurinol, febuxostat được sử dụng khá phổ biến trên lâm sàng và thể hiện tác dụng hạ acid uric tốt. Tuy nhiên, các thuốc này cũng có không ít tác dụng không mong muốn. Allopurinol gây độc với gan, tổn thương thận, ban da, kích ứng đường tiêu hóa, các phản ứng quá mẫn tuy hiếm gặp nhưng nặng nề và có thể gây tử vong [38], [72], [92]. Febuxostat gây rối loạn chức năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt [48]. Vì vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, bổ sung vào các bài thuốc điều trị gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu nhằm khắc 1 phục những nhược điểm gặp phải với các thuốc tân dược đang trở thành mối quan tâm trong phát triển thuốc mới. Tiềm năng về dược liệu của Việt Nam rất lớn [4], [11]. Các nhà khoa học Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu về tác dụng hạ acid uric của dược liệu và bước đầu có thành công nhất định. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung đánh giá tác dụng phòng và điều trị gút của một dược liệu hoặc một bài thuốc cụ thể, chỉ có 1 nghiên cứu sang lọc dược liệu có tiềm năng hạ acid uric của Nguyễn Thị Thanh Mai [6], [7], [75]. Việc nghiên cứu sàng lọc trên quy mô lớn để tìm kiếm, phát hiện các dược liệu có hiệu quả hạ acid uric tốt là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635. 2. Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu (khoảng 100 loài) được thu hái ở Việt Nam. 3. Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của dược liệu tiềm năng nhất. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ACID URIC VÀ SỰ TĂNG ACID URIC MÁU 1.1.1. Acid uric Acid uric có công thức phân tử là 2,6,8 - trioxypurin (C5H4N4O3), là chất chuyển hóa của purin [78]. 1.1.1.1. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể Acid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có chứa nhân purin (adenin, guanin) trong cơ thể với sự tham gia của các enzym: phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleoside phosphorylase, xanthin oxidase (XO) [37], [78] (hình1.1). Hình 1.1: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [37] 3 1.1.1.2. Quá trình thải trừ acid uric ra khỏi cơ thể Acid uric được thải trừ ra ngoài cơ thể theo hai con đường. Khoảng 2/3 lượng acid uric tạo ra mỗi ngày được thải trừ qua thận, 1/3 được thải trừ qua đường tiêu hóa [50], [53]. Tại thận, 100% acid uric được lọc qua cầu thận, sau đó được tái hấp thu tới 90% tại ống thận. Có nhiều kênh vận chuyển tham gia quá trình tái hấp thu acid uric tại thận (hình 1.2). Trong đó, có hai kênh quan trọng là kênh URAT1 (urat transporter) và SLC2A9. URAT1 là kênh vận chuyển urat đầu tiên được tìm thấy. Đây là kênh trao đổi anion – urat nằm trên diềm bản chải của ống lượn gần. Kênh SLC2A9 là kênh vận chuyển aqcid uric quan trọng nhất, công suất vận chuyển acid uric của SLC2A9 cao hơn URAT1 nhiều lần. Hình 1.2: Các kênh vận chuyển acid uric ở ống thận [50] 4 Con đường thải trừ acid uric qua ruột được quyết định bởi kênh ABCG2. ABCG2 còn có tên khác là BCRP, kênh vận chuyển acid uric sử dụng năng lượng ATP để vận chuyển urat vào lòng ruột [50], [53], [85]. 1.1.2. Tăng acid uric máu Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric máu vượt quá 7,0 mg/dl (420 µmol/l) đối với nam và 6,0 mg/dl (360 µmol/l) đối với nữ [10], [78]. 1.1.2.1. Nguyên nhân gây tăng acid uric máu Các nguyên nhân gây tăng acid uric máu được chia thành hai nhóm chính, một là do tăng sản xuất acid uric, hai là do thận giảm bài xuất acid uric. Gần đây, cùng với việc thừa nhận vai trò quan trọng của con đường đào thải acid uric qua đường tiêu hóa, các nhà khoa học Nhật Bản đã đề xuất chia các nguyên nhân gây tăng acid uric máu thành 2 nhóm lớn như sau: nhóm A gồm các nguyên nhân ngoài thận (trong đó gồm 2 nhóm nhỏ, A1: tăng sản xuất acid uric, A2: giảm đào thải qua con đường ngoài thận), nhóm B gồm các nguyên nhân giảm đào thải acid uric qua thận [53]. (Hình 1.3) Hình 1.3: Các nguyên nhân gây tăng acid uric máu [53] 5  Tăng sản xuất acid uric Các nguyên nhân gây tăng sản xuất acid uric gồm có: tăng các chất có nhân purin, rối loạn hoạt động các enzym. - Các chất có nhân purin là nguồn để tạo thành acid uric, được cung cấp do ba nguồn: thức ăn giàu purin, tổng hợp nội sinh, tiêu hủy tế bào chết. Những người thường xuyên ăn nhiều thức ăn giàu purin, sử dụng nhiểu rượu, bia có nguy cơ tăng acid uric máu và mắc bệnh gút cao hơn những người khác. Tăng purin nội sinh có vai trò chủ yếu trong việc tăng acid uric máu và gút [37], [78]. - Rối loạn hoạt động các enzym là nguyên nhân quan trọng gây tăng acid uric máu. PRPP và xanthin oxidase tăng hoạt động làm tăng nồng độ acid uric máu. Sự thiếu hụt một phần hay toàn phần HGPRT (HGPRT xúc tác cho phản ứng nghịch chuyển acid guanylic thành guanin) làm tăng phản ứng chuyển hypoxanthin thành xanthin và sau đó là acid uric [10], [37], [78].  Giảm đào thải acid uric qua ruột Giảm hoạt động của kênh ABCG2 (BCRP) làm tăng đào thải acid uric qua thận nhưng lại làm giảm đào thải acid uric qua ruột và do đó làm tăng acid uric máu [50], [53].  Giảm đào thải acid uric qua thận Có đến 80 – 90% bệnh nhân tăng acid uric máu bị giảm thải trừ acid uric qua thận. Các đa hình ở các gen quy định URAT1 và SLC2A9 gây tăng hoạt động của các kênh vận chuyển này, do đó làm tăng tái hấp thu acid uric ở ống thận, giảm thải trừ acid uric ở thận [53], [78]. Một số trường hợp giảm thải trừ acid uric qua thận do dùng thuốc (corticoid, aspirin liều thấp, thuốc lợi tiểu) hoặc suy thận dẫn đến rối loạn chức năng thận [37], [86]. 6 1.1.2.2. Tăng acid uric máu và các bệnh liên quan Acid uric máu ở người cao hơn so với các động vật khác nhằm giúp con người duy trì mức huyết áp cao hơn, và sự tăng acid uric máu trong thời gian ngắn có vai trò quan trọng đối với hệ thống miễn dịch và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa. Tuy nhiên, tăng acid uric máu mạn tính lại đem đến nguy cơ cao mắc các bệnh gút, bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh thận [44], [74], [84].  Tăng acid uric máu và gút Tăng acid uric máu là điều kiện tiên quyết của bệnh gút và là đặc trưng cơ bản của bệnh gút [23], [86], [90]. Bệnh nhân tăng acid uric máu 5 năm với mức acid uric máu trên 10 mg/dl có nguy cơ mắc bệnh gút là 30,5%, trong khi những người có mức acid máu dưới 7 mg/dl nguy cơ này chỉ là 0,6% [55]. Một nghiên cứu cộng đồng tại Đài Loan trên 3.185 người ở độ tuổi trên 30, tỷ lệ mắc gút tăng theo nồng độ acid uric trong huyết thanh: 10,8% khi nồng độ acid uric trong huyết thanh trong khoảng 7,0-7,9 mg/dl; tăng lên 27,7% khi nồng độ acid uric trong huyết thanh trong khoảng 8,0-8,9 mg/dl; và tăng lên 61,1% khi nồng độ acid uric trong huyết thanh trên 9,0 mg/dl [86].  Tăng acid uric máu và tăng huyết áp, bệnh tim mạch Tăng acid uric máu có mối liên hệ chặt chẽ với bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch [69]. Nồng độ acid uric máu cao làm thay đổi cấu trúc, chức năng của vi mạch, từ đó làm rối loạn chức năng nội mô là nguyên nhân của bệnh động mạch vành và bệnh tăng huyết áp. Mặt khác, tăng acid uric máu cũng làm tăng nguy cơ béo phì và suy giảm chức năng thận dẫn đến tăng nguy cơ về bệnh tim mạch [39], [84].  Tăng acid uric máu và bệnh thận Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy, tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ mắc bệnh thận. Acid uric máu cao không những làm tổn hại tới động mạch vành mà còn ảnh hưởng tới mạch máu ở thận. Các nghiên cứu can thiệp gần đây cung cấp bằng chứng cho thấy, giảm urat khi sử dụng allopurinol có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh suy thận mạn tính [39], [45], [84]. 7  Tăng acid uric máu với kháng insulin và béo phì Những bệnh nhân có bệnh về chuyển hóa có tỷ lệ mắc bệnh gút cao hơn. Tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ kháng insulin, béo phì [83]. Nguy cơ mắc đái tháo đường typ II của bệnh nhân gút tăng 35% đến 65% [84] so với người bình thường. Như vậy, tăng acid uric máu không chỉ là nguyên nhân gây bệnh gút mà còn đóng vai trò quan trọng trong các bệnh khác như huyết áp, tim mạch, thận và đái tháo đường typ II. Hạ acid uric máu là mục tiêu điều trị quyết định trong bệnh gút và các bệnh khác liên quan tới tăng acid uric. 1.2. ENZYM XANTHIN OXIDASE Xanthin oxidase (XO) là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong chuỗi phản ứng để tạo thành acid uric trong cơ thể. Bất kỳ tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh hưởng tới sự tạo thành acid uric trong cơ thể. Enzym XO được tìm thấy ở nhiều động vật có vú, chim, côn trùng, vi khuẩn [12]. Ở động vật có vú, XO được phân bố rộng rãi ở gan, ruột, thận, phổi, tim, não, huyết tương, hồng cầu và các mô khác, trong đó tập trung chủ yếu ở gan, ruột [21]. Ở người, XO được tìm thấy trong hầu hết các tế bào của cơ thể, tuy nhiên nó có nhiều nhất trong các tế bào gan và các tế bào ruột [18]. 1.2.1. Cấu trúc, cơ chế hoạt động và các thông số động học của xanthin oxidase  Cấu trúc Xanthin oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị chứa bốn thế oxy hóa khử: một phần phụ molybden, một FAD, 2 Fe2S2 [12], [49]. Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác [49] (Hình 1.4). 8 A B Hình 1.4: Cấu trúc xanthin oxidase (A: Cấu trúc không gian của xanthin oxidase, B: Phần phụ molybden)  Cơ chế hoạt động Hoạt động xúc tác cho phản ứng tạo thành acid uric từ xanthin xảy ra ở trung tâm molybden của xanthin oxidase. Ở trạng thái oxy hóa, trung tâm molybden của enzym có thể được xây dựng như mô hình LMoVIOS(OH) với L là đại diện cho đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzym molybden và vonfram đơn nhân. Cơ chế hoạt động của enzym như sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng từ vị trí C-8 tới nhóm Mo-S tạo ra LMoIVO(SH)(OR) – giai đoạn 1. Sản phẩm trung gian này bị phá vỡ bởi sự vận chuyển electron giữa các trung tâm oxy hóa khử khác trong enzym, giải phóng H+, tạo ra LMoVOS(OR) – giai đoạn 2. Sau đó, hydro từ dung môi thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu LMoVIOS(OH) của enzym – giai đoạn 3 [32] (Hình 1.5). 9 Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase  Các thông số động học enzym Thông số dược động học của enzym (Km và Vmax) được xác định bằng phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giá trị Km thu được nằm trong khoảng 5,32 – 13,8 µM [54]. 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của xanthin oxidase  Nồng độ cơ chất Xanthin oxidase xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và xanthin thành acid uric. Khi nồng độ của xanthin trong cơ thể tăng thì tốc độ của phản ứng chuyển hóa sẽ tăng, acid uric tạo ra sẽ càng nhiều. Tuy nhiên, đến một mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [1]. Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ xanthin thích hợp trong phản ứng để tốc độ phản ứng tối đa nhưng không lãng phí cơ chất.  Nồng độ enzym Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [1]. Nồng độ enzym cũng là một yếu tố quan trọng khi xác định động học enzym, thời gian dừng phản ứng thích hợp. 10  Nhiệt độ Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng enzym lên cực đại nhờ cơ chế tăng năng lượng cung cấp cho các phân tử cơ chất. Khi tăng nhiệt độ lên 10oC, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên 2 lần. Tuy nhiên, đến một nhiệt độ quá cao, enzym sẽ bị biến tính do bị phá vỡ các liên kết trong cấu trúc. Mỗi enzym đều có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng enzym đạt tới tốc độ cao nhất [1]. Nhiệt độ cũng là một yếu tố trong quá trình bảo quản enzym. Xanthin oxidase bảo quản ở nhiệt độ 4oC sẽ không bị giảm hoạt tính trong vòng 6 tháng. Ở nhiệt độ -20 oC, enzym ổn định trong ít nhất một năm. Theo một số nghiên cứu so sánh giữa xanthin oxidase sữa bò với xanthin oxidase sữa dê, nhiệt độ tối ưu cho xanthin oxidase từ sữa bò là 10oC và cho xanthin oxidase từ sữa dê là 20oC [40], [54].  pH Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác dụng rất lớn đối với tốc độ phản ứng enzym. Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho hoạt động của enzym đó. Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của nhóm chức trong trung tâm hoạt động enzym [1]. Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 7,5 – 8. Cũng có nghiên cứu khác cho thấy pH thích hợp từ sữa bò là 7,5 và từ sữa dê là 7,2 – 7,4 [54].  Ion kim loại Các ion kim loại nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg2+, Ag+…). Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [1]. 11  Các chất ức chế Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, nhiều loại purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác như 6 - aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd, một số thuốc và một số dịch chiết từ các loài thực vật [12]. Các cơ chế ức chế enzym bao gồm ức chế cạnh tranh (competitive inhibition), ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition) và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition). Chất ức chế cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự cơ chất, kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất. Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition), chất ức chế gắn với trung tâm điều hòa của enzym làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của enzym [62]. Cơ chế ức chế được xác định thông qua đồ thị phương trình Lineweaver – Burk, là đồ thị hàm số ngược 1/V đối với nồng độ cơ chất (ký hiệu là [S]) với sự có mặt và không có mặt chất ức chế ở các nồng độ khác nhau (được ký hiệu là [I]) (hình 1.6). Mối liên quan giữa các thông số động học biểu kiến của enzym khi có mặt chất ức chế với cơ chế ức chế được thể hiện ở bảng 1.1 [62]. 12
- Xem thêm -