Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế Xanthin oxidase in vitro

  • Số trang: 87 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 20 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HOÀI SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HOÀI SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn 1. TS. Nguyễn Thùy Dương 2. TS. Nguyễn Quỳnh Chi Nơi thực hiện Bộ môn Dược lực Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khoá luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thuỳ Dương, TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS. Nguyễn Hoàng Anh, DS. Phạm Đức Vịnh - những người thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô phòng Đào tạo, các bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và tích lũy những kiến thức bổ ích trong suốt 5 năm học vừa qua. Tiếp theo tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược lực đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Phùng Thiện Thương, Viện Dược liệu; TS. Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Việt Nam; PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, khoa Dược, Trường Đại học Y dược Huế đã cung cấp mẫu nghiên cứu để tôi thực hiện đề tài. Trong quá trình tìm kiếm tài liệu và tra cứu thông tin, tôi còn nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các anh chị đang học tập tại nước ngoài trong Goup “Nhóm tải báo” và Group “VietPhD.org”. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu đó. Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh và ủng hộ hết lòng, tạo điều kiện tốt nhất, giúp đỡ, động viên và đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khoá luận này. Hà Nội, tháng 5 năm 2014. Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hoài MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1. TĂNG ACID URIC MÁU VÀ ĐÍCH TÁC DỤNG CỦA THUỐC .....3 1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric ...........................................3 1.1.2. T ng 1.1.3. Đí h t i uri m u ..........................................................................4 ụng của các thuốc hạ acid uric máu ................................6 1.2. ENZYM XANTHIN OXIDASE ...........................................................8 1.2.1. Vai trò của xanthin oxidase trong tổng hợp acid uric .....................8 1.2.2. Vị trí, đặ điểm lý hó và đặ điểm cấu trúc ...................................8 1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzym xanthin oxidase .9 1.2.4. Một số phƣơng ph p x định hoạt độ của enzym xanthin oxidase ............................................................................................................................10 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC DƢỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO ...........11 1.3.1. C hƣớng nghiên cứu trên thế giới ..............................................11 1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ..........................................................14 Chƣơng 2. NGUY N VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................................................17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .........................................................................17 2.1.1. Mẫu nghi n ứu ..........................................................................17 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu..............................................................18 2.1.3. Thuố , hó hất .............................................................................19 2.1.4. M y mó , thiết ị, ụng ụ ............................................................19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................19 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU .......................................................20 2.3.1. Nguy n tắ .....................................................................................20 2.3.2. Chuẩn ị hó hất n thiết .....................................................20 2.3.3. Tiến hành .......................................................................................21 2.3.4. Phƣơng ph p x lý số liệu .............................................................23 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................24 3.1. KẾT QUẢ ............................................................................................24 3.1.1. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các mẫu ƣợc liệu, thực vật ......................................................................................24 3.1.2. Kết quả x định IC50 của các mẫu ƣợc liệu, thực vật tiềm n ng ............................................................................................................................39 3.2. BÀN LUẬN .........................................................................................41 3.2.1. Về kết quả sàng lọc .......................................................................41 3.2.2. Về kết quả ức chế xanthin oxidase của các cây thuốc tiềm n ng .46 KẾT LUẬN ...............................................................................................................50 ĐỀ XUẤT .................................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU BP dùng : Bộ phận dùng CCTT : Chƣ Chống NK : Chống nhiễm khuẩn ĐTĐ : Đ i th o đƣờng HA : Huyết áp HGPRT : Hypoxanthine-guanin phosphoribosyltransferase DMSO : Dimethyl sulfoxid Oxh : Oxy hóa PRPP : Phosphoribosyl pyrophosphatase TDKMM : Tác dụng không mong muốn VQG : Vƣờn quốc gia XO : Xanthin oxidase ó thông tin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng ...............................................21 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của các mẫu ƣợc liệu lên hoạt độ XO in vitro tại các nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml .................................................................................25 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của các mẫu thực vật lên hoạt độ XO in vitro tại các nồng độ 100µg/ml, 50µg/ml, 10 µg/ml ...................................................................................34 Bảng 3.3. Nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym xanthin oxidase (IC50) của các mẫu ƣợc liệu, thực vật tiềm n ng ....................................................................................39 DANH MỤC CÁC HÌNH ình 1.1. Qu tr nh h nh thành i uri trong ơ thể ..............................................3 Hình 1.2. Cấu trúc không gian của xanthin oxidase ...................................................9 Hình 2.1. Quy trình thí nghiệm đ nh gi t ụng ức chế xanthin oxidase của các mẫu th ......................................................................................................................22 1 ĐẶT VẤN ĐỀ T ng i uri m u, đặc biệt t ng i uri m u mạn tính là nguyên nhân và là yếu tố nguy ơ dẫn đến các bệnh lý nhƣ gút, t ng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh thận, bệnh đ i th o đƣờng typ II [51], [82], [100]. Trong đó, gút là bệnh lý rối loạn chuyển hóa, viêm khớp mạn tính phổ biến nhất và ó xu hƣớng ngày càng gi t ng. Các thuố điều trị t ng i uri m u theo y học hiện đại đều ó ơ hế rõ ràng, tác dụng nhanh và hiệu quả điều trị tƣơng đối tốt. Một trong những đí h t dụng ƣợc lý quan trọng của các thuốc hạ acid uric máu là xanthin oxidase, enzym then chốt trong on đƣờng sinh tổng hợp acid uric. Tuy nhiên, t ng i uri m u là bệnh lý rối loạn chuyển hóa nên bệnh nhân thƣờng phải dùng thuốc lâu dài. Trong khi đó, thuố tân ƣợ thƣờng có giá thành o và để lại cho bệnh nhân nhiều tác dụng không mong muốn. Vì vậy, việc tìm kiếm nguồn thuốc thay thế với hiệu quả điều trị tƣơng tự hoặ vƣợt trội hơn, đồng thời n toàn hơn thuố tân ƣợc đ ng ó là hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm phát triển. Việc tìm kiếm các hợp chất làm thuốc từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên luôn là hính s h ƣu ti n trong hiến lƣợc phát triển ngành Dƣợc ở nhiều nƣớc. Khai thác nguồn tài nguyên sinh học từ nguồn ƣợc liệu đƣợc s dụng theo kinh nghiệm trong nhân dân và sàng lọc tác dụng ƣợc lý của dịch chiết từ ƣợc liệu này là hƣớng tiếp cận phát hiện và phát triển các thuốc mới phục vụ điều trị [83]. Vốn là một đất nƣớ đƣợ thi n nhi n ƣu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có thảm thực vật vô ùng đ ạng và phong phú với nhiều loài hƣ đƣợc nghiên cứu về tác dụng sinh học, nền y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Dân gian s dụng rất nhiều các bài thuốc, vị thuố để điều trị các bệnh về xƣơng khớp nhƣ thống phong (bệnh gút theo y học cổ truyền), phong thấp... Cho đến nay đã ghi nhận đƣợ nƣớc ta có 3948 loài cây thuốc, thuộc 307 họ của 9 ngành thực vật bậ o ũng nhƣ ậc thấp (kể cả Nấm) [15]. Li n qu n đến tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro, trên thế giới đã ó nhiều nghiên cứu sàng lọc từ nguồn ƣợc liệu và các chất/nhóm chất phân lập từ ƣợc liệu đã đƣợc thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu khác nhau [21], [46], [56], 2 [71], [76], [91], [110], [116]. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu theo hƣớng này còn hạn chế. Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự đã sàng lọc đƣợc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của 96 ƣợc liệu thu hái từ 4 tỉnh miền Trung bộ và miền Nam (Phú Y n, Kh nh Hò , Lâm Đồng và An Giang) [85]. Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Dƣợc lực, Trƣờng Đại họ Dƣợc Hà Nội đã triển kh i đƣợ phƣơng ph p đ nh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro tr n đĩ UV 96 giếng Costar 3635 và áp dụng sàng lọc đƣợc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của 91 mẫu thực vật, ƣợc liệu thu hái ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam [11]. Phƣơng ph p này đã đƣợc triển khai với nhiều ƣu điểm nổi bật tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sàng lọc tiếp theo. Việ mở rộng th m đối tƣợng ƣợc liệu, thực vật đƣ vào sàng lọ để t m kiếm, ph t hiện thiết. V vậy, đề tài S g ọ loài ó hiệu quả hạ thu xanthin oxidase in vitro” đƣợ thự hiện với 1. Sàng lọ t ụng ứ Việt N i uri tốt là rất t ụ g ứ h mụ ti u ụ thể s u: hế x nthin oxi se in vitro ủ mẫu ƣợ liệu, thự vật (khoảng 200 loài đƣợ thu h i ở Việt N m. 2. X n định IC50 ủ các mẫu ƣợ liệu, thự vật tiềm n ng nhất. 3 Chƣơ g 1. TỔNG QUAN 1.1. TĂNG ACID URIC MÁU VÀ ĐÍCH TÁC DỤNG CỦA THUỐC 1.1.1. Si h tổ g hợp v hu ể h i uri Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của nu leo-protein ó hứ nhân purin (adenin, guanin) trong ơ thể ngƣời với sự th m gi ủ enzym: phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleoside phosphorylase, xanthin oxidase (XO) [36], [41] (H nh1.1 . Trong đó, ác base purin (adenin và guanin) là sản phẩm trung gian của quá trình thoái hóa các acid nucleic (ADN, ARN). Tiếp theo, adenin và guanin bị thủy phân giải phóng nhóm amin tạo thành hypoxanthin và x nthin, ƣới tác dụng của enzym xanthin oxidase hypoxanthin bị oxy hóa thành xanthin rồi thành acid uric [3]. nh . Qu tr nh h nh thành i uri trong ơ thể [41] 4 Ở h u hết loài động vật ó vú (trừ loài ngƣời và loài linh trƣởng , uối on đƣờng huyển hó purin ó th m uri se, một loại enzym ở g n ó v i trò huyển hó i uri thành ll ntoin, là ạng ễ t n hơn và đƣợ đào thải r ngoài theo thận [9], [40], [96]. A i uri đƣợ thải trừ qu r ngoài ơ thể theo h i on đƣờng: khoảng 2/3 lƣợng i uri tạo r mỗi ngày đƣợ thải trừ qu thận, 1/3 đƣợ thải trừ qu ruột [58], [63]. 1.1. . T g i uri u B nh thƣờng nồng độ i uri trong m u luôn đƣợ giữ ổn định ở mứ ƣới 7,0 mg/ l (420 mol/l đối với n m và 6,0 mg/ l (360 mol/l đối với nữ o ó sự ân ằng giữ qu tr nh tổng hợp và đào thải [12], [36]. Bất kỳ nguy n nhân nào làm mất ân ằng qu tr nh này (t ng tổng hợp hoặ giảm thải trừ đều làm t ng i uri trong m u. T ng i uri m u đƣợ x định khi nồng độ id uric máu vƣợt qu 7,0 mg/ l (420 mol/l đối với n m và 6,0 mg/ l (360 mol/l đối với nữ [12]. 2 Nguyên nhân gây tăng acid uric máu  Giảm đào thải acid uric qua thận - Giảm khả n ng ài xuất nhân, đặ i uri ở ống thận ti n ph t o nhiều nguy n iệt trong trƣờng hợp nghiện rƣợu [41], [63]. Loại này thƣờng ó tính hất gi đ nh, khởi ph t thƣờng o uống qu nhiều rƣợu. Đây là nhóm h y gặp nhất (90% trƣờng hợp [63]. - Giảm khả n ng ài xuất acid uric ở thận do s dụng thuốc hoặc suy thận dẫn đến rối loạn chứ n ng thận. Các thuố thƣờng gặp là aspirin liều thấp; phenylbutazone liều thấp; đ số các thuốc lợi tiểu dùng kéo dài (trừ nhóm spironol tone nhƣ thi zi e, furosemi e; thuố điều trị lao nhƣ eth m utol, pyrazinamind; các thuốc acid ethacrynic, acid nicotinic... [40], [99].  Tăng sản xuất acid uric - T ng tạo i uri nguy n ph t ( ẩm sinh) là nhóm nguy n nhân hiếm gặp ( ƣới 1% ; o rối loạn hoạt động enzym th m gi vào qu tr nh huyển hó 5 purin nhƣ t ng hoạt tính ủ PRPP và x nthin oxi se hoặ thiếu hụt một ph n h y toàn ph n HGPRT (enzym xú t ho phản ứng nghị h huyển i gu nyli và hypoxanthin thành xanthin) [12], [36], [41]. - T ng tạo nhân purin (đặ iệt i uri thứ ph t ( hiếm khoảng 10% : o n nhiều thứ thịt màu đỏ nhƣ hó, ò, gặp trong ệnh thiếu m u t n m u, ệnh ạ h ùng ho n ó ; hải sản...); o t ng huỷ tế bào, u (leucemia), ệnh đ u tủy xƣơng, hất gây độ tế bào trong điều trị ung thƣ; ệnh vẩy nến...[36], [41]. 1.1.2.2. Hậu quả của tăng acid uric máu  Tăng acid uric máu và bệnh gút Khi nồng độ acid uric trong huyết th nh o hơn nồng độ bão hòa dẫn tới tí h lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi. Sự lắng đọng của các hạt này ở các vị trí khác nhau gây ra các tổn thƣơng kh nh u. Khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi ph t ơn gút cấp; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch khớp, trong mô sụn và mô xƣơng sẽ dẫn đến bệnh xƣơng khớp mạn tính do gút; các vi tinh thể urat lắng đọng tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi [12], [40]. T ng i uri m u là yếu tố nguy ơ, là nguy n nhân ủ độ i uri m u àng o, thời gi n ị t ng mắ ệnh gút càng cao [128]. ệnh gút [40]. Nồng i uri m u àng kéo ài th nguy ơ  Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan G n đây, nhiều các nghiên cứu lâm sàng đã hỉ ra rằng t ng acid uri m u mạn tính làm t ng nguy ơ mắc bệnh thận, ệnh t ng huyết p, bệnh tim mạ h, ệnh tiểu đƣờng [51], [82], [96], [118]. Các nghiên cứu can thiệp g n đây ũng ung ấp bằng chứng cho thấy, giảm urat khi s dụng allopurinol có thể làm chậm tiến triển của suy thận mạn tính, bệnh tim mạch [40], [52], [96]. Nhƣ vậy, hạ ệnh lý kh i uri m u là mụ ti u điều trị quyết định trong ệnh gút và li n qu n tới t ng i uri . 6 1.1.3. Đí h t ụ g ủ thu hạ i uri H i ơ hế của các thuốc điều trị t ng u i uri m u hiện nay là ức chế xanthin oxidase hoặc gây thải trừ acid uric qu nƣớc tiểu. Ngoài ra, nhóm thuốc tiêu i uri ũng đ ng trong gi i đoạn th nghiệm lâm sàng, tuy nhiên nhóm thuốc này gặp phải những hạn chế nhất định n n hƣ đƣợc ứng dụng trong điều trị t ng i uric máu mạn tính. 1.1.3.1. Giảm tổng hợp acid uric thông qua ức chế enzym xanthin oxidase Allopurinol và fe uxost t là h i thuố điển h nh ó t đ ng đƣợ s ụng trong điều trị uy tr ụng ứ hế XO hiện ệnh gút mạn tính.  Allopurinol - Cơ chế tác dụng: Allopurinol t và ó thể t động nhƣ một hất ứ - Chỉ định: Allopurinol đƣợ s ệnh gút mạn tính và xuất tiền hất ủ thận hơn động nhƣ hất ứ hế ạnh tr nh ủ enzym hế không ạnh tr nh ở nồng độ ụng để hạ nồng độ trƣờng hợp t ng o [2], [92]. i uri m u trong điều trị i uri m u [2]. Thuố làm t ng ài i uri qu nƣớ tiểu n n ít gây sỏi thận và ơn đ u quặn thuố t ng đào thải i uri qu thận [2]. Vì vậy, thuố qu n trọng với những ệnh nhân không đ p ứng với ó v i trò thuố t ng đào thải i uri và ệnh nhân ó sỏi ur t [2], [23]. - Tác dụng không mong muốn: Vi m g n, tổn thƣơng thận, ị ứng/hội hứng qu mẫn và làm t ng độ tính ủ 6-mercaptopurin [2], [67].  Febuxostat Febuxostat là thuốc mới r đời sau allopurinol, g n đây đã l n lƣợt đƣợ Cơ quan quản lý thuốc châu Âu - EMEA và FDA phê duyệt để điều trị dài hạn t ng acid uric máu mạn tính trên bệnh nhân gút. So với allopurinol, febuxostat đã đƣợc chứng minh làm giảm ucid uric máu hiệu quả hơn trong ả th nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng [22]. 7 - Cơ chế : Fe uxost t hạ i uri theo ơ hế ứ hế không ạnh tr nh ủ enzym xanthin oxidase [42]. - Chỉ định : Febuxost t là lự họn thứ h i s u llopurinol khi mà những liệu ph p gây t ng thải trừ không thể s ụng đƣợ tr n những ệnh nhân mắ ệnh thận mạn tính, sỏi thận [100]. - Tác dụng không mong muốn : Gây rối loạn hứ n ng g n, đ u đ u, uồn nôn, hóng mặt; nguy ơ s ụng hƣ nhiều, ệnh tim mạ h [42]. Fe uxost t là thuố mới, kinh nghiệm TDKMM n tiếp tụ theo õi. 1.1.3 2 Tăng thải acid uric ở thận C thuố gây t ng thải tốt trong việ làm hạ i uri nhƣ pro ene i , sulfinpyr zon ó hiệu quả i uri m u, đặ iệt là giảm kí h thƣớ và số lƣợng hạt tophi [9]. Tuy nhi n, thuố tỏ r kém hiệu quả với ệnh nhân suy giảm hứ n ng thận và ó thể gây sỏi ur t và nhiều t ụng không mong muốn kh [100]. Hiện n y, nhóm thuố này không òn đƣợ s [2], [80], [97], ụng phổ iến tr n lâm sàng. 1.1.3.3. Tiêu acid uric H u hết loài động vật có vú, trừ on ngƣời và các loài linh trƣởng trong ơ thể đều có enzyme uricase, một loại enzym chuyển hóa acid uric thành allantoin dễ t n và đào thải tốt hơn [40], [97]. Vì vậy, truyền tĩnh mạ h uri se đã đƣợc chứng minh có tác dụng phân giải acid uric [90]. Đí h t ụng này mở r hƣớng điều trị mới cho những bệnh nhân không đ p ứng với các thuố điều trị t ng i uric máu mạn tính đ ng ó hiện nay. Rasburicase: là một uricase tái tổ hợp, đã đƣợc FDA cho phép s dụng để hạ acid uric ngắn ngày trên trên trẻ em mắc hội chứng phân giải khối u (tumour lysis syndrome) vào n m 2002 [115]. Tuy nhiên quá trình s dụng r s uri se kéo ài để đ p ứng yêu c u điều trị t ng i uri m u mạn tính bị hạn chế bởi tính kháng nguyên cao, t1/2 ngắn và khả n ng dung nạp kém. 8 PEGylated uricase: là một dạng dẫn chất củ uri se (đƣợc gắn thêm chuỗi polyethylen gly ol để làm giảm tính kháng nguyên và kéo dài thời gian bán thải hơn so với uricase [49]. 1.2. ENZYM XANTHIN OXIDASE 1.2.1. V i trò ủ x thi oxi se tro g tổ g hợp i uri Xanthin oxidase là một enzym có vai trò then chốt trong on đƣờng tạo ra i uri . C protein nhân purin đƣợc chuyển hóa thành hypoxanthin và xanthin, ƣới tác dụng xúc tác của enzym XO chúng đƣợc oxy hóa thành acid uric. Enzym XO có vai trò quan trọng trong qu tr nh điều hòa nồng độ acid uric máu, bất kì tác động nào ảnh hƣởng đến hoạt động củ XO ũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành acid uric [3], [20]. Vì vậy, enzym XO là một trong những đí h t ụng ƣợc lý chính mà các thuố điều trị gút đ ng hƣớng tới. 1.2.2. Vị trí, đặ điể ýh v đặ điể ấu trú 1.2.2.1. Nguồn gốc, phân bố Enzym XO đƣợ t m thấy ở nhiều loài động vật ó vú, him, ôn trùng và vi khuẩn [14]. Trong c loài động vật ó vú, enzym XO đƣợ phân ố rộng rãi trong mô nhƣng nồng độ trong h u hết o nhất là ở g n và ruột [25]. Ở ngƣời XO đƣợ t m thấy tế ào ủ ơ thể, tuy nhi n nó ó nhiều nhất trong tế ào g n và tế ào ruột [20]. Enzym XO dùng trong các nghiên ứu hiết xuất từ sữ bò là đặ hiệu nhất, đồng thời ũng ó thể hiết đƣợ từ g n huột, gà và từ tuyến vú ủ huột [54]. 1.2.2.2. Đặc điểm cấu trúc Xanthin oxi se là một protein ó khối lƣợng khoảng 300 kD , gồm 2 tiểu đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxy hó kh : một ph n phụ moly en, một FAD và hai Fe2S2 [20],[54]. Ph n phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu ơ li n kết cộng hóa trị với 2 nguyên t lƣu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên t oxy và 1 nguyên t lƣu huỳnh khác [54] (Hình 1.2). 9 A B Hình 1.2. Cấu trú không gi n ủ x nthin oxi se [92] (A: Cấu trúc không gian của xanthin oxidase, B: Phần phụ molybden) 1.2.3. C u t ả h hƣở g đ hoạt độ g ủ e z xanthin oxidase - Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ ơ hất xanthin t ng th tố độ ủ phản ứng huyển hó sẽ t ng, lƣợng nào đó, enzym sẽ ão hò i uri tạo r sẽ àng nhiều. Tuy nhi n, đến một mứ ơ hất và tố độ phản ứng không t ng thêm [3]. - Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym t ng l n, tố độ phản ứng ũng t ng. Tuy nhi n, khi nồng độ enzym t ng đến một mứ nhất định, sản phẩm tạo r qu nhiều sẽ t động vào trung tâm ị lập thể ủ enzym, phản ứng ão hò và tố độ phản ứng sẽ không t ng l n nữ [3]. - Nhiệt độ: Khi t ng nhiệt độ l n 100C, tố độ phản ứng sẽ t ng l n 2 l n. Tuy nhi n, đến một nhiệt độ qu o, enzym sẽ ị iến tính o ị ph vỡ li n kết trong ấu trú . Theo một số nghi n ứu, nhiệt độ tối ƣu ho x nthin oxi se từ sữ ò là 100C và ho x nthin oxi se từ sữ là 200C [44], [65]. Nhiệt độ ũng là một yếu tố qu n trọng trong qu tr nh ảo quản enzym. X nthin oxi se ảo quản ở nhiệt độ 40C sẽ không ị giảm hoạt tính trong vòng 6 th ng. - pH: Mỗi enzym ó một gi trị pH phù hợp nhất ho hoạt động ủ enzym đó. Với x nthin oxi se, pH thí h hợp từ 7,5 – 8,0 [65]. 10 - Các yếu tố khác: một số ion kim loại nặng (Ví ụ : Hg2+, Ag+… , một số hất ứ hế (purin, pyrimi in, một số ị h hiết ƣợ liệu… ũng ó thể làm giảm hoạt tính ủ enzym [3], [14]. 1.2.4. Một s phƣơ g ph p x đị h hoạt độ ủ e z x thi oxi se  Phương pháp đo quang - Phƣơng ph p đo qu ng ự tr n định lƣợng oxy hó x nthin ƣới xú t ủ XO theo phản ứng : Xanthin + H2O + O2→ Lƣợng i uri tạo thành từ qu tr nh Acid uric + H2O2 i uri tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym và đƣợ định lƣợng ằng phƣơng ph p đo qu ng ở ƣớ sóng 290nm [89]. - Phƣơng ph p đo qu ng ự tr n hất ABTS (2,2’-azino-di (3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonate) Nguyên tắc chung : Hoạt độ x nthin oxi se đƣợ x ABTS ạng oxy hó tạo thành theo phản ứng: → Hypoxanthin + 2H2O + 2O2 Acid uric + O2 H2O2 + ATBSred định thông qu lƣợng → Acid uric + 2H2O2 Allantonin + H2O2 + CO2 → ATBSOX + 2H2O Hoạt độ ủ x nthin oxi se đƣợ x định thông qu việ đo độ hấp thụ ủ ATBSox tạo thành s u 10 phút ở ƣớ sóng 410nm [79].  Phương pháp đo áp X nthin oxi se là một hất nhƣờng ele tron n n ó thể x enzym thông qu việ đ nh gi sự kh ủ định hoạt độ hất nhận ele tron phù hợp nhƣ oxy, x nh methylen và yto rom C. V vậy, ó thể x định hoạt độ ủ enzym thông qua tỷ lệ oxy ti u thụ với ơ hất x nthin ằng phƣơng ph p đo p ở 370C [39]. 11  Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang Nguyên tắc : ự tr n phản ứng oxy hó 2-amino-4-hydroxypteridin (AHP) thành isox nthopterin (IXP ƣới sự xú t ủ x nthin oxi se. Lƣợng IXP tạo r tỷ lệ với hoạt độ x nthin oxi se đƣợ phân t h qu ột sắ ký và đƣợ ph t hiện, định lƣợng ằng ete tor huỳnh qu ng với ƣớ sóng kí h thí h và ƣớ sóng ph t hiện tƣơng ứng là 343nm và 410nm [103]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC DƢỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO Xanthin oxidase là một trong những đí h t thuố hạ i uri hƣớng tới. Nghi n ứu sàng lọ in vitro là ƣớ đ u để t m kiếm và ph t hiện t ụng ƣợ lý qu n trọng mà ƣợ liệu ó tiềm n ng, từ đó ó thể nghi n ứu theo định hƣớng ụng sinh họ và đ nh gi sâu hơn khẳng định t tr n động vật thự nghiệm ủ ụng tr n mô h nh gây ệnh ƣợ liệu ó khả n ng ứ hế x nthin oxidase mạnh nhất. Từ đó, tạo tiền đề ho việ nghi n ứu và ph t triển thuố mới. 1.3.1. C hƣớ g ghiê Li n qu n đến t ứu trê th giới ụng ứ nghi n ứu sàng lọ hế x nthin oxi se in vitro, tr n thế giới đã ó nhiều ƣợ liệu, nhóm hất/hoạt hất phân lập từ ƣợ liệu, hủ yếu theo 3 hƣớng tiếp ận hính :  Tiếp cận sàng lọc dựa trên kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong nhân dân hoặc nền Y học cổ truyền của một số nước Hƣớng tiếp cận này khá phổ biến và đƣợc thực hiện ở nhiều nƣớc trên thế giới. N m 1999, dự tr n kinh nghiệm s ụng ƣợ liệu trong điều trị gút và triệu hứng li n qu n ủ thổ ân Bắ M , Owen và ộng sự đã tiến hành sàng lọ khả n ng ứ hế XO in vitro ủ 26 loài thuộ 18 họ thự vật. Kết quả ho thấy, ở mứ liều 100 g/ml, ó 20% số loài đƣợ th ủ enzym, trong đó Larix laricina ó t ót ụng ứ hế tr n 50% hoạt tính ụng mạnh nhất (86,33% [91]. 12 N m 2000, Kong và cộng sự đã sàng lọ 122 ƣợ liệu ùng trong Y họ Cổ truyền Trung Quố và ph t hiện 69 ị h hiết meth nol ó thể hiện tác dụng ức chế enzym XO (56,56%), trong đó ó 29 ịch chiết ức chế trên 50% hoạt tính enzym ở nồng độ 100 g/ml (23,77%); 40 ị h hiết nƣớ ót ụng ứ hế XO (32,79%), trong đó ó 13 ịch chiết ức chế tr n 50% ở nồng độ 100 g/ml (9,84%). Ở nồng độ 50 µg/ml, có 58 dịch chiết methanol (47,54%), 24 dịch chiết nƣớc thể hiện tác dụng ức chế (19,67%); trong đó 15 dịch chiết methanol (47,54%) và 2 dịch chiết nƣớc ức chế XO trên 50% (1,64%). Dịch chiết nƣớc của Polygonum cuspidatum ó t ụng mạnh nhất (IC50 = 38 µg/ml), tuy nhiên vẫn yếu hơn nhiều so với allopurinol (IC50 = 1,06 µg/ml) [71]. N m 2001, nhà kho họ Austr li đã nghiên cứu trên 28 dịch chiết từ 17 loài thực vật bản đị đƣợc nhân dân s dụng với tác dụng chống viêm. Ở nồng độ 100 µg/ml, có 9 loài thể hiện tác dụng ức chế XO; ở nồng độ 50 µg/ml có 4 loài thể hiện tác dụng ức chế XO và phát hiện đƣợ ị h hiết Clerodendrum floribundum (Verbenaceae), Eremophila maculata Ker Gawler (Myoporaceae) và Stemodia Grossa Benth. (Scrophulariaceae), Stemodia grossa ó t ụng mạnh nhất với IC50 < 50 µg/ml [110]. N m 2007, nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế XO đƣợc tiến hành với 18 dịch chiết nƣớc, methanol và hỗn hợp nƣớc - methanol từ 6 ƣợc liệu đƣợc ngƣời dân bản địa Ấn Độ s dụng theo kinh nghiệm để điều trị bệnh gút và các triệu chứng liên quan. Kết quả cho thấy 14 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế XO ở nồng độ 100 µg/ml, trong đó 10 ịch chiết có tác dụng ức chế lớn hơn 50% hoạt tính XO và IC50 < 100 µg/ml. Bốn dịch chiết methanol thể hiện tác dụng ức chế XO in vitro mạnh nhất: Coccinia grandis (IC50 = 29,79 µg/ml), Datura metel (IC50 = 76,75 µg/ml), Strychnos nux-vomica (IC50 = 6,8 µg/ml) và Vitex negundo (IC50 = 78,75 g/ml đƣợ đƣ vào đ nh gi tác dụng hạ acid uric in vivo trên mô hình gây t ng i uri m u ấp bằng kali oxonat [116]. N m 2010, H vlik và ộng sự đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro của 84 dịch chiết ethanol và methylen clorid-methanol từ 27
- Xem thêm -