Tài liệu Sàng lọc ảo hợp chất ức chế enzym tyrosinase từ hợp chất thiên nhiên việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG SÀNG LỌC ẢO HỢP CHẤT ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE TỪ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG SÀNG LỌC ẢO HỢP CHẤT ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE TỪ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Thu Hường TS. Phạm Thế Hải Hà Nội – 2017 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thu Hường - Giảng viên Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, TS. Phạm Thế Hải - Giảng viên Bộ môn Hóa dược, Trường đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Ninh Bảo Yến đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng như xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô tại Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường. Tôi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hương Giang Bảng ký hiệu, chữ viết tắt Asn Asparagin CSDL Cơ sở dữ liệu DHI 5,6-dihydroxyindol DHICA Acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic Glu Acid glutamic HC Hợp chất His Histidin HQ Hydroquinon L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanin Phel Phenylalanin PPO Polyphenol Oxidase QSAR Quantitative Structure-Activity Relationships TTHĐ Trung tâm hoạt động TSPT Tham số phân tử Val Valin Danh mục các bảng Bảng 1: Các phân nhóm chính trong CSDL .............................................................14 Bảng 2: Ái lực liên kết với đích của 21 hợp chất được dự đoán là có khả năng ức chế tyrosinase ............................................................................................................22 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1: Quá trình oxy hóa phenol thông qua enzym tyrosinase ................................7 Hình 2: Các dạng oxi hóa của enzym tyrosinase........................................................7 Hình 3: Trung tâm hoạt động của enzym tyrosinase tương tác với Tropolon ...........8 Hình 4: Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin .......................................9 Hình 5: Mô phỏng hệ thống sàng lọc ảo hợp chất ức chế enzym tyrosinase ...........16 Hình 6: Giá trị Tc của các chất trong CSDL tương ứng với 12 chất mẫu.................19 Hình 7: Khoảng phân bố của giá trị Tc max ................................................................19 Hình 8: Phân bố giá trị Tc max theo từng chất mẫu ....................................................20 Hình 9: Cấu trúc VNPD_ID929 được vẽ lại bằng TOMOCOMD-CARDD ...........20 Hình 10: Phân bố các nhóm chất ..............................................................................21 Hình 11: Phân bố năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của enzym ............21 Hình 12: Mô phỏng cấu dạng của phức hợp trung tâm hoạt động enzym với VNPD_ID929 ............................................................................................................27 Hình 13: Mô phỏng cấu dạng của phức hợp trung tâm hoạt động enzym với VNPD_ID722 ............................................................................................................28 Hình 14: Mô phỏng cấu dạng của phức hợp trung tâm hoạt động enzym với VNPD_ID889 ............................................................................................................28 Hình 15: Mô phỏng cấu dạng của phức hợp trung tâm hoạt động enzym với VNPD_ID723 ............................................................................................................29 Hình 16: Mô phỏng cấu dạng của phức hợp trung tâm hoạt động enzym với VNPD_ID1157 ..........................................................................................................30 MỤC LỤC Lời cảm ơn Bảng ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................ 2 1.1. Tổng quan về sàng lọc ảo ................................................................................... 2 1.1.1. Khái niệm ...................................................................................................2 1.1.2. Quy trình sàng lọc ảo..................................................................................2 1.1.3. Các kỹ thuật sàng lọc ảo .............................................................................2 1.2. Tổng quan về enzym tyrosinase ........................................................................ 6 1.2.1. Khái niệm enzym tyrosinase ......................................................................6 1.2.2. Trung tâm hoạt động của enzym tyrosinase ...............................................7 1.2.3. Vai trò của tyrosinase .................................................................................8 1.2.4. Các chất ức chế tyrosinase .........................................................................9 1.3. Tổng quan về hợp chất thiên nhiên Việt Nam ............................................... 12 1.3.1. Khái niệm hợp chất thiên nhiên ...............................................................12 1.3.2. Vai trò của hợp chất thiên nhiên trong nghiên cứu và phát triển thuốc ...12 1.3.3. Tiềm năng của hơp chất thiên nhiên Việt Nam ........................................13 Chương 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 14 2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................ 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................14 2.1.2. Nguyên liệu ..............................................................................................14 2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................15 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 15 2.2.1. Tìm kiếm đồng dạng.................................................................................16 2.2.2. Mô hình QSAR .........................................................................................17 2.2.3. Docking ....................................................................................................17 2.2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................18 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 19 3.1. Kết quả tìm kiếm đồng dạng ........................................................................... 19 3.2. Kết quả mô hình QSAR ................................................................................... 20 3.3. Kết quả Docking ............................................................................................... 21 3.4. Bàn luận ............................................................................................................ 23 3.4.1. Về phương pháp sàng lọc ảo ....................................................................23 3.4.2. Về kết quả sàng lọc ảo ..............................................................................26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 31 Tài liệu tham khảo Phụ lục MỞ ĐẦU Hiện nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề về thẩm mỹ, làm đẹp của con người càng được chú ý hơn đặc biệt là vấn đề chăm sóc da. Màu da của con người được quyết định bởi nhiều yếu tố, trong đó, quan trọng nhất là sự sản xuất và phân bố của sắc tố melanin bởi tế bào biểu bì tạo sắc tố [68]. Khi tế bào biểu bì tạo sắc tố hoạt động mạnh hơn sẽ sản sinh ra nhiều melanin và phân tán mạnh hơn, gây ra hiện tượng nám da, sạm da, tàn nhang… và ung thư da [22]. Melanin được hình thành trong hạt sắc tố melanosom bởi hoạt động của enzym tyrosinase [63]. Vì vậy, hiện nay nhiều sản phẩm làm sáng da, chống nám sử dụng hoạt chất là các chất ức chế tyrosinase. Tuy nhiên, các chất có hoạt tính ức chế tyrosinase đang được sử dụng hiện nay như Hydroquinon (HQ), Acid Kojic và Arbutin lại có nhiều vấn đề liên quan đến độ an toàn và hiệu quả [17, 81]. Do vậy mà việc tìm kiếm các hợp chất mới ức chế tyrosinase có độ an toàn và hiệu quả cao hơn đặc biệt là từ các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên là một việc làm hết sức thiết thực và cấp bách. Phát hiện và tối ưu hóa chất dẫn đường là một khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc hiện đại. Lâu nay, các nghiên cứu này chủ yếu dựa vào phương pháp thực nghiệm “thử và lỗi” với nhược điểm là tốn thời gian, tiền bạc và cho hiệu quả thấp. Các phương pháp trợ giúp bởi máy tính (in silico) đã giúp ích nhiều cho việc phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học ngay cả trước khi chúng được tổng hợp hay phân lập thông qua quá trình sàng lọc ảo. Sàng lọc ảo không những bổ sung cho các sàng lọc thật mà còn giúp định hướng quá trình tổng hợp/phân lập các chất. Sàng lọc ảo tương đối rẻ, nhanh, cho phép làm việc với số lượng lớn lên tới hàng triệu hợp chất, điều không thể làm được trong các mô hình thực nghiệm. Bên cạnh đó, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú với hàng nghìn hợp chất đã được phân lập và tổng hợp các thông tin liên quan lại thành một cơ sở dữ liệu (CSDL) cung cấp các thông tin đầu vào hữu ích cho việc sàng lọc ảo. Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có bài báo nào công bố về một quy trình sàng lọc ảo để tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase từ CSDL này. Do đó, việc sàng lọc CSDL các hợp chất phân lập từ dược liệu sẽ đóng góp nhiều cho quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc làm trắng da, chống nám tại Việt Nam. Trên cơ sở đó, đề tài “Sàng lọc ảo hợp chất ức chế enzym Tyrosinase từ hợp chất thiên nhiên Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu: Phát hiện được các hợp chất có khả năng ức chế tyrosinase mạnh thông qua sàng lọc ảo các hợp chất phân lập từ thảo dược Việt Nam. 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về sàng lọc ảo 1.1.1. Khái niệm Các khái niệm về sàng lọc ảo (virtual screening) xuất hiện vào những năm 60 của thế kỷ XX với các mô hình của Hansch [28]. Thế nhưng, chỉ từ năm 1990 thì lĩnh vực này mới có nhiều bước tiến và từ đó đến nay, ngày càng phát triển mạnh mẽ [41]. Sàng lọc ảo đề cập đến một loạt các kỹ thuật in silico (các kỹ thuật được thự hiện với sự trợ giúp của máy tính) được sử dụng để sàng lọc các CSDL hợp chất lớn nhằm lựa chọn một số lượng nhỏ hơn cho thử nghiệm sinh học. Mô hình sàng lọc ảo không những bổ sung cho các mô hình thực nghiệm mà còn giúp định hướng quá trình tổng hợp/phân lập các chất. Ngoài ra sau khi được xây dựng, việc sử dụng các mô hình này tương đối rẻ (tiết kiệm nguyên liệu thử), nhanh và cho phép làm việc với số lượng lớn lên tới hàng triệu hợp chất, một điều không thể làm được trong các mô hình thực nghiệm. 1.1.2. Quy trình sàng lọc ảo Quá trình sàng lọc ảo gồm 5 bước như sau: 1) Lựa chọn đối tượng sàng lọc 2) Lựa chọn kỹ thuật 3) Sắp xếp các kỹ thuật theo thứ tự phù hợp 4) Sàng lọc 5) Phân tích kết quả. 1.1.3. Các kỹ thuật sàng lọc ảo Các kỹ thuật sàng lọc ảo hiện nay được phân vào 2 nhóm chính là sàng lọc ảo dựa trên phối tử (Ligand-based Virtual Screening) và sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-based Virtual Screening). Sàng lọc ảo dựa trên phối tử được thực hiện trong trường hợp không có cấu trúc 3D của protein, chỉ có cấu trúc của phối tử. Các kỹ thuật có thể sử dụng lúc này là kỹ thuật xây dựng phần cấu trúc mang hoạt tính (pharmacophore), kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng (similarity searching), QSAR. Trong trường hợp có cả cấu trúc 3D của protein và cấu trúc của phối tử, kỹ thuật sàng lọc ảo dựa vào cấu trúc sẽ được áp dụng, sử dụng kỹ thuật docking [47]. Hệ thống sàng lọc ảo được trợ giúp bởi máy tính gồm nhiều phễu lọc khác nhau, mỗi phễu lọc sử dụng một kỹ thuật sàng lọc khác nhau, được sắp xếp tuần tự hợp lý dựa vào thời gian mà máy tính cần cho mỗi thuật toán và sự phức tạp của thông tin đầu vào. Nghiên cứu sử dụng kết hợp 3 phễu lọc: Tìm kiếm đồng dạng, Mô hình QSAR và Kỹ thuật docking. 2 1.1.3.1. Tổng quan về tìm kiếm đồng dạng a. Khái quát về tìm kiếm đồng dạng Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng (similarity searching) là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc tương tự với hợp chất mẫu (reference) trên cơ sở dữ liệu về cấu trúc của các hợp chất. Kỹ thuật được thực hiện dựa trên nguyên lý tính chất giống nhau, như vậy những phân tử có cấu trúc giống nhau được hy vọng có tính chất hoặc hoạt tính sinh học giống nhau [40]. Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng được đưa vào sử dụng rộng rãi kể từ thập niên 80, và được chứng minh là rất hữu ích trong lĩnh vực dược phẩm. Hiện nay, phương pháp tìm kiếm đồng dạng đã được xây dựng bởi nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Sàng lọc ảo sử dụng kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng có thể tiến hành một cách nhanh chóng, do đó, kỹ thuật này được sử dụng nhiều để sàng lọc các cơ sở dữ liệu lớn [70]. Hai yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình tìm kiếm đồng dạng là các tham số phân tử đặc trưng cho các chất và thông số sử dụng để thiết lập mối liên hệ so sánh giữa cặp phân tử (hệ số tương đồng). Sau khi so sánh có thể sắp xếp các hợp chất trong CSDL theo thứ tự giảm dần về hệ số tương đồng so với các hợp chất mẫu. Khi có được danh sách sắp xếp này, người nghiên cứu sử dụng một ngưỡng (cut-off) để lựa chọn tập hợp các hợp chất nằm trên cùng danh sách [30]. Tham số phân tử là giá trị đại diện cho mô tả phân tử. Các mô tả phân tử thường được định nghĩa dựa vào chiều của chúng. Mô tả phân tử 1 chiều là các đặc tính như khối lượng phân tử, số lượng liên kết, đếm các mảnh cấu trúc. Mô tả phân tử 2 chiều là mô tả biểu diễn các cấu trúc theo kích thước, độ phân nhánh và hình dạng tổng thể, trong khi 3 chiều sử dụng các thông tin tử cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử. Mô tả phân tử được sử dụng thường xuyên nhất là mô tả phân tử 2D, là mô tả nhị phân, mã hóa sự có mặt hoặc không của các mảnh cấu trúc [80]. Có nhiều hệ số được xây dựng để biểu diễn sự giống nhau giữa một cặp cấu trúc, chẳng hạn như hệ số Tanimoto/Jaccard, hệ số Cosine/ Ochiai, hệ số Dice, hệ số Fossum, hệ số Simpson, hệ số Pearson/Stile, khoảng cách Euclide, khoảng cách Hamming, khoảng cách Soergel, khoảng cách Manhattan. Hệ số Tanimoto được sử dụng rộng rãi nhất cho các dữ liệu nhị phân. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hệ số này cho kết quả tốt hơn so với nhiều hệ số khác [79]. 3 b. Quy trình tìm kiếm đồng dạng Quá trình tìm kiếm đồng dạng gồm các bước chính sau: 1) Tính toán tham số phân tử đặc trưng cho hợp chất, 2) Tính toán hệ số tương đồng, 3) Sắp xếp các chất theo chiều giảm dần hệ số tương đồng, 4) Chọn ngưỡng. 1.1.3.2. Tổng quan về các mô hình QSAR a. Khái quát về mô hình QSAR Mô hình QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) là mô hình biểu thị mối liên hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất. Mô hình QSAR được xây dựng dựa trên giả thuyết cấu trúc của một phân tử phải chứa những đặc điểm cấu trúc chịu trách nhiệm cho tính chất hóa học, vật lý, sinh học. Mô hình QSAR cho phép dự đoán tính chất của một phân tử mới dựa trên các hợp chất tương tự có các tính chất đã được kiểm chứng. Mô hình QSAR được biểu diễn dưới dạng một phương trình toán học (Phương trình 1). Để có thể xây dựng được các mô hình này thì cả cấu trúc và hoạt tính đều phải được định lượng hóa. Các cấu trúc được định lượng thông qua các tham số phân tử (biến x). Các tham số phân tử là kết quả của một quá trình toán học chuyển đổi các thông tin trong cấu trúc phân tử thành một số đặc trưng cho cấu trúc phân tử ấy. Hoạt tính được sử dụng có thể là hoạt tính hoá học hay hoạt tính sinh học (biến Y) được đánh giá bằng các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm. Một số đại lượng hoạt tính sinh học thường được dùng như: IC50 nồng độ ức chế 50% hoạt tính; MIC (Minimum Inhibitory Concentration): nồng độ ức chế tối thiểu; MBC (Minimum Bactericidal Concentration): nồng độ diệt khuẩn tối thiểu; EC50 (Effective Concentration): nồng độ 50% tác dụng tối đa; KI: Hằng số ức chế... Phương trình 1: 𝑌 = 𝑓1 (𝑥 ) + 𝑓2 (𝑥 ) + ⋯ + 𝑓𝑛 (𝑥 1 2 𝑛) Trong đó: Y: Biến đáp ứng (mang giá trị biểu thị tác dụng sinh học) x1, x2,…xn: Các tham số đặc trưng cho cấu trúc f1, f2,…fn: Các thuật toán thể hiện trọng số của tham số phân tử x, được tính toán bằng các phần mềm phân tích thống kê sử dụng kỹ thuật xác suất thống kê hay trí tuệ nhân tạo 4 b. Quy trình xây dựng mô hình QSAR Các bước để xây dựng mô hình QSAR [76] gồm: 1) Xây dựng cơ sở dữ liệu; 2) Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc; 3) Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử và các giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính; 4) Đánh giá mô hình; 5) Giải thích các kết quả và sử dụng mô hình trong quá trình sàng lọc ảo. c. Hệ thống phân loại kếp hợp các mô hình QSAR Dieterich đã nghiên cứu kết luận là một hệ thống phân loại phối hợp thường tốt hơn việc sử dụng các mô hình đơn [18]. Sự thành công của các hệ thống phân loại kết hợp (Multiple classifier system) phụ thuộc vào hai yếu tố là sự đa dạng của các mô hình đơn để kết hợp và cách kết hợp các đầu ra [54]. Có nhiều cách để tạo nên sự đa dạng của các mô hình đơn. Trong các nghiên cứu của mình, Kuncheva trình bày 4 cấp để tạo nên sự đa dạng của các mô hình đơn [54]. Cấp độ 1 là thay đổi tập huấn luyện (training set). Cấp độ 2 là thay đổi tập hợp của các biến độc lập (independent variables). Các biến độc lập dùng để xây dựng các mô hình QSAR là các tham số phân tử khác nhau đặc trưng cho cấu trúc. Cấp độ 3, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để xây dựng các mô hình đơn. Cấp độ cuối cùng là cách kết hợp các mô hình đơn. Kuncheva và Whitaker đã tổng kết 10 cách để định lượng sự đa dạng giữa các mô hình đơn sử dụng các hệ số đa dạng. Có rất nhiều cách kết hợp các đầu ra như: Biểu quyết đa số phiếu [8], Biểu quyết với trọng số [54], Bagging (Boostrap AGGregatING) [8], Boosting [7], Stacking [8]. Mỗi cách kết hợp đầu ra sẽ cho kết quả với độ chính xác khác nhau. 1.1.1.4. Tổng quan về kỹ thuật docking a. Khái quát về docking Docking là phương pháp đưa cấu trúc của một chất (dạng cấu trúc không gian 3 chiều) vào một trung tâm tương tác của mục tiêu phân tử (đích tác dụng của thuốc) và tính toán các giá trị tương tác để đánh giá khả năng tương tác của chất đó với mục tiêu phân tử. Mục đích của docking là xác định một cấu dạng tối ưu nhất cho phối tử (phân tử hay anion liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động được gọi là phối tử) và dự đoán chính xác hoạt động của phối tử để năng lượng tự do của phức hợp mục tiêu phân tử - phối tử là nhỏ nhất [51]. 5 Khi cơ chất gắn lên một phân tử protein, hai điểm cần chú ý là sự phù hợp về hình dạng, kích thước và năng lượng tương tác giữa nó với protein. Sự phù hợp về hình dạng tương tự như cơ chế chìa khoá - ổ khoá nhưng trong thực tế, cả cơ chất và protein đều có thể thay đổi cấu hình, đặc biệt protein là phân tử lớn và có cấu trúc mềm dẻo. Quá trình này trong thực tế phức tạp hơn. Ngoài yêu cầu phù hợp về hình dạng, kích thước, giữa cơ chất và enzym còn có những tương tác khác như van der Waals, tương tác tĩnh điện, trong nhiều trường hợp còn có tương tác hoá học. Nhưng do protein thường có kích thước lớn và mềm dẻo, rất khó khảo sát hết tất cả khả năng có thể nên trong docking, phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng (rigid), cơ chất chuyển động tương đối so với protein và thay đổi cấu hình. Một số phần mềm docking cũng cho phép thay đổi cấu hình trên một số amino acid. Hiện nay, có rất nhiều phần mềm được sử dụng để docking: AutoDock [3], ICM-Docking [35], MOE (Molecular Operating Environment) [59], SwissDock [73]... Có 2 cách tiếp cận trong phương pháp docking: docking cơ học và docking tự động [64]. Docking cơ học trong trường hợp đã biết các nhóm liên kết của phối tử và vị trí liên kết của mục tiêu. Sử dụng một số chương trình cho phép phối tử chuyển động trong vị trí liến kết và cố gắng lắp ghép chúng lại với nhau một cách phù hợp nhất ở trạng thái cứng. Docking tự động được tiến hành nhờ sử dụng các phần mềm tự động docking. Các chương trình này sẽ tự động quyết định việc làm thế nào để dock phối tử vào vị trí liên kết. Một chương trình docking gồm 2 phần chính: thuật toán tìm kiếm cấu dạng, quay và dịch chuyển của phân tử trong vùng gắn và thuật toán để đánh giá sự phù hợp của phối tử và receptor hoặc ái lực gắn giữa chúng. Docking yêu cầu thông tin 3D của phân tử và hình dáng 3D của protein đích. Để tìm cấu hình phù hợp nhất cần liên hệ không gian cấu hình với các giá trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm. b. Quy trình docking Quy trình docking gồm 4 bước cơ bản: 1) Chuẩn bị protein; 2) Chuẩn bị cấu tử; 3) Mô phỏng docking; 4) Giải thích kết quả. 1.2. Tổng quan về enzym tyrosinase 1.2.1. Khái niệm enzym tyrosinase Tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay còn gọi là enzym polyphenol oxidase (PPO), là một enzym monooxygenase có chứa đồng tham gia vào hai phản ứng riêng biệt 6 của quá trình chuyển hóa melanin; một là hydroxyl hóa monophenol thành Odiphenol, hai là oxi hóa O-diphenol thành O-quinon (Hình 1) [9, 48]; sau đó, Oquinon tham gia một loạt các phản ứng để tạo thành melanin. Hình 1: Quá trình oxy hóa phenol thông qua enzym tyrosinase Enzym này được phân bố rộng rãi trong nấm, động vật và thực vật, nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành sắc tố. Enzym tyrosinase có thể tồn tại ở 3 dạng là: oxy, deoxy, met-tyrosinase được biểu diễn qua sơ đồ trong Hình 2 [10, 45, 49]. Cả dạng met-tyrosinase và dạng oxy-tyrosinase đều có hoạt tính diphenolase, trong khi chỉ có dạng oxy-tyrosinase là có hoạt tính monophenolase. Dạng deoxytyrosinase là dạng yếu, không ổn định; phản ứng với oxy để tạo thành dạng oxytyrosinase. Hình 2: Các dạng oxi hóa của enzym tyrosinase 1.2.2. Trung tâm hoạt động của enzym tyrosinase Việc phân tích về trung tâm hoạt động là cần thiết cho quá trình xác định hợp chất ức chế enzym tyrosinae. Cấu trúc tinh thể tia X của enzym được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (ID: 2Y9X). Trung tâm hoạt động gồm có túi enzym và 2 nguyên tử đồng nằm ở đáy túi, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của enzym. Mỗi 7 nguyên tử đồng tạo liên kết phối trí với 3 phân tử histamin. Miệng túi được hình thành từ các chuỗi acid amin như Val283, Phel264, His244, Val248, Asn260… (Hình 3) [36]. Hình 3: Trung tâm hoạt động của enzym tyrosinase tương tác với Tropolon Như vậy, để một cấu tử thể hiện được vai trò ức chế enzym tyrosinase, nó cần phải chui được vào túi enzym của trung tâm hoạt động và khóa được ion Cu2+ ở đáy túi enzym [83]. 1.2.3. Vai trò của tyrosinase Sắc tố là một trong những đặc điểm kiểu hình rõ ràng nhất trong thế giới tự nhiên. Trong các tế bào động vật hoặc thực vật, một sắc tố được định nghĩa là bất kỳ chất tạo màu do chúng phản xạ và hấp thụ một số sóng ánh sáng đặc hiệu [57]. Trong các sắc tố sinh học đó, melanin (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là đen) được phân bố rộng rãi nhất và được tìm thấy trong suốt quá trình phát sinh loài, từ các vi sinh vật cho đến động vật, có cả con người [66]. Ở người, melanin được tìm thấy chủ yếu trong da, tóc, võng mạc [25]. Melanin được tiết ra bởi tế bào sắc tố phân bố ở lớp đáy của biểu bì. Vai trò của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia tử ngoại, đặc biệt là tia cực tím B bằng cách hấp thụ và tán xạ ánh sáng mặt trời và loại bỏ các gốc oxy hóa tự do. Các rối loạn khác nhau ở da là kết quả của sự tích tụ quá mức sắc tố ở biểu bì. Tăng sắc tố có thể do tăng tế bào tạo sắc tố hoặc do tăng hoạt động của các enzym hình thành sắc tố. Các tế bào biểu bì tạo sắc tố của động vật có vú có thể sản xuất hai loại melanin là eumelanin và pheomelanin. Eumelanin có màu từ nâu đến đen, không tan trong hầu hết các dung môi, liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị. Pheomelanin có màu từ vàng đến đỏ, có bộ khung được tạo bởi các tiểu đơn vị là các benzothiazin và cũng liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng 8 hóa trị. Tỷ lệ về số lượng và mật độ của hai melanin này sẽ quyết định màu sắc của da, mắt và tóc [78]. Con đường hình thành sắc tố melanin được tóm tắt trong Hình 4 [49, 65]. Bước đầu tiên và cũng là bước bắt buộc trong quá trình hình thành sắc tố là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon. Đây là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp tyrosin do chuỗi phản ứng còn lại có thể tự diễn ra tại một giá trị pH sinh lý nhất định. Dopaquinon sinh ra được chuyển thành leukodopachrom, sau đó chuyển thành dopachrom. Cuối cùng eumelanin được hình thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ các sản phẩm chuyển hóa của dopachrom là 5,6-dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA). Trong trường hợp có sự có mặt của cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển hóa thành cysteyldopa hoặc glutathionyldopa. Cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin [12, 49]. Như vậy, tyrosinase tham gia vào phản ứng đầu của quá trình hình thành sắc tố da melanin. Chính vì thế mà các chất ức chế tyrosinase đã và đang được sử dụng rất rộng trong điều trị các bệnh tăng sắc tố và trong mỹ phẩm như một yếu tố làm trắng da. Hình 4: Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin 1.2.4. Các chất ức chế tyrosinase 9 Tyrosinase đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin, do đó ức chế enzym này làm giảm hình thành sắc tố da [56]. Vì thế việc tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase ngày càng trở nên quan trọng trong các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm sử dụng để ngăn ngừa và điều trị rối loạn sắc tố. 1.2.4.1. Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc thiên nhiên Polyphenol thực vật là nhóm các hợp chất có nhiều nhóm chức phenol, tiêu biểu là flavonoid. Hơn 4000 flavonoid phân bố trong lá, hạt, vỏ cây và hoa đã được xác định. Ở thực vật các hợp chất này bảo vệ thực vật bằng cách chống lại tia cực tím và tác nhân gây bệnh [27]. Một số flavonoid như kaempferol, quercetin và morin thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase, trong khi những chất khác, ví dụ catechin và rhamnetin, đóng vai trò là các cơ chất của tyrosinase. Một số nghiên cứu cho thấy rằng flavonoid có chứa nhóm α-keto có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh [5]. Nhiều aldehyd và các hợp chất khác cũng được phân lập và xác định là có tác dụng ức chế enzym tyrosinase như cinnamaldehyd, (2E) -alkenal, 2-hydroxy-4methoxybenzaldehyd, anisaldehyd, cuminaldehyd và acid cumic [52]. Hoạt động ức chế tyrosinase của anisaldehyd và cuminaldehyd mạnh hơn khoảng 2,5 và 16 lần so với benzaldehyd. Một số alkanal có tác dụng ức chế tyrosinase có thể là do sự tương tác kỵ nước của chúng với các enzym, làm ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 3 của enzym [15]. (2E) - alkenal ức chế quá trình oxy hóa L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) của tyrosinase là chất ức chế không cạnh tranh, và phần alkyl kỵ nước có liên quan đến hoạt động ức chế của chúng [15]. Bên cạnh những thực vật bậc cao thì trong nấm cũng có một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase. Acid dicacboxylic bão hòa được tạo thành bởi quá trình peroxy hóa lipid và este hóa acid béo bằng nấm men, vi nấm Pityrosporum ovale. Acid dicacboxylic này có tác dụng gây độc nhất định trên các tế bào biểu bì tạo sắc tố của khối u ác tính ở da, mặc dù bình thường tế bào biểu bì tạo sắc tố không bị ảnh hưởng [69]. Acid kojic, 5-hydroxy-2- (hydroxymethyl)-γ-pyron, một chất chuyển hóa của nấm được sản xuất bởi nhiều loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Acid kojic ức chế sự hình thành sắc tố từ phản ứng oxy hóa L-DOPA, norepinephrin và dopamin dưới sự xúc tác của tyrosinase. Điều này có nghĩa rằng acid kojic có thể giảm chuyển hóa O-quinon thành O-diphenol ngăn cản tạo thành các sắc tố [43]. 1.2.4.2. Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp 10 Một lượng đáng kể các hợp chất có nguồn gốc tổng hợp như hydroxylamin, các hợp chất chứa thiol, acid cacboxylic thơm, dẫn xuất của acid cinnamic, trihydroxy chalconas, peptid, acid alkylbenzoic [31], N-hydroxy-N’-phenyl ure và N-hydroxyN’-phenyl thioure [16] có tác dụng ức chế enzym tyrosinase. Tropolon (2-hydroxy-2,4,6-cycloheptatrien-1-on) là một trong những chất ức chế tyrosinase mạnh nhất. Nó có cấu trúc tương tự như các cơ chất O-diphenolic của tyrosinase [42]. Resorcinol được gắn nhóm thế ở vị trí 4 là các chất ức chế tyrosinase yếu. Trong các hợp chất này, tác dụng ức chế mạnh nhất đạt được khi thay thế nhóm kỵ nước vào vị trí thứ 4, chẳng hạn như 4-hexyl resorcinol và 4-dodecyl resorcinol. 4hexyl resorcinol là các chất ức chế tyrosinase hiệu quả nhất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm vì nó hòa tan trong nước, ổn định, không độc hại, không gây đột biến và không gây ung thư, và chất này cũng đã được công nhận là an toàn trong việc kiểm soát sự sẫm màu của lát táo cũng như khoai tây và bơ khi để ngoài không khí lâu [21]. 1.2.4.3. Các thuốc được phát hiện có tác dụng ức chế tyrosinase Captopril, (S)-1-(3-mercapto-2-metyl-1-oxopropyl)-L-prolin, ức chế hoạt động monophenolase và diphenolase của tyrosinase [20]. Captopril được biết đến là chất tạo chelat với đồng [38]. Do đó, có thể cho rằng captopril chủ yếu có tác dụng ức chế là do tạo chelat với ion đồng ở vị trí hoạt động của tyrosinase. Một số thuốc khác cũng có tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase, như penicillamin, được sử dụng trong điều trị bệnh Wilson [55], và methimazol là thuốc kháng tuyến giáp. Methimazol (1-methyl-2-mercaptoimidazol) ức chế cả hoạt động monophenolase và diphenolase của tyrosinase nấm. Methimazol ức chế hoạt động tyrosinase của nấm bằng hai cách: liên hợp với O-quinon, do đó ức chế rõ sự hình thành sắc tố, và tạo chelat với đồng tại vị trí hoạt động của tyrosinase [1]. 1.2.4.4. Một số chất ức chế đã được sử dụng HQ làm giảm 90% hoạt tính của tyrosinase [77], là một hóa chất phổ biến có trong mỹ phẩm và sản phẩm làm sáng da không cần đơn. Nó được coi là một trong các chất ức chế hiệu quả nhất quá trình sản xuất melanin ở cả in vitro và in vivo. HQ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe đặc biệt là sắc tố của mắt, và trong một số ít trường hợp HQ gây tổn thương giác mạc vĩnh viễn. Hiện tượng này đã được quan sát thấy ở các công nhân sản xuất HQ. HQ đã bị Cục quản lý Dược phẩm Hoa Kỳ cấm 11 sử dụng trong các chế phẩm mỹ phẩm ở Châu Âu vì không an toàn khi sử dụng trong thời gian dài [17]. Arbutin, một hợp chất chuyển hóa thứ cấp của cây dâu gấu (tên khoa học là Arctostaphylos uva-ursi), được sử dụng rộng rãi với hiệu quả làm sáng da. Arbutin tự nhiên tương đối an toàn tuy nhiên lại có độ ổn định thấp và dễ dàng chuyển hóa thành HQ. Vì thế, vào năm 2008, Hiệp hội Mỹ phẩm Châu Âu đã cấm sử dụng các đồng dạng của beta-arbutin [81]. 1.3. Tổng quan về hợp chất thiên nhiên Việt Nam 1.3.1. Khái niệm hợp chất thiên nhiên Hợp chất thiên nhiên ( natural products) là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được chiết xuất từ các mô của động vật, thực vật trên cạn; sinh vật biển; vi khuẩn lên men; vi sinh vật [37]. Hầu hết các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là các chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc rất phức tạp. 1.3.2. Vai trò của hợp chất thiên nhiên trong nghiên cứu và phát triển thuốc Thực vật được cấu thành bởi một hệ thống lớn và đa dạng các chất hóa học, chúng có thể cung cấp những hợp chất với cấu trúc có độ phức tạp cao mà không thể tổng hợp được trong các phòng thí nghiệm. Những phân tử nhỏ này cung cấp nguồn hoặc là tiền chất cho phần lớn các hoạt chất được FDA chấp thuận và hiện đang là một trong những nguồn cảm hứng chính cho việc nghiên cứu và phát hiện thuốc mới. Có nhiều chất dẫn đường có nguồn gốc từ thực vật [62] (ví dụ morphin, cocain, digitalis, quinin, tubocurarin, nicotin, muscarin…). Một số đóng vai trò trực tiếp là những loại thuốc hữu ích (ví dụ morphin và quinin), và một số khác là cơ sở cho tổng hợp các hoạt chất làm thuốc (ví dụ như thuốc gây mê cục bộ phát triển từ cocain). Gần đây trong lâm sàng, một số loại thuốc mới đã được phân lập từ thực vật bao gồm thuốc chống ung thư paclitaxel (Taxol) từ cây thủy tùng, và thuốc chống sốt rét artemisinin từ câu thanh hao hoa vàng. Nhiều thực vật bậc cao chứa các chất chuyển hóa mới có tính kháng khuẩn và kháng virus [26]. Ở những nước phát triển, các ca lâm sàng có dử dụng hóa trị liệu thường dùng các thuốc đã được sản xuất bằng hóa tổng hợp in vitro; nhưng taxol và vincristin là ngoại lệ [46], chúng là các chất chuyển hóa có cấu trúc phức tạp, rất khó tổng hợp trong ống nghiệm. Nhiều loại thuốc tổng hợp và bán tổng hợp gây ra các phản ứng phụ nghiêm trọng, nhất là các thuốc dùng điều trị cho bệnh nhân ung thư với các tác dụng phụ biểu hiện trên da một cách rất nghiêm trọng. Các chất chuyển 12