Sắc ký gel và ứng dụng

  • Số trang: 30 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 209 |
  • Lượt tải: 3
hoang

Đã đăng 4066 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HÓA HỮU CƠ TIỂU LUẬN CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ TÊN ĐỀ TÀI: SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Giảng viên: TS. Huỳnh Khánh Duy Học viên thực hiện: Nguyễn Quốc Khƣơng Anh – 13053071 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 1 năm 2014 MỤC LỤC GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 3 I. II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL .................................................... 5 II.1. Đặc điểm của quá trình .................................................................................... 5 II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp............................................ 8 II.3. Độ giải li ............................................................................................................. 9 III. PHÂN LOẠI GEL ................................................................................................. 11 III.1. Superdex .......................................................................................................... 11 III.2. Sephacryl ......................................................................................................... 13 III.3. Superose ........................................................................................................... 15 III.4. Sephadex .......................................................................................................... 16 III.5. Sephadex LH-20 .............................................................................................. 18 IV. ỨNG DỤNG ........................................................................................................... 19 IV.1. Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein ................................ 19 IV.2. Sắc ký gel trong chiến lƣợc tinh chế ............................................................. 21 IV.3. Xác định khối lƣợng phân tử và phân tích sự phân bố khối lƣợng phân tử . .......................................................................................................................... 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 30 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG I. GIỚI THIỆU Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution). Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt.  Quá trình phân tách bằng phƣơng pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed). Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động. 1. hạt gel hình cầu 2. mẫu được đưa vào cột 3. Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột. Phân tử sẽ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn Hình I.1. Quá trình sắc kí gel Nguyễn Quốc Khương Anh 4. Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên đi ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau. Trang 3 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG  Ứng dụng của phƣơng pháp sắc kí gel Tách loại bỏ những nhóm phân tử (Group separation) Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối, protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử lớn. Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi. Sephadex G-10, G-25, G-50 được sử dụng cho nhóm này Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation) Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng của mẫu. Phù hợp cho bước tách cuối cuối cùng của việc tinh chế. Monomer có thể được tách khỏi tủa và mẫu có thể thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dự trữ. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 4 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL II.1. Đặc điểm của quá trình Kết quá của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích Vo (xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume). Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt (total column volume) của pha động đi qua cột. Hình II.1. Phổ đồ sắc kí Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng, Ve (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí. Có 3 cách để xác định Ve: Khi thể tích của mẫu quá nhỏ so với thể tích lớp đệm thì Ve được xác định từ vị trí ban đầu của mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc kí. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 5 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Khi thể tích của mẫu lớn, không thể bỏ qua so với thể tích lớp đệm thì Ve được xác định từ vị trí một nữa thể tích mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc kí. Khi thể tích mẫu quá lớn, tạo nên mũi sắc kí có vùng phẳng ngang, thể tích Ve được xác định từ vị trí bắt đầu của mẫu đến vị trí của điểm uốn ở phần đang tăng lên của mũi giải li. Hình II.2. Cách xác định thể tích giải li Ve Bởi vì mũi đối xứng phổ biến trong sắc kí gel, do đó Ve dễ dàng xác định. Tuy nhiên Ve không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển của các cấu tử khi qua cột bởi vì Ve sẽ thay đổi phụ thuộc vào Vt tổng thể tích của lớp đệm và cách nhồi cột. Sự giải li của mẫu được đặc trưng bởi hệ số phân bố Kd. Kd đặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy ra sự khuếch tán của những loại phân tử khác nhau. Cách xác định Ve đã được nêu ở trên. Vo là thể tích khoảng trống, chính là thể tích của những phân tử trong pha động không chui vào được mạng lưới lỗ xốp do kích thước lớn và di chuyển thẳng qua cột bằng thể tích của pha động (buffer). Cột được nhồi tốt thì thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột. Vs là thể tích pha tĩnh bằng Vi là thể tích pha động bên trong mạng lưới (chỉ chứa các phân tử kích thước nhỏ). Trong thực tế Vi rất khó xác định do phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), do đó để thuận tiện thì Vi được thay thế bằng Vt – Vo. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 6 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình II.3. Biểu đồ thể hiện thể tích Vo và Vt Do thay Vi bằng Vt – Vo, do đó ta có giá trị Kav, nó không thực sự đúng với giá trị hệ số phân bố Kd. Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giửa Kav:Kd, và tỉ lệ này không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu. Hình II.4. Mối quan hệ giữa các biểu thức đƣợc sử dụng quá trình giải li Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 7 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp Hệ số phân bố Kav liên quan đến kích thước của phân tử. Tỉ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị Kav và log Mr (khối lượng phân tử). Trên một vùng xem xét thì mối quan hệ này là đường thẳng. Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc. Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt (Kav =1)  Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (Ve > Vt)  Nếu Kav < 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các phân tử có thể chảy tắt qua cột (Ve < Vo). Hình II.5. Đƣờng cong chọn lọc của Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade và Superdex 200 prep grade Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 8 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG II.3. Độ giải li Độ giải li cho biết độ phân tách giữa các mũi, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tỉ lệ giữa thể tích mẫu và thể tích cột, tốc độ dòng, thông số cột, kích thước hạt, sự phân bố kích thước hạt, tỉ trọng lớp đệm, độ xốp của hạt, độ nhớt của pha động. Hiệu quả của quá trình sắc kí gel phụ thuộc vào chủ yếu vào các điều kiện lựa chọn sao cho độ chọn lọc hợp lí và tránh những mũi giản rộng trong quá trình phân tách. Độ giải li được xác định bằng biểu thức: ( )  Vr1 và Vr2 là thể tích giải li của 2 mũi gần nhau.  W1 và W2 là độ rộng tương đối của mũi. Hình II.6. Thông số đƣợc sử dụng để xác định độ giải li Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương pháp tạo ra những mũi hẹp. Hình II.7. Sự phụ thuộc của độ giải li vào độ chon lọc và độ rộng của mũi Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 9 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trình giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N): Trong đó:  Ve: thể tích mũi giải li  W1/2: chiều rộng mũi tại một nữa chiều cao mũi.  L: chiều cao đệm Hiệu quá có thể được cải thiện bằng cách giảm kích thước hạt, tuy nhiên kích thước hạt nhỏ tạo trở lực lớn và tốc độ dòng giảm, dẫn đến thời gian tiến hành kéo dài. Độ đồng đều của lớp đệm và hạt nhồi sẽ ảnh hưởng đến độ đồng đều của dòng chảy qua cột và do đó sẽ ảnh hưởng đến hình dạng và độ rộng của mũi. Thiết bị sắc kí gel với độ đồng đều cao luôn cho mũi giải li hẹp. Loại sắc kí gel với kích thướt hạt nhỏ tạo điều kiện cho các phân tử dễ dàng khuếch tán vào và ra khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân bằng giữa pha động và pha tĩnh, vì vậy cải thiện được độ giải li do giảm chiều rộng mũi. Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách: VSep = VeB - VeA Tuy nhiên, do dòng khuếch tán xoáy, sự không cân bằng giữa pha tỉnh và pha động, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên luôn có vùng giản rộng. Vì vậy thể tích mẫu luôn nhỏ hơn thể tích phân tách. Thể tích mẫu nhỏ Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách nếu không có vùng giản rộng Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách trong điều kiện thực nghiệm Hình II.8. Đƣờng cong giải li cho thể tích mẫu khác nhau Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 10 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG III. PHÂN LOẠI GEL Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều. Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất. Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại trọng lượng phân tử, tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel. Các loại gel thương mại thường không chịu được tính acid hay base quá mạnh, lỗ rỗng không quá lớn vì sẽ làm giảm độ bền cơ học. Có hai loại nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel. Xerogel là loại gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm. Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng. Nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel bị xụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi khi có thể khôi phục lại hệ mạng đó. Ngược lại aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel, thí dụ như thủy tinh có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng. Đó là nguyên liệu rắn có lỗ rỗng, dung môi có thể chui vào các lỗ rỗng này, nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel không bị xụp đổ. Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố:  Mục tiêu của thí nghiệm (phân tách độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất).  Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn. Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex, Sephacryl, Superose và Sephadex và Sephadex LH-20 III.1. Superdex Superdex là lựa chọn cho độ giải li cao, thời gian ngắn và độ thu hồ cao Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp, Superdex là loại gel được lựa chọn đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt. Superdex là một loại composite dựa trên liên kết ngang giữa các hạt rỗng agarose đến mạng dextran bằng liên kết cộng hóa trị. Nó có độ bền vật lý và hóa học cao bởi mạng agarose liên kết ngang và có tính chất lọc gel tốt do chuỗi dextran. Độ bền cơ học của Superdex cho phép những dung môi giải ly có độ nhớt cao như urea 8M vẫn chảy qua được. Loại gel này có thể chịu đựng tốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn định hay lúc rửa cột. Tính bền giúp loại Superdex phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp với tốc độ dòng cao, nhanh và hiệu quả làm sạch tại chỗ. Những tương tác giữa protein và gel Superdex được bỏ qua khi sử dụng dung môi với cường độ ion trong khoảng 0,15 M đến 1,5M. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 11 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình III.1. Mạng lƣới liên kết trong Superdex Hình III.2. Đƣờng cong chọn lọc cho Superdex (13 m) và Superdex prep grade (34 m) Superdex được sản xuất với hai loại kích thước hạt (13 m và 34 m) với 4 độ chọn lọc khác nhau (Superdex Peptide, Superdex 30, Superdex 75 và Superdex 200). Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 m của Superdex Peptide, Superdex 30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 12 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 34 m của Superdex prep grade cho qui mô công nghiệp. Khi không biết khối lượng của protein quan tâm thì nên bắt đầu với Superdex 200. Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng thể đơn dòng từ đimer và từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp. Superdex Peptide hay Superdex 30 prep grade dành cho việc phân tách peptides, oligonucleotides và phân tử protein nhỏ (Mr < 10000). Bảng III.1. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superdex III.2. Sephacryl Sephacryl là lựa chọn cho phân tách nhanh, độ thu hồi cao tại phòng thí nghiệm và qui mô công nghiệp Sephacryl High Resolution (HR) thay thế cho Superdex prep grade trong những ứng dụng đòi hỏi khoảng tương đối rộng, độ bền hóa học và chịu được tốc độ dòng cao làm cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp. Sephacryl HR là một loại composite được hình thành bởi liên kết ngang cộng hóa trị giữa allyl dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền cơ học cao. Lỗ xốp của gel được xác định bởi thành phần dextran được điều khiển để đem lại 5 độ chọn lọc khác nhau. Độ bền cơ học của Sephacryl HR cho phép những dung Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 13 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG môi có độ nhớt cao chảy qua. Sephacryl S-100 HR cho hiệu suất 96% cho việc tách những chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, lactoglobulin A+B, chymotrypsinogen A, myoglobin, lysozyme, ribonuclease A và cytochrome C. Cường độ tối thiểu ion nên sử dụng là 0,15 M. Hình III.3. Một phần cấu trúc của Sephacryl High Resolution Hình III.4. Đƣờng cong chọn lọc của gel Sephacryl High Resolution Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 14 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Bảng III.2. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephacryl HR III.3. Superose Superose có thể dùng trong khoảng khối lượng phân tử rộng nhưng không phù hợp cho phân tách qui mô công nghiệp Superose là loại gel bền vật lý và hóa học cao, hình thành dựa trên liên kết ngang của phân tử lỗ xốp agarose. Một vài tương tác kị nước với gel làm cho những phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li chậm hơn dự đoán. Tuy nhiên, trong một vài ứng dụng, những tương tác này có thể giúp làm tăng độ giải li của quá trình phân tách. Bảng III.3. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superose Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 15 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình III.5. Đƣờng cong chọn lọc của gel Superose III.4. Sephadex Sephadex được dùng để tách nhanh những nhóm có khối lượng phân tử nhỏ, khử muối, đổi dung môi và làm sạch mẫu Sephadex được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran với epichlorohydrin. Những loại khác nhau của Sephadex là do những mức độ khác nhau của liên kết ngang và vì vậy nó có những mức độ trương nở và độ chọn lọc khác nhau cho những kích thước phân tử đặc trưng. Sephadex G-10 phù hợp cho việc tách những phân tử sinh học như peptides (Mr > 700) ra khỏi những phân tử nhỏ (Mr < 100). Sephadex G-50 phù hợp tách những phân tử có Mr > 30000 ra khỏi những phân tử Mr < 1500 như protein được đánh dấu hay DNA. Loại gel này còn được sử dụng để loại bỏ nucleotides nhỏ ra khỏi acids nucleic mạch dài. Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu. Loại gel này hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có Mr > 5000. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 16 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình III.6. Một phần cấu trúc của gel Sephadex Bảng III.4. Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephadex Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 17 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG III.5. Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 được sản xuất dành riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung môi hữu cơ để duy trì độ bền của chúng. Các hợp chất tự nhiên này là steroids, lipids và peptides có khối lượng phân tử thấp (khoảng 35 amino acids). Các hợp chất thường được phân tách bằng sắc kí phân chia lỏng/lỏng hay sắc kí hấp thu. Sephadex LH-20 có độ chọn lọc rất cao cho hợp chất có vòng thơm (aromatic). Nó được sử dụng trong phân tích và trong qui mô công nghiệp để phân tách những nhóm chất có tính chất tương tự nhau. Sephadex LH-20 được tạo nên từ những chuỗi hydroxypropylated dextran mà có liên kết ngang đến mạng lưới polysaccharide. Loại này có thể trương nở trong nước và dung môi hữu cơ. Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers). Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ. Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước. Hình III.7. Một phần cấu trúc của gel Sephadex LH-20 Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 18 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG ỨNG DỤNG IV.1. Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein Sự thẩm tách (Dialysis) là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc loại bỏ muối hay những phân tử nhỏ và thay đổi dung môi. Tuy sự thẩm tách xảy ra chậm, đòi hỏi lượng dung môi lớn và có nhiều khả năng làm mất mẫu trong quá trình tiến hành, hay sự đứt gãy do protein bị phân giải hay là những liên kết khó kiểm soát giữa mẫu và màng thẩm tách. Một kỹ thuật đơn giản hơn và nhanh hơn sử dụng cột sắc kí gel để phân tách dựa trên sự khác biệt về khối lượng phân tử để loại muối và những phân tử nhỏ. Cột được nhồi với SephadexTM G-25. Chỉ trong một bước, mẫu sẽ được loại bỏ muối, những phân tử nhỏ và đổi dung môi mới. Thể tích mẫu cần loại muối có thể lên tới 30% tổng thể tích cột. Tốc độ và năng suất cao của phương pháp cho phép những thể tích mẫu lớn vẫn được tiến hành nhanh và hiệu quả. IV. Hình IV.1. Phổ đồ quá trình khử muối và đổi dung môi Bảng IV.1. Thông số cột đƣợc nhồi sẵn cho ứng dụng khử muối và đổi dung môi Để loại muối cho lượng mẫu lớn có thể sử dụng nhiều cột được bán sẵn như HiTrap Desalting hay HiPrep 26/10 Desalting. Ví dụ:  2 cột HiTrap Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 3 ml hay 5 cột thì thể tích mẫu lên tới 7,5 ml.  4 cột HiPrep 26/10 Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 60 ml và thời gian tiến hành khoảng 20 – 30 phút. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 19 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Quá trình khử muối và đổi dung môi thường tốn khoảng 5 phút trên mẫu với trên 95% mẫu được thu hồi (đối với hầu hết các protein) Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl trong dung môi để chống lại sự tương tác ion. Nồng độ mẫu không ảnh hưởng quá trình phân tách miễn là nồng độ protein không vượt quá 70 mg/ml khi sử dụng dung môi có nước thông thường. Mẫu nên được hòa tan hoàn toàn, ly tâm hoặc lọc bỏ những phần rắn còn sót. Ví dụ quá trình khử muối:  Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6  Mẫu được khử muối trên cột HiTrap Desalting 5 ml với chương trình ÄKTA prime cài đặt sẵn.  Dung môi giải li là sodium phosphate 20 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0.  Tín hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV (280 nm) và tín hiệu đầu ra của muỗi được xác định bằng độ dẫn điện. Hình IV.2. Sắc kí đồ quá trình khử muối ra khỏi (His)6 protein bằng ÄKTA prime  Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu  Mẫu là 2 mg/ml BSA trong 50 mM sodium phosphate, 0,5 M sodium chloride, pH 7,0.  Sử dụng cột khử muối HiTrap Desalting (5 ml), lần lượt sử dụng 1, 3, 5 cột để tăng thể tích mẫu.  Dung môi giải li là sodium phosphate 50 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0.  Tốc độ dòng là 5 ml/ phút. Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 20
- Xem thêm -