Tài liệu Phương pháp thực nghiệm dùng trong nghiên cứu hợp chất trong cây bò khai ở thái nguyên

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT TRONG CÂY BÒ KHAI Ở THÁI NGUYÊN I. MỞ ĐẦU. Một vấn đề lớn đặt ra cho học sinh các trường THPT nói chung và trường THPT chuyên nói riêng đó là vấn đề thực nghiệm trong hóa học. Từ thực nghiệm giúp các em có thể nắm bắt được các vấn đề về lý thuyết nhanh hơn, nhớ lâu hơn và biết hóa học có ý nghĩa lớn lao như thế nào trong cuộc sống và sản xuất. Từ đó giúp các em có thêm nhiều hơn tình cảm với bộ môn hóa học, có sự hứng thú với bộ môn và giúp các em phát huy những năng khiếu, năng lực về bộ môn hóa học. Từ thực nghiệm về hóa học cũng cho các em tiếp cận nhanh hơn với những vấn đề mới trong hóa học cùng với những phương pháp nghiên cứu truyền thống giúp các em nhanh chóng trưởng thành về tư duy thực nghiệm và nhạy bén hơn trong việc tiếp cận vấn đề mới về thực tiễn. Từ đó giúp các em có những đóng góp nhất định vào việc nghiên cứu khoa học dành cho học sinh. Ở nước ta có rất nhiều các loài cây cỏ, động vật trong chúng chứa rất nhiều hợp chất có ý nghĩa trong y học, trong sản xuất cũng như đời sống hàng ngày. Đó cũng là một tài nguyên có thể nói là vô cùng phong phú và đa dạng mà các học sinh, sinh viên rồi các nhà khoa học hướng tới để nghiên cứu nhằm tạo ra những chế phẩm giúp ích cho con người. Vì vậy việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng. Chính vì tầm quan trọng của thực nghiệm với hóa học và đặc biệt trong nghiên cứu hợp chất thiên nhiên nên tôi quyết định lựa chọn chuyên đề: Phương pháp thực nghiệm nghiên cứu thành phần trong cây bò khai ở Thái Nguyên. Qua chuyên đề này tôi muốn gửi gắm tới các đồng nghiệp cũng như các em học sinh phương pháp làm thực nghiệm cơ bản khi nghiên cứu về thành phần của thực vật nói chung và cây bò khai nói riêng. II. NỘI DUNG. 1. Những hiểu biết chung về cây bò khai. a. Đặc điểm thực vật học và phân bố. Cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume) có tên gọi khác là dây hương thuộc họ dương đầu. Ngoài ra cây còn có tên gọi khác là cây dây hương [1] [2] [4] [21]. Đây là loài có ở Trung Quốc và Việt Nam. Cây mọc hoang ở ven rừng phục hồi, rừng ẩm từ Thái Nguyên, Lạng Sơn cho đến Gia Lai, Đắc Lắc. Dây hương cũng thường được trồng và người có thể thu hái gần quanh năm chỉ trừ vài tháng mùa đông quá lạnh vì ngọn non không mọc được. Lá non và lá bánh tẻ vào mùa xuân, hè và thường dùng khi tươi; nhưng mùa thu hái nhiều nhất vẫn là mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 9-10 [21]. b. Đặc điểm sinh thái. 1. Dạng cây: Cây có dây leo bằng tua cuốn, có cành mềm thòng xuống, vỏ xanh. [2] [4]. 2. Lá: Lá mọc so le, hình trứng rộng, đầu nhọn, gốc tròn hay hình tim, dài khoảng 10-15cm, rộng khoảng 5-7 cm, có 3 gân gốc, 3-5 đôi gân bên, mặt dưới mốc mốc, cuống lá dài 5-10 cm, phù ở hai 1 đầu và hơi dính vào phía trong phiến lá; tua cuốn ở nách lá dài 15-20 cm thường chẻ hai. Hoa nhỏ, lưỡng phái. [2] [4]. 3. Cụm hoa: Cụm hoa xim hai ngà, có cuống chung dài 10-15 cm. Hoa nhỏ, đơn tính. Quả mọng, hình trái xoan dài 10-15 mm, màu vàng hay đỏ, chứa một hạt lớn. [2] [4]. 4. Quả và hạt: Phì quả hình xá lị, vàng hay đỏ, dài khoảng 2cm. Quả có một hạt. [2] [4]. c. Những nghiên cứu về cây Erythropalum scandens Blume ở nước ngoài. Cho đến nay nhiều loài thực vật thuộc họ Olacaceae được sử dụng trong y học cổ truyền các nước nhưng lại thuộc các chi Ximenia, Olax... Còn những loài thực vật thuộc chi Erythropalum thì hầu như chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến nghiên cứu thành phần hoá học. Do cây dây hương là loại rau ăn nên trên thực tế chỉ có Trung Quốc sử dụng cây Erythropalum scandens Blume để chữa viêm gan, viêm ruột, viêm niệu đạo, viêm thận cấp tính [4]. Những nghiên cứu về cây Erythropalum scandens Blume trong nước. d. Trước đây một vài nghiên cứu sơ bộ ban đầu về hoá học của cây bồ khai cho biết thành phần dinh dưỡng tính theo thành phần % trong cây như: Nước 78,8%; protit 6,1%, xơ 7,5%. Theo mg% thì Canxi 138; Photpho 40,7; caroten 2,6 và vitamin C 60 [4]. Ngoài ra khi định tính thành phần hoá học một số nhóm chất của cây bồ khai cũng đã cho một số kết quả sau [3]: Kết quả định tính thành phần hóa học cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume ) TT Tên chất Hàm lượng trung bình 1 Nước 78,78% 2 HCN 0,0058% 3 Protein 24,11% 4 Flavonoit 0,93% Khi phân tích định tính các nhóm chất trong các dịch chiết từ cây bồ khai tác giả [3] cho biết đã xác định được các axít amin như: L-Cystein, DL-ornithine monohy®ro chloride, L-arginine, DL-serine, L- glutamic axit, DL-thionine... Trong ®ã cã 8 axit amin kh«ng thÓ thay thÕ ®-îc: L-cystein, DL-Leucine, DL-methionine, DL-isoleucine, DL-threonine, DL-β-phenyl alanin, DL-valine, L-arginine. Ngoài t¸c gi¶ [3] cßn x¸c ®Þnh ®-îc mét sè nhãm chÊt h÷u c¬ nh-: cumarin, steroit saponin, xyanglycozit. 2 HiÖn ch-a cã mét c«ng tr×nh nµo trªn thÕ giíi c«ng bè vÒ viÖc nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc c©y bß khai [14]. e .Những ứng dụng của cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume). Cây dây hương có tên khoa học Erythropalum scandens Blume được sử dụng trong một số bài thuốc dân gian để chữa viêm gan, viêm ruột, viêm niệu đạo. viêm thận cấp tính, tiểu tiện không thông... với liều lượng hàng ngày là 12-14 gam, sắc lấy nước uống [4] [21]. Còn ở Việt nam do cây bồ khai có vị đắng, mùi khai, tính bình nên có tác dụng thanh nhiệt, lợi niệu. Theo kinh nghiệm trong nhân dân dây hương là một vị thuốc quí, nó thường được dùng để chữa các bệnh về thận như viêm thận, gan, nước tiểu vàng và đái rát. Người ta thường dùng lá và ngọn non thái nhỏ, vò kỹ, rửa sạch để khử mùi khai rồi nấu canh, luộc hoặc xào ăn có mùi thơm ngon nên gọi là cây rau khai. Dùng 20-40 gam lá tươi giã nát, thêm nước gạn uống. Có khi dùng phối hợp với lá Bòng bong. Kinh nghiệm dân gian ở Bắc Thái dùng toàn cây sắc nước uống chữa gan siêu vi trùng đạt kết quả tốt. Ngoài ra thân cành tươi bỏ lá, thái mỏng phơi khô, ngâm rượu uống chữa sốt, tê thấp [21]. Ngoài giá trị trong y học dây hương còn có giá trị thực phẩm và kinh tế to lớn. Dây hương là loại rau cổ truyền của đồng bào miền núi. Mỗi năm một gia đình ở đây bình quân thu hái 510kg dây hương để làm thức ăn. Khoảng gần mười năm nay, dây hương được bán nhiều ở các chợ thị xã Lạng Sơn và Cao Bằng, trở thành món ăn đặc sản được nhiều người ưa thích. Vì vậy cần phát triển gieo trồng loại rau này để cung cấp cho thị trường trong nước ngày một mở rộng. Dây hương cũng là một cây có thể xóa đói giảm nghèo. Một số gia đình ở xã Khang Ninh, thuộc vùng đệm của Vườn quốc gia Ba Bể mới trồng thử quanh hàng rào và trong vườn gia đình nhưng hàng năm cũng bán được hàng trăm nghìn đồng [20] [21]. Khi chế biến để ăn, người ta thường lấy lá và ngọn non vò kỹ, rửa sạch cho hết mùi khai rồi luộc, nấu canh hoặc xào với thịt hay lòng gan gia súc, gia cầm. Có lẽ ngọn và lá non dây hương xào thịt bò là ngon hơn cả. Được ăn một lần sẽ nhớ mãi món ăn này [21]. 2. Thực nghiệm nghiên cứu cây bò khai. Cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume) là thực vật có ý nghĩa to lớn trong y học dân gian làm thuốc chữa bệnh gan, bệnh thận, viêm đường tiết niệu. Ngoài ra cây này thuộc loài thực vật rất có ý nghĩa kinh tế và thực phẩm to lớn. Nhưng hiểu biết về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của cây Bồ khai vẫn còn rất sơ sài, hầu như chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hoá học. Nhiệm vụ của luận văn này là tìm hiểu thành phần hoá học phần trên mặt đất của cây Bồ khai (Erythropalum scandens Blume) được trồng tại Thái Nguyên. 2.1. Đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu. 2.1.1. Thu mẫu, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu. 3 Nguyên liệu để nghiên cứu là phần thân và lá của cây Bồ khai. Mẫu tươi thu vào tháng 10/2007 tại Thái nguyên đem phân loại riêng rẽ từng phần lá, thân cành. Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật đã được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam ) giám định tên khoa học là Erythropalum scandens Blume họ Erythropalaceae hay Olacaceae. Ngoài ra còn có tên là cây dây hương. Ảnh 2.1: Hình ảnh cây bồ khai ( Erythropalum scandens Blume ) 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu. Mẫu cây tươi thu được đem phân loại riêng biệt lá và thân cành. Sau đó các bộ phận mẫu được sấy ở nhiệt độ 1100 C trong 15 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50-600 C tới khi khô giòn. Mẫu khô thu được 300gam lá và 250gam thân cành đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết bằng Etanol hoặc Metanol. Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cặn chiết tổng thu được đem chiết lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (Hexan, Etylaxetat, Metanol). Các dịch chiết được làm khan bằng Na2 SO4 rồi cất kiệt dung môi ở áp suất giảm. Cặn chiết thu được đem cân tới khối lượng không đổi. Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những phương pháp khác nhau: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân chia các chất có độ phân cực gần như nhau, làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc kí cột lặp lại nhiểu lần v. v... để được chất tinh khiết. Quá trình nghiên cứu nêu chi tiết ở phẩn thực nghiệm. 2.1.3. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết. Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất như phân lập được các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc kí như: - Sắc kí lớp mỏng (SKLM). 4 - Sắc kí cột thường. 2.1.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc các chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy v.v... khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR), cacbon-13 (13 C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR), và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiê n cứu. 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất. Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng đều phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554) được hoạt hoá ở nhiệt độ 1100 C- 1200 C trong thời gian 1,5-2 giờ Các hệ dung môi triển khai SKLM: 1. n-hexan : etylaxetat A 20:1 2. n-hexan : etylaxetat B 15:1 3. n-hexan : etylaxetat C 8:1 4. n-hexan : etylaxetat D 4:1 5. n-hexan : etylaxetat E 2:1 6. n-hexan : etylaxetat F 1:1 7. Clorofom: Metanol G 9:1 Các sắc kí lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại Kieselgel 60F254 ) rồi phun thuốc thử vanilin –H2 SO4 5% và sấy ở nhiệt độ trên 1000 C để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C) x100. Sắc kí cột thường sử dụng silicagel Merk 60, cỡ hạt 70-230 mesh (0,040-0,063 mm) và 230-400 mesh ( 0,063 đến 0,2 mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu. - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boortus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. 5 - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ 1 H và 13 C-NMR với các kỹ thuật đo 1D và 2D-NMR được ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3 , CD3 OD, DMSO-d6 2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây Erythropalum scandens Blmue. 2.3.1. Thu nhận dịch chiết. Mẫu cây tươi mới thu hái được đem phân loại riêng lá và thân cành. Các bộ phận được đem sấy khô rồi nghiền nhỏ và cho vào ngâm chiết với dung môi metanol. Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được cặn tổng. Cặn chiết tổng này được chiết lần lượt với các loại dung môi hexan, Etylaxetat, metanol (mỗi loại dung môi đem chiết 3 lần). Các dịch chiết nói trên làm khan bằng Na2 SO4 rồi đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tương ứng. Các cặn chiết tu được đem sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Việc thu nhận cặn chiết từ cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume) được thực hiện như trong sơ đồ 2.1 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume ) Nguyên liệu Sấy khô nghiền nhỏ MeOH, Cất loại dung môi dưới áp suất giảm Cặn chiết Metanol 1.Hexan 2. EtOAc Cất loại Cất loại dung môi dung môi 3.MeOH Cất loại dung môi Cặn chiết hexan Cặn chiết EtOAc Cặn chiết MeOH H E M Như vậy từ sơ độ 2.1 ứng với bộ phận lá, thân cành cây Erythropalum scandens Blume sẽ có 6 loại cặn chiết và được kí hiệu là: 6 LEH, LEE, LEM CEH, CEE, CEM Kí hiệu: LEH: Cặn chiết n-hexan của lá Erythropalum scandens Blume LEE: Cặn chiết EtOAccủa lá Erythropalum scandens Blume LEM: Cặn chiết MeOH của lá Erythropalum scandens Blume CEH: Cặn chiết n-hexan của thân cành Erythropalum scandens Blume CEE: Cặn chiết EtOAc của thân cành Erythropalum scandens Blume CEM: Cặn chiết MeOH của thân cành Erythropalum scandens Blume Kết quả thu nhận các dịch chiết tử cây bồ khai ở Thái nguyên được nêu trong bảng 2.1. Bảng 2.1: Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume ) Mẫu thu vào tháng 10/2007 tại Thái Nguyên Lá Cành Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cặn chiết thu được và kí hiệu (g) n-hexan EtOAc MeOH 13,5 7,9 14,8 (LEH) (LEE) (LEM) 3,0 1,4 17,8 (CEH) (CEE) (CEM) 300 250 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết. 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol. Lấy 0,01 gam mỗi cặn chiết của 6 cặn chiết trên cho vào 6 ống nghiêm khác nhau, sau đó thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml CHCl3 , lấy dung dịch Clorofom để làm phản ứng định tính với các sterol và thuốc thử Lieberman-Bourchard (hỗn hợp gồm 1 ml anhyđrit axetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00 C sau đó thêm 1 giọt H2 SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dung dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử dung dịch xuất hiện màu xanh bền trong một thời gian dài là dương tính. 7 2.3.2.2. Phát hiện ancaloit. Lấy 0,01 gam cặn chiết của mỗi cặn chiết trên thêm 5 ml dung dịch H 2 SO4 5% khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm mỗi ống 1ml nước lọc axit: Ống 1: 1-2 giọt dung dịch Silicostungtic axit 5%, nếu có kết tủ trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: 1-2 giọt dung dịch thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3: 3-5 giọt thuốc thử Mayer, nếu có kết tủa trắng là dương tính. 2.3.2.3. Phát hiện flavonoid. Lấy 0,01g cặn chiết của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc trong ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê (Mg) hoặc kẽm (Zn), sau đó cho vào 5 giọt dung dịch HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoid. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Erythropalum scandens Blume được nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây bồ khai STT Nhóm chất 1 Sterol Thuốc thử Hiện tượng Lá Cành Màu xanh vàng + + Dragendorff Vàng da cam - - Zn(Mg) + HCl Hồng + + H2 SO4 đặc Huỳnh quang xanh + + NaOH đặc Vàng + + FeCl3 5% Xanh đen + + LiebermanBourchard 2 3 Ancaloit Flavonoid Chú giải: + : Phản ứng dương tính. - : Phản ứng âm tính. 8 2.4. Phân lập và tinh chế các chất. 2.4.1. Cặn chiết n-hexan của lá (LEH). Lấy 13,5g cặn chiết n-hexan của lá tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat- n-hexan có tỷ lệ tăng dần từ 0 – 100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 – 10ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và phát hiện màu bằng thuốc thử vanilin – H2 SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.1.1. Amít béo mạch dài H7 (LEH7). Rửa giải cột bằng dung môi n-hexan đã thu được khối chất rắn, trắng, vô định hình, có khối lượng là 117,7. Kiểm tra SKLM trên hệ A cho giá trị R fA= 33 hiện màu thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng, có nhiệt độ nóng chảy khoảng 76-770 C. Kí hiệu là H7. Phổ IR (KBr): υmax (cm-1 ): 3414 (tù, tb) (NH2 ); 2922 và 2857 (CH2 ); 1700 (C=O); Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3 , δ (ppm): 0,88 (3H, t, j= 6,5Hz, CH 3 ); 2,38 (2H, t, J= 10Hz, α-CH2 -C=O); 1,55(2H, d, j=11,5Hz, β-CH2 -C=O); 1,25 (26H, s, CH2 ). 1.29 0.96 1.33 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 2.18 1.57 O NH2 2.4.1.2. Tritecpenoit H2 (LEH2). Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (20 : 1), thu được khối chất rắn vô định hình. Khối chất rắn này được tinh chế lại trên cột silicagel, với dung môi rửa giải cột là n-hexan – etylaxetat theo tỉ lệ (18 :1) thu được khối kết tinh hình kim có khối lượng 10,5mg. Kiểm tra SKLM trên hệ B cho giá trị RfB= 20 hiện màu bằng thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng, có điểm nóng chảy 268-2690 C. Kí hiệu là H2. Phổ hồng ngoại IR(KBr) υmax(cm-1 ): 2919(m) và 2855(m) ứng với nhóm CH 2 và CH3 ; 1715(y) (C=O); 1458(tb) (C=C). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3 , δ (ppm): 0,95 (3H, s, H-23); 1,01 (3H,s, H-24); 1,05 (3H, s, H-25); 1,18 (3H, s, H-26); 1,20 (3H, s, H-27); 0,87 (3H, s, H-28); 0,88 (6H, s, H-29, 30); [16]. Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3 , δ (ppm): 59,52 (s, C-10); 58,26 (s, C-4); 53,13 (s, C-8); 43,21 (s, C-3); 42,83 (s, C-18); 42,16 (s, C-5); 41,54 (t, C-2); 41,32 (t, C-6); 39,73 (s, C-13); 39,27 (t, C-22); 38,32 (s, C-14); 37,47 (s, C-9); 36,04 (t, C-16); 35,65 (t, C-11); 35,37 (t, C-19); 35,03 (q, C29); 32,50 (t, C-21); 32,45 (d, C-15); 32,11 (q, C-28); 31,79 (q, C-30); 30,52 (t, C-12); 30,02 (s, C-17); 9 6.0 28,19 (s, C-20); 22,29 (t, C-1); 20,27 (q, C-26); 18,69 (q, C-27); 18,26 (t, C-7): 17,96 (q, C-25); 14,67 (q, C-24); 6,82 (q, C-23); [18]. 29 30 20 19 28 27 18 12 25 1 26 3 4 23 14 16 8 10 O 17 9 2 22 13 11 21 15 7 5 6 24 3-oxo. Friedelan (Friedelan là khung D:A-friedo oleanan) 2.4.1.3. Tritecpenoit H4 (LEH4). Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (20 : 1), thu được khối kết tinh dạng vô định hình, có khối lượng là 32,7 mg. Kiểm tra SKLM trên hệ B cho giá trị R fB= 8 hiện màu thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng, có điểm nóng chảy 282-2830 C. Kí hiệu là H4. Phổ IR(KBr):υmax(cm-1 ): 3311(tb, tù)(OH); 2924(m) và 2852(m) CH 2 và CH3 ; 1466(tb)(C=C); 725(y) (ρCH2 ). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3 , δ (ppm):0,96(3H,s H-23 hoặc H-24, s); 0,77(3H, d, j = 2,5Hz , H-25); 1,09(3H, s, H-26); 1,00 (3H, s, H-27); 0,95(3H, s, H-29); 0,98 (3H, s,H-30); 5,53(1H, dd, j=3,2Hz, 8,1Hz ,H-15); 3,19(1H, d, j=9,76Hz , H-3) [16]. Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3 , δ (ppm): 158,10 (s, C-14); 116,89 (d, C-15); 79,09 (d, C-3); 55,55 (s, C-5); 49,30(s, C-18); 48,77(s, C-9); 41,34(t,C-19); 38,99 (s, C-4); 38,77 (s, C-8); 38,01(t, C1); 37,75 (s, C-10); 37,72 (s, C-13); 37,58 (s, C-17); 36,69 (t, C-16); 35,79 (t, C-12); 35,13 (t, C-7); 33,77 (t, C-21); 33,36 (q, C-29); 33,11 (t, C-22); 30,91 (q, C-26); 29,92 (q, C-28); 29,71 (s, C-20); 28,01 (q, C-23); 27,16 (t, C-2); 25,91 (q, C-27); 21,32 (q, C-30); 18,81 (t, C-6); 17,51 (t, C-11); 15,45 (q, C-24); 15,43 (q, C-25); [18]. 29 30 20 19 27 12 25 4 5 HO 16 8 10 23 14 9 2 3 17 26 15 7 6 24 10 21 22 13 11 1 28 18 Taraxerol 3β-hiđroxi taraxeran. Taraxeran (D-Friedo oleanan). 2.4.1.4. Tritecpenoit H3 (LEH3). Tiếp tục rửa giải cột nhưng với hệ dung môi n-hexan – etylaxetat với tỉ lệ (15 : 1), thu được chất kết tinh hình kim nhỏ, không màu, có khối lượng 5mg. Kiểm tra SKLM trên hệ B cho giá trị R fB= 11 hiện màu thuốc thử với Vanilin -H2 SO4 cho màu tím hồng, có điểm chảy khoảng 290-2910 C. Kí hiệu là H3. Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3 , δ (ppm): 0,88 (3H, s, H-23); 1,18 (3H, s, 26-CH3 ); 1,20 (3H, s, 27-CH3 ); Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3 , δ (ppm): 157,43 (s, C-14); 53,24 (s, C-8); 49,22 (s, C-18); 42,88 (t, C-19); 41,77 (t, C-2); 39,71 (s, C-13); 39,31 (t, C-22); 37,87 (s, C-10); 37,15 (s, C-9); 36,12 (t, C-16); 35,60 (t, C-11); 35,37 (t, C-7); 35,03 (q, C-29); 32,86 (t, C-21); 32,37 (d, C-15); 31,81 (q, C30); 30,66 (t, C-12); 30,05 (s, C-17); 29,71 (s, C-20); 28,19 (q, C-23); 20,1 (q, C-26); 18,65 (q, C-27); 18,26 (t, C-7); 17,58 (q, C-25); 15,82 (q, C-24); Các tín hiệu của gốc đường: 103,42 (d); 76,43(d); 75,59(d); 74,67 (d); 73,44(d); 72,55(d); 71,61 (d); 61,41 (s); [6]. 2.4.1.5. β-Sitosterol H5. Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột n-hexan – etylaxetat (10 : 1), thu được chất kết tinh hình kim, không màu, có khối lượng 25,8mg. Kiểm tra SKLM trên hệ B cho giá trị R fB= 5 hiện màu bằng thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng, có nhiệt độ nóng chảy 135-1360 C. Kí hiệu là H5. Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6 ); δ (ppm): 1,01 (3H, s, H-19); 2 cụm doublet 0,89 và 0,88 (2x3H, d, j=7,7Hz, H-26, H-27); 0,91 (3H, d, j=10Hz, H-21); 3,53 (1H, m, H-3α); 5,36 (1H, d, j=5Hz, H-6). Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3 , δ (ppm): 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 71,8 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,1 (d, C-17); 50,2 (s, C-9); 45,9 (s, C-24); 42,3 (s, C-13); 42,3 (t, C-4); 39,8 (t, C-12); 37,3 (t, C-1); 36,5 (s, C-10); 36,2 (d, C-20); 33,9 (d, C-8); 31,9 (t, C-7); 31,7 (t, C-2); 29,2(d, C-25); 28,3 (t, C-16); 26,2 (t, C-23); 24,3 (t, C-15), 21,1 (t, C-11); 19,8 (q, C-26); 19,4 (q, C-19); 19,1 (q, C-27); 18,8 (q, C-21); 11,9 (q, C-29); 11,9 (q, C-18); 23,1 (t, C-28); 42,3 (t, C-4); 2.4.2. Cặn chiết Etylaxetat của lá (LEE). Làm tương tự như mục 2.4.1 từ 7,9 gam cặn chiết EtOAc đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi Etylaxetat-n-hexan có tỷ lệ tăng dần từ 0-100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5-10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn chiết thu được bằng sắc ký lớp 11 mỏng và phát hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2 SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.2.1. Tritecpen E3. Rửa giải cột trong trong hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (10 : 1), thu được chất rắn vô định hình, trắng , có khối lượng 32,8mg. Kiểm tra SKLM trên hệ C cho giá trị R fC= 13 hiện màu bằng thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng. Kí hiệu là E3 (trùng với H4). 2.4.2.2. β-Sitosterol - glucozit E9. Rửa giải cột bằng hệ dung môi Etylaxetat theo tỉ lệ 100% thu được tinh thể hình kim, trong suốt có khối lượng 18,9mg, nhiệt độ nóng chảy khoảng 279-2800 C. Kiểm tra SKLM trên hệ G với chất chuẩn β-Sitosterol – glicozit cho cùng một giá trị RfG= 12 hiện màu bằng thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng.Kí hiệu là E9. Mặt khác khi trộn lẫn E9 với chất chuẩn β-Sitosterol – glucosid thì nhiệt độ nóng chảy không đổi. 29 28 20 21 27 24 25 26 18 12 17 11 13 1 16 9 14 2 10 8 15 3 RO 7 5 4 6 R- là H (β-sitosterol) (C29 H50 O) R- Gluc ( β-Sitosterol-glucosid ) (C35 H60 O6 ) 2.4.3. Cặn chiết Etylaxetat của cành (CEE). Làm tương tự như mục 2.4.1 từ 1,4 gam cặn chiết EtOAc đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat- n-hexan có tỷ lệ tăng dần từ 0 – 100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 – 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn chiết thu được bằng sắc ký lớp mỏng và phát hiện màu bằng thuốc thử vanilin – H2 SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.3.1. Este CEE1. Rửa giải cột trong trong hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (20 : 1), thu được chất rắn vô định hình, dạng bột, trắng, có khối lượng 11,4 mg. Kiểm tra SKLM trên hệ C được giá trị RfC= 22 hiện màu bằng thuốc thử Vanilin-H2 SO4 cho màu tím hồng, nhiệt độ nóng chày 76-770 C. Kí hiệu là CEE1. 12 Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6 ); δ (ppm): 4,05 (2H, t, αCH 2 -OOC); 1,58 (2H, m, βCH 2 -OOC); 2,27 (2H, t, αCH2 -COO). 1.29 0.96 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 2.25 1.57 0.96 O 1.33 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29 1.68 4.08 1.33 O 2.4.4. Cặn chiết metanol của lá (LEM). Làm tương tự như mục 2.4.1 từ 1,4 gam cặn chiết EtOAc đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat- n-hexan có tỷ lệ tăng dần từ 0 – 100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 – 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn chiết thu được bằng sắc ký lớp mỏng và phát hiện màu bằng thuốc thử vanilin – H2 SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.4.1. β-Sitosterol - glucozit M4 ( trùng với E9). Rửa giải cột trong trong hệ dung môi clorofom – metanol (9 : 1), thu được chất rắn vô định hình, dạng bột, trắng , có khối lượng 10,67 mg, R fG= 12 trùng với E9. III. KẾT LUẬN. 1. Phân tích sàng lọc hoá thực vật một số nhóm chất của lá và thân cành cây bồ khai (Erythropalum scandens Blume ) được trồng tại Thái nguyên đã chỉ ra sự có mặt của sterol, flavonoid, tritecpenoit. 2. Lần đầu tiên nghiên cứu hoá thực vật cây bồ khai ở Thái nguyên, đã phân lập được 7 hợp chất sạch: H5 ( β- sitosterol); E9 ( β- sitosterol- glucosid); H7 ( amít béo mạch dài); CEE1 ( Este béo mạch dài ); H4 ( 3-hiđroxi taraxeran ); H2 ( 3-oxo Friedelan ); H3 ( Tritecpen-glucozit ); 3. Dựa vào các đặc trưng vật lý và phương pháp phổ hiện đại IR, 1 H và 13 C-NMR với kỹ thuật 1D và 2D đã xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được là: β-Sitosterol, β-Sitosterol-glicosid , Amít béo mạch dài H7, 3-hiđroxi taraxerol, 3-oxo Friedelan, Este béo mạch dài. 4. Lần đầu tiên từ cây Erythropalum scandens Blume đã phân lập và xác định được cấu trúc của 2 tritecpenoit là 3-hiđroxi taraxerol và 3-oxo Friedelan. 5. Các số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất LEH3 cho phép khẳng định LEH3 là một tritecpen-glucosid 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tiếng Việt: 1. Võ văn Chi (1999) “Từ điển cây thuốc Việt Nam” Nxb Y học –TPHCM, 1999, trang 383. 2. Phạm Hoàng Hộ (2003) “ Cây cỏ Việt Nam” Nxb trẻ, 2003, quyển II, trang 123 3. Nguyễn thị Hương (1999) “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây bồ khai” Luận văn thạc sỹ hoá học, Thái nguyên 2007, tr43 4. Đỗ tất Lợi (1999) “ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” Nxb Y học Hà nội, 1999. 5. Dương bích Mai (2007) “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đùm đũm (Rubus cochinnensis tratt.), họ Rosaceae ở Cẩm phả - Quảng Ninh” Luận văn thạc sỹ hoá học, Thái Nguyên 2007, tr. 10,11,12,48 6. Đoàn thanh Tường (2001) “ Nghiên cứu một số thành phần hóc học của cây sài hồ nam (pluchea pteropoda hemls.,) và cây cúc tần (Pluchea indica.) less., Việt nam” Luận án tiến sỹ hoá học, Hà nội, 2001, tr.20. B. Tài liệu tiếng Anh: 7. Agrawal P.K., Jain D.C., Pathak A.K. (1995). NMR spectral investigation. Part 37-NMR spectroscopy of steroloit of steroliodal sapogenins and steroidal saponins: an update. Magnetic Resonance Chemistry, p.923-953. 8. Bao-Zhi Li, Bin-Gui Wang and Zhong –Jian Jia. “ Pentacyclic tritecpennoids from Rubus Xanthocarpus “ Phytochem, vol 49,No, 8, pp.2477-2481.1998. 9. Byung Sun Min 3 1,3 , Hyun Ju Jung1 , Jun Sung Lee 1 , Young Ho Kim1 , Song Hea Bok2 , Chao Mei Ma , Norio Nakamura 3 , Masao Hattori3 , and KiHwan Bae 1 . “ Inhibitory Effect of Tritecpens from Crataegus pinatifida on HIV-I Protease” Planta Med.65(1999), p.374-375. 10. Chapman & Hall/CRC 14 DNP on CD-ROM, 1982-2006, Version 15:1. 11. Chawla A.S., Kaith B.S, Handa S. S (1990). Chemical Investigation and antifla- Flammtory activity of Pluchea lanceolata roots. India J. Chem., Sect. B., 29B (10), 918-922 CA., 1991, 114, 78645 f. 12. Chawla A.S., Kaith B.S, Handa S. S (1990). “Chemical Investigation and antifla- Flammtory activity of Pluchea lanceolata” Fitoterapia 1991, 62 (5), 441-444. CA., 1992, 116, 21141y. 13. Chawla A.S., Kaith B.S, Handa S. S (1990). “Chemical Investigation and antifla- Flammtory activity of Pluchea lanceolata flower” India J.Pharm. Sci., 54 2), 51-54. CA., 1992, 117, 66634a. 14. Dictionary of Natural Products on CD-ROM 15. Kath B. S. (1996). Neolupeol and anti-imflammatory action. Int. J. Pharmacorgn., 34(1). CA, 1996, 124, 306860m. 16. Toshihiro Akihisa, Kazuhiro Yamamoto, Toshitake Tamura, Yumikokimuara. “ Tritecpenoid Ketones from Lingnaia Chungii Mcclure: Arbornone, Friedelin and Glutinone “ Chem. Pharm. Bull. Vol 40, p. 789-791, (1992) 17. S.J. Torrance, R.M. Wiedhopf, J.R. Cole. “ Antitumor Agents from Jatropha macrohiza (Euhorbiaceae) III: Acetylaleuritolic Acid” Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, p.1348-1349. 18. Shashi B. Mahato and Asish P.Kundu. “ 13 C NMR spectra of pentacycic tritecpenoids- a comlpilation and some salient features” Phytochemistry, Vol 37, No.6, pp 1517-1575, 1994 19. Yoshiki Kashiwada, Hui-Kang Wang, Tsuneatsu Nagao, Susumu Kitanaka, Ichiro Yasuda, Toshihiro Fujioka, Takashi Yamagishi, L. Mark Cosentino, Mutsuo Kozuka, Hikaru Okabe, Yasumasa Ikeshiro, Chang-qi Hu, Eric Yeh, and Kuo-Hsiung Lee. “ Anti- AIDS Agent, 30, anti-HIV Activity of Oleanolic Acil, Pomolic Acid, Pomolic Acid, and Structuralally Related Triterpenoids” J.Nat. Prod. 1998, 61, 1090-1095 A. Website 20. Bách khoa toàn thư mở wikipedia. 21. http://huukimkt.vnweblogs.com/post/1912/7487/mien-ky-uc/xu-lang-co-mon-bo-khai.html http://www.sggp.org.vn/thongtincanuoc/2008/1/140086/ http://huukimkt.vnweblogs.com/post/1138/7487 http://omard.mard.gov.vn/omardforum/forum/viewthread?thread=129 15