Tài liệu Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất vacxin cúm ah1n109

i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Lê Văn Bé - Viện trưởng Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) Nha Trang, ThS. Dương Hữu Thái – Trưởng Phòng Vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị Phòng vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y Nha Trang đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên Hà Thị Hoa ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC.................................................................................................................. ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH......................................................................................... vi MỞ ĐẦU.................................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 ............................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM................................................................ 5 1.2.1. Vacxin cúm mùa ...................................................................................... 5 1.2.2. Các dạng vacxin cúm mùa....................................................................... 5 1.2.2.1. Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết) ................................................... 5 1.2.2.2. Vacxin sống giảm độc lực ............................................................... 7 1.2.3. Các công nghệ sản xuất vacxin cúm........................................................ 8 1.2.3.1. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi..................... 8 1.2.3.2. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào ..................................... 9 1.2.3.3. Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác .................... 10 1.2.4. Vacxin cúm A/H1N1/09 ........................................................................ 11 1.3. Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 ................................................. 14 1.3.2. Tiêu chuẩn của vacxin cúm ................................................................... 16 1.4. Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm ................................. 16 1.4.1. Beta- propiolactone (BPL) .................................................................... 16 1.4.2. Formalin (Formaldehyde)...................................................................... 17 1.5. Quy trình bất hoạt virus cúm ........................................................................ 21 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 22 2.1.1. Vật liệu................................................................................................... 22 iii 2.1.2. Dung dịch kháng nguyên virus .............................................................. 22 2.1.3. Thiết bị................................................................................................... 22 2.1.4. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 24 2.2.1. Một số phương pháp kiểm định (test).................................................... 25 2.2.1.1. Phương pháp xác định hiệu giá HA (HAU) ................................... 25 2.2.1.2. Phương pháp xác định hiệu lực bất hoạt (RIV) .............................. 26 2.2.1.3. Phương pháp kiểm tra hàm lượng HA (phản ứng SRID) ............... 27 2.2.1.4. Phương pháp xác định liều gây nhiễm trên trứng gà có phôi (EID50) ....................................................................................................... 28 2.2.2. Phương pháp lấy mẫu sau bất hoạt ........................................................ 29 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu chọn nồng độ formalin thích hợp ................. 29 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian bất hoạt .............. 30 2.2.5. Xây dựng quy trình bất hoạt .................................................................. 32 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ formalin bất hoạt ................................................. 33 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian bất hoạt............................................ 36 3.2.1. Kết quả khảo sát hiệu giá HA ................................................................ 37 3.2.2. Kết quả khảo sát EID50......................................................................... 38 3.2.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 nhóm nhiệt độ ............ 40 3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên (SRID).............................. 41 3.3. Xây dựng quy trình bất hoạt ......................................................................... 43 3.3.1. Khảo sát tính ổn định và hiệu quả của quy trình bất hoạt ..................... 44 3.3.2. Khảo sát tính an toàn của quy trình bất hoạt ......................................... 45 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 47 4.1. KẾT LUẬN................................................................................................... 47 4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT CAIV : Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine DNA : Deoxyribonucleic Acid DPT : Diptheria – Pertussis – Tetanus (Vaccine bạch hầu – ho gà – uốn ván) EID50 : Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 virus trên trứng gà) EU : Endotoxin Unit (đơn vị nội độc tố) HA : Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu) HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin) HI : Haemagglutination Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) IVAC : Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế NA : Neuraminidase (enzyme bề mặt virus cúm) NIBSC : National Insitute for Biological Sandards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh) PBS : Phosphat Buffer Saline (dung dịch đệm muối, Photphat) RNA : Ribonucleic Acid RIV : Residual Infectious Viruses (virus sống tồn lưu) SA : Sialic Acid SRID : Single Radial Immuno Diffusion (Khuyếch tán miễn dịch vòng đơn) TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới TIV : Trivalent - inactivated Influenza Vaccine (Vaccine cúm ba thành phần bất hoạt) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin ..............................................7 Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến 96 giếng ................................26 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát HA của 3 lô thử nghiệm..............................................33 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát RIV của 3 lô thử nghiệm.............................................34 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát SRID của 3 lô thử nghiệm ..........................................35 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian khác nhau ở 3 lô thử nghiệm ......................................37 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát EID50 của 3 lô thử nghiệm ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt........................................................39 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 lô sản xuất ...................40 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) của 3 lô ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt .........................41 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát HA, SRID, RIV và EID50 của 3 lô sản xuất ở các thời gian khác nhau trong quy trình bất hoạt ...................................44 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, Endotoxin và Ovalbumin của 3 lô sau khi bất hoạt .........................................................................45 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A .....................................................................3 Hình 1.2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt ...........................................6 Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi..........14 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09.......................................21 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .............................................................................24 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ formalin .................................30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian bất hoạt ..............31 Hình 3.1 Hiệu suất bất hoạt trung bình của 3 lô......................................................35 Hình 3.2 Hàm lượng trung bình kháng nguyên HA của 3 lô thử nghiệm (µg/ml) .........42 Hình 3.3 Quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 ................................................43 1 MỞ ĐẦU Dịch cúm A/H1N1/09 bùng phát đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng 3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Chỉ tính đến ngày 17/6/2009, dịch xảy ra trên 86 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620 người mắc và có 167 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico: 08 người và Mỹ: 44 người; Về sau dịch lan nhanh ra hầu hết các nước trên thế giới với số người chết nhiều hơn. Điểm đặc biệt của đại dịch cúm này là tốc độ lây lan từ người sang người rất nhanh và những trường hợp tử vong thường rơi vào lứa tuổi từ 20 - 45 tuổi cho thấy tính chất nguy hiểm của dịch. Trước tình hình này, WHO (Tổ chức Y tế Thế giới) đã phát triển mở rộng chương trình phòng chống cúm toàn cầu nhằm tìm ra biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát đại dịch. Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm soát và đẩy lùi dịch bệnh nói chung và bệnh cúm nói riêng. Tuy nhiên, việc sản xuất ra một lượng vacxin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng trên toàn thế giới còn gặp nhiều khó khăn do năng lực sản xuất ở các quốc gia không đồng đều và những thách thức về công nghệ. Để giải quyết vấn đề này, các nhà sản xuất vacxin tập chung đầu tư nghiên cứu nhiều dạng vacxin cúm khác nhau: Vacxin cúm bất hoạt, vacxin sống và vacxin tái tổ hợp. Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin cúm A/H1N1/09 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm. Hiện nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất hoạt virus cúm nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng là vấn đề được quan tâm đầu tư. Formalin là hóa chất được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều loại vacxin cho người. Tuy nhiên xác lập quy trình bất hoạt đối với mỗi loại vacxin, sinh phẩm cần được xác định các thông số cụ thể như nồng độ formalin thích hợp là bao nhiêu và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bất hoạt để 2 đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tàì: “Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09”. Mục tiêu của đề tài 1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09. 2. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 Virus cúm A có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy). Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ capsid, vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [12]. Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A Capsde là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome. Capsome lại được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc gọi là protome. Vỏ capsid của virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus. Màng ngoài có bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất 4 cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các thành phần khác của virus. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm. Vật liệu di truyền (còn gọi là hệ gene) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, Pa, Pb1 và Pb2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus. Bộ gen nhiều phân đoạn của virus là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng virus mới. Có hai kiểu thay đổi kháng nguyên là hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) và biến thể kháng nguyên (antigenic driff). Hoán vị kháng nguyên là sự thay đổi di truyền quan trọng do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra. Biến thể kháng nguyên là do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin dẫn đến sự thay đổi một số acid amin trong protein haemagglutinin [14], [23], [25]. Tính chất kháng nguyên Haemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên quan trọng nhất, quyết định độc tính của virus cúm. * Haemagglutinin (HA) HA là một glycoprotein, dạng hình nấm, nhô ra từ màng lipid của virus, phía ngoài có tán hình cầu. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của các động vật máu nóng. HA mang tính chất kháng nguyên và là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định đến tính độc của virus cúm, có khả năng gắn vào thụ thể đặc hiệu của tế bào chủ. Trong quá trình gây bệnh, virus cúm có 16 loại HA, được kí hiệu từ H1 đến H16. * Neuraminidase (NA) NA là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của virus cúm. NA có hai phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng, vùng còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virus. NA có chức năng phân cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc Dglactosesamine của acid sialic. Phản ứng này cho phép virus vượt qua lớp niêm dịch 5 để tới được các tế bào biểu mô của đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Đồng thời việc loại bỏ acid sialic của phân tử NA giúp các virion mới được tổng hợp phóng thích ra ngoài tế bào và gia tăng khả năng gây nhiễm trùng. Virus cúm có 9 phân type NA, được kí hiệu từ N1 đến N9. Cho đến nay chỉ có N1, N2 được xác định liên quan đến các vụ dịch ở người [14], [25]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM 1.2.1. Vacxin cúm mùa Năm 1931, kỹ thuật nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi được phát triển. Năm 1941, vacxin cúm bất hoạt lần đầu tiên được sản xuất bằng kỹ thuật này và được phép sử dụng cho quân đội Mỹ trong chiến tranh thế giới thứ 2. Cho tới nay, vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi. Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và vacxin sống. Ngoài ra, vacxin cúm còn được phát triển để sản xuất trên các dòng tế bào, bao gồm: MDCK, Vero và PER.C6. Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh và đã được chấp nhận để sản xuất vacxin cho người. Nhờ những tiến bộ của khoa học công nghệ, thế giới đang tiến tới mực tiêu sản xuất vacxin an toàn hơn và đại trà hơn [9], [25]. 1.2.2. Các dạng vacxin cúm mùa Vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi. Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và vacxin sống giảm độc lực. 1.2.2.1. Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết) Hầu hết các loại vacxin cúm hiện nay trên thế giới là vacxin bất hoạt 3 thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là H1N1, H3N2 và một chủng virus cúm B. Mỗi liều vacxin chứa 15µg kháng nguyên mỗi chủng virus thành phần. 6 TIV gồm các loại: Vacxin toàn thân, vacxin tiểu phần và vacxin kháng nguyên tinh chế. - Vacxin toàn phần virus (whole virus vaccine) là vacxin thế hệ thứ nhất được sản xuất trên trứng gà có phôi, virus được bất hoạt bằng formalin hoặc βpropiolactone. Đây là loại vacxin an toàn, dung nạp tốt, hiệu quả bảo vệ 75 – 90 %. - Vacxin mảnh virus (split vaccine) là vacxin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản xuất như vacxin toàn thân nhưng không nguyên vẹn hạt virus mà được tách ra từng mảnh kháng nguyên bề mặt, nucleocapsid, các protein nhờ công đoạn dùng hỗn hợp hóa chất tây rửa tách bớt các lipid vỏ. - Vacxin kháng nguyên tinh chế (subunit vaccine) là thế hệ thứ ba (1976) được sản xuất như vacxin tiểu phần nhưng quy trình tinh chế nghiêm ngặt hơn vì thế thành phần chính là các protein HA và NA tinh chế, các thành phần khác của virus bị loại bỏ. Các kháng nguyên tinh chế này được hoàn nguyên trong các dung dịch lipid tổng hợp virosome. Công thức virosome hiện nay đã được cấp phép tại Châu Âu. Để tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch, hiện nay người ta thêm các tá chất trong công thức sản xuất vacxin cúm: MF-59, hợp chất nhôm. Đây là hai loại tá chất được cấp phép sử dụng cho vacxin cúm ở Mỹ và Châu Âu [7], [9]. Hình 1. 2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt 7 1.2.2.2. Vacxin sống giảm độc lực Vacxin sống nhược độc thích ứng lạnh (kí hiệu CAIV) là vacxin khí dung, miễn dịch bằng đường mũi, được sản xuất từ chủng virus có đặc tính thích ứng lạnh do đột biến. Chủng mới sao chép thuận lợi ở 250C nhưng trong cơ thể người (nhiệt độ 35 - 370C) virus sẽ bị nhược độc. Vacxin CAIV hiệu quả cao, miễn dịch liều đơn 0,5 ml và chỉ sử dụng cho người từ 5 - 49 tuổi. CAIV được sử dụng ở liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm và tại Mỹ năm 2003 cũng được cấp phép xử dụng. Những nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất vacxin DNA từ các mảnh gene của virus: gene HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virus cúm A [7], [21]. Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin [7] Loại vacxin Ưu điểm Nhược điểm Đơn giản, dễ sản xuất. Có thể gây ra bệnh nhẹ, có thể Vacxin sống Giá thành rẻ, tương đối ổn định. lây nhiễm virus. giảm độc lực Gây miễn dịch kéo dài. Cần bảo quản lạnh để virus Không cần tiêm nhiều lần. không chết. Đơn giản, dễ sản xuất. Cần nuôi tạo lượng virus lớn, có Gía thành rẻ, ổn định. thể cần tá chất bổ trợ. Khả năng lây nhiễm virus sống Tính miễn dịch có thể không cao. rất thấp. Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần. Vacxin bất hoạt Có thể bị nhiễm bệnh. Vacxin DNA Gây đáp ứng miễn dịch hướng Nghiên cứu phức tạp hơn, chi tới từng phần của virus. phí cao. Không trở lại thành virus để lây Cần tá chất bổ trợ. nhiễm, an toàn. Tính miễn dịch có thể không cao. Khả năng lây nhiễm virus sống Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần. rất thấp. Ổn định, dễ bảo quản. 8 1.2.3. Các công nghệ sản xuất vacxin cúm Cả hai loại vacxin cúm bất hoạt và sống giảm độc lực đều có thể được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi và trên nuôi cấy tế bào. 1.2.3.1. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi Nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi là phương pháp truyền thống, an toàn, tin cậy và đã được sử dụng để sản xuất vacxin cúm với quy mô công nghiệp trong hơn 60 năm qua, chưa có phương pháp nào thay thế được. Trứng gà có phôi 9 - 12 ngày tuổi được sử dụng để cấy virus. Sau khi gây nhiễm virus, ủ trứng ở nhiệt độ 33,50C, có độ ẩm 60 - 70%. Sau 72 giờ chuyển trứng vào buồng lạnh (40C) để qua đêm nhằm diệt phôi và làm co mạch máu. Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh khiết virus và bất hoạt [1], [5]. * Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi - Đây là phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi hiện nay. Với công nghệ này, hàng trăm triệu liều vacxin cúm đã được sản xuất và được sử dụng an toàn trên thế giới. - Những chủng virus dùng trong sản xuất vacxin cúm đã được tối ưu hóa để phát triển trên trứng. Vấn đề giấy phép cũng như những phân tích cần thiết đã được thiết lập và có những chứng cứ thuyết phục. - Vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui mô vừa và nhỏ, giá thành vacxin tương đối rẻ. * Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi - Đây là một dây chuyền riêng biệt cho việc sản xuất chỉ một loại vacxin cúm. Nếu nhu cầu vacxin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ sở vật chất đã được nâng cấp sang sản xuất loại vacxin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi đầu tư mở rộng sản xuất. - Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà. 9 - Chất thải rắn trong qui trình sản xuất sẽ chiếm 80% lượng nguyên liệu cung cấp. Cần phải có hệ thống sử lý thích hợp. - Năng suất vacxin sản xuất trên trứng: mỗi một chủng virus có những đặc tính phát triển trên trứng khác nhau [1], [3], [5]. 1.2.3.2. Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào Hiện nay có một số dòng tế bào đang được dùng trong nghiên cứu sản xuất vacxin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin-Darby) được phân lập vào năm 1958 và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vacxin cho súc vật; Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) đã được dùng để sản xuất vacxin bại lệt trong hơn 20 năm; PER.C6 (tế bào võng mạc người) là dòng tế bào mới được sử dụng trong nuôi cấy tế bào. Các dòng tế bào khác: Một vài dòng tế bào khác có thể phù hợp đối với việc sản xuất vacxin cúm. Tế bào nguyên bào sợi phôi gà (đã được dùng để sản xuất vacxin sởi) có năng suất tốt với virus cúm. Dòng tế bào Vivalis có nguồn gốc từ gà (Nantes, Pháp), đang được nghiên cứu trong vài năm gần đây cũng cho thấy có nhiều hứa hẹn [1], [3]. * Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào Nuôi cấy virus cúm trên tế bào sẽ khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi. Những thuận lợi của phương pháp này so với phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi bao gồm: - Không cần phải dùng đến lượng trứng gà lớn. Nguồn cung cấp nguyên liệu bảo đảm và có thể dự trữ. - Quy trình này có thể tăng quy mô lên nhanh chóng do sử dụng được công nghệ trong nhà máy sản xuất các vacxin khác trên tế bào. - Nâng cao khả năng vô trùng trong quá trình sản xuất. Tránh được nguy cơ trứng có phôi nhiễm retrovirus. - Vacxin không có thành phần trứng nên tránh được nguy cơ dị ứng cho những người có tiền sử dị ứng với protein của trứng. 10 * Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào - Chi phí sản xuất vacxin cúm trên tế bào cao hơn so với phương pháp truyền thống. Các quy trình kiểm định phức tạp hơn như phải phát hiện DNA của tế bào chủ. Những kỹ thuật này đòi hỏi phương tiện và phải chuẩn thức. - Tốn thời gian và chi phí để phát triển đủ lượng tế bào cho sản xuất từ ngân hàng tế bào gốc. - Các tế bào dùng để sản xuất vacxin thường yêu cầu phải có hồ sơ mô tả toàn bộ đặc tính của tế bào và hồ sơ về ngân hàng tế bào gốc của nhà sản xuất, mà chúng thường được cấp sở hữu trí tuệ nên đòi hỏi phải xin giấy phép [1], [3], [24]. 1.2.3.3. Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác [5], [15] - Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà Đây có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vacxin cúm, áp dụng đối với các nhà sản xuất đã sử dụng phương pháp này trong sản xuất các vacxin khác. Phương pháp sản xuất này cần sự đầu tư vừa phải về kinh phí và thời gian. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng sạch SPF, huyết thanh bào thai bê … - Vacxin DNA Vacxin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng đạn bọc DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh). Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng cho nên vacxin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn. Tuy nhiên quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi loại vacxin này. - Vacxin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp Kháng nguyên HA được sản xuất bởi hệ thống virus baculo (hãng Protein Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong thực vật cấy DNA của virus (hãng Microbix, Mỹ). Ưu điểm của dạng vacxin này là năng xuất kháng nguyên cao và sản xuất nhanh. Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế. 11 1.2.4. Vacxin cúm A/H1N1/09 Người ta nhận thấy rằng vacxin phòng đại dịch cúm có công hiệu bảo vệ mạnh khi được tiêm trước hoặc gần thời điểm dịch bùng phát. Vì vậy, cần chế tạo và sản xuất vacxin đặc hiệu dành cho virus cúm A/H1N1/09 càng sớm càng tốt cũng như có những chiến dịch tiêm phòng đúng lúc đúng chỗ khi đại dịch xảy ra. Để đối phó hiệu quả với đại dịch, TCYTTG thúc đẩy việc sản xuất vacxin cúm ở các nước đang phát triển bằng hàng loạt giải pháp: chuyển giao công nghệ, cấp kinh phí trợ cấp xây dựng cơ sở sản xuất và đào tạo cán bộ, tổ chức các hội nghị bàn về việc thúc đẩy năng lực sản xuất vacxin trên phạm vi toàn thế giới [18], [19], [20]. Các chuyên gia đã tổng kết các công nghệ khả thi nhằm sớm đưa sản phẩm ra thị trường. Tựu chung, nguyên lý công nghệ phải trải qua mấy công đoạn chính sau: - Thống nhất các chủng giống (do những phòng thí nghiệm chuẩn của TCYTTG cung cấp). - Nuôi cấy virus (trên trứng gà có phôi hoặc tế bào). - Thu kháng nguyên (toàn tế bào bất hoạt, mảnh kháng nguyên hoặc kháng nguyên tinh chế, vacxin virus sống nhược độc). - Tá dược: Phổ biến dùng muối nhôm, nhũ tương dầu trong nước (MF-59, Squalence…). - Công thức hỗn hợp: Hàm lượng kháng nguyên (từ 3,7 µg HA đến 15 µg/liều). - Công ty CSL Biotherapies (Úc, Arkville) sản phẩm loại đơn giá - không dạng split từ chủng NYMC X-179 (USA-New york Medical College) trên trứng gà có phôi, bất hoạt bằng thiomersal (0,01% w/v), hàm lượng 15 µg/liều 0,25 ml thử cho người từ 15 - 64 tuổi (240 người) chia 2 nhóm dưới 50 và trên 50 tuổi, liều 15 30 µg/ngẫu nhiên, tiêm bắp, lấy máu làm HI (Haemagglutination Inhibition) và trung hoà vi lượng sau 21 ngày, mức kháng thể HI = 1/40 làm chuẩn. Phản ứng phụ 64,7% ở mức trung bình. 12 Những thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả vacxin cúm A/H1N1 đang được thực hiện ở nhiều nơi, có 45 nghiên cứu đã được tiến hành tính đến ngày 30/9/2010 [17], [28]. Vacxin của hãng CSL sử dụng chủng NYMC X-179A đang được đánh giá thực địa ở giai đoạn II. Vào ngày thứ 21 sau khi tiêm vacxin những người tình nguyện được lấy máu nhằm xác định mức chuyển đổi huyết thanh (HI) kết quả cho thấy: nhóm người được nhận liều 15 µg có 96,7% (khoảng tin cậy 95% là 91,7 98,7) đối tượng đạt HI 1: 40; nhóm người được nhận liều 30 µg có 93,3% (khoảng tin cậy 95% là 87,4 - 96,5) đối tượng đạt HI 1: 40. Chủng vacxin của hãng Novatis được tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược, những đoạn gen mã hoá cho Haemagglutinin, Neuraminidase và Polymerase B1 có nguồn gốc từ chủng A/California/7/2009. Những gen còn lại được lấy từ chủng virus cúm A/PR8/8/34. Vacxin chứa các kháng nguyên bề mặt của virus cúm, chất bảo quản thiomersal được ly tâm loại bỏ còn lại rất ít (≤ 1 µg thủy ngân/liều 0,5 ml, ovalbumin ≤ 1 µg, polymyxin ≤ 3,75 µg, neomyxin ≤ 2,5 µg, ß-propiolactone < 0,5 µg và nonylphenol ethoxylate < 0,015%). Vacxin có hoặc không kèm tá chất MF-59 một loại nhũ tương làm từ squalene [17]. Tá chất MF-59 tạo ra đáp ứng kháng thể trong vòng 14 ngày sau khi thực hiện 1 liều tiêm duy nhất. Nghiên cứu được thiết kế để đánh giá thực địa giai đoạn 1 với 175 người tham gia (18 - 50 tuổi). Các phác đồ tiêm như sau: 2 mũi vacxin không hấp phụ được tiêm bắp (7,5 µg HA) vào 2 cánh tay hoặc 1 mũi tiêm vào ngày đầu, mũi còn lại cách mũi đầu 7, 14 hoặc 21 ngày. - 2 mũi tiêm vacxin hấp phụ tá chất MF-59 (3,75 µg HA /liều). - 2 mũi tiêm 7,5 µg HA và 15 µg HA được tiêm cách nhau 21 ngày. - Vacxin của hãng Sanofi-Aventis loại bất hoạt một thành phần dùng tiêm bắp sản xuất từ trứng gà có phôi. Vacxin chứa 15 µg HA của chủng virus A/California/07/2009 (H1N1) cho liều 0,5 ml. Chất ổn định được thêm vào là gelatin 0,05%. Mỗi liều vacxin 0,5 ml chứa một lượng formalin tồn dư không quá 100 µg, 13 polyethylene glycol ether (≤ 0,02%) và sucrose (≤ 2,0%). Chất bảo quản thimerosal được phép có mặt trong vacxin đa liều, hàm lượng 25 µg. Vacxin của hãng GSK (Bỉ) là loại mảnh kháng nguyên (split) một thành phần (monovalent) được tạo ra từ chủng A/California/07/2009 (X-179A) cũng được sản xuất trên trứng gà có phôi. Vacxin chứa 3,7 µg HA và có kèm tá chất ASO3, một loại nhũ tương làm từ hợp chất squalene, trong thành phần vacxin có thiomersal. Ở Việt Nam, hiện có 3 nơi được phép tiến hành nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09. Tại Trung tâm Nghiên cứu sản xuất Vắcxin và Sinh phẩm Y Tế (Polyvac) người ta đang tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin bất hoạt từ chủng X-179 A bằng tế bào Vero hấp phụ trên hydroxit nhôm. Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (Vabiotech - Hà nội) thực hiện đề tài cấp nhà nước xây dựng qui trình sản xuất vacxin A/H1N1/09 trên tế bào thận khỉ cũng đạt được những thành công bước đầu [1], [11]. Viện Vắcxin và Sinh Phẩm Y tế (IVAC) đã sản xuất thành công trên quy mô thí nghiệm và đã phát triển sản xuất trên quy mô lớn. 14 1.3. Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 [5], [23] Chủng Virus Gây nhiễm Trứng gà có phôi Thu gặt Dịch niệu nang Tinh sạch Sản phẩm giai đoạn 1 Siêu ly tâm phân đoạn sucrose S¶n phÈm giai ®äan 2 Bất hoạt, ly giải, lọc vô trùng Vacxin Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi