Phát hiện Mycobacterium Tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng kỹ thuật Real-time PCR

  • Số trang: 118 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 42 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR. Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS . TS : Nguyễn Thái Sơn Hà Nội – 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ................................................................3 1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam ...........................................3 1.1.1 Trên thế giới ................................................................................................3 1.1.2 Việt Nam ....................................................................................................4 1.2 Bệnh lao .............................................................................................................6 1.2.1 Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao .................7 1.3 Vi khuẩn lao ....................................................................................................11 1.3.1 Phân loại vi khuẩn lao..............................................................................11 1.3.2 Hình thể vi khuẩn lao ................................................................................12 1.3.3 Cấu trúc vi khuẩn lao ................................................................................13 1.3.4 Đặc điểm sinh học và nuôi cấy vi khuẩn lao ...........................................16 1.3.5 Cơ chế tác động của isoniazid và cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao ...........................................................................................................................18 1.3.6 Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao 20 1.3.7 Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao ............................................................................................................21 1.4 Các phương pháp xác định lao kháng thuốc ..................................................23 1.4.1 Phương pháp xác định kiểu hình .............................................................23 1.4.2. Các phương pháp nuôi cấy cải tiến ..........................................................26 1.4.3 Một số phương pháp kiểu hình mới ........................................................28 1.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen ................................................................31 Chƣơng 2VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................41 2.1 Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................41 2.1.1 Vật liệu sinh học .......................................................................................41 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................42 2.1.3 Hóa chất sử dụng ......................................................................................43 2.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................43 i 2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................44 2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb [3,6,8,10]. .........................................................................44 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm ..................................................46 2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa các điều kiện phản ứng real-time PCR ..............48 2.3.4 Thiết lập quy trình chẩn đoán và thực hiện trên mẫu bệnh phẩm ............53 Chƣơng 3KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................54 3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế ..................................54 3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide .................................................54 3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide ..............................................................56 3.1.3 Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên ly‎thuyết................................59 3.2 Đánh giá khả năng bắt cặp của hệ mồi và mẫu dò ..........................................66 3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng .................................................................68 3.3.1 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1 ..............................................................68 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2 ..............................................................69 3.3.3 Kháo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 ..............................................................70 3.3.4 Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 ..............................................................71 3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng ...............................................................72 3.4.1 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1 ............................................................73 3.4.2 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2 ............................................................73 3.4.3 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3 ............................................................74 3.4.4 Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4 ............................................................74 3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò) ................................................................75 3.5.1 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1 ......................................................75 3.5.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3 ......................................................76 3.5.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4 .....................................................77 3.6 Khảo sát nồng độ Mg++ ...................................................................................77 3.6.1 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1 ..........................................................77 3.6.2 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2 ..........................................................78 3.6.3 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3 ..........................................................78 ii 3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4 ..........................................................79 3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng.....................................................................79 3.7.1 Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm ...................................80 3.7.2 Khảo sát độ lặp lại của các phản ứng trong các lần thí nghiệm khác nhau .....83 3.8 Khảo sát độ nhạy của phản ứng .......................................................................87 3.8.1 Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid ........................................87 3.8.2 Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin .......................................88 3.8.3 Phản ứng 3 và phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambuton ............89 3.9 Khảo sát độ đặc hiệu của các phản ứng ...........................................................90 3.9.1 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid ...... 91 3.9.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin .....91 3.9.3 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol .........................................................................................................92 3.10 Quy trình phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB.93 3.10.1 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt ................................................93 3.10.2 Quy trình xác định các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol ..94 3.11 Ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm......................................................94 3.11.1 Mẫu bệnh phẩm ......................................................................................94 3.11.2 Ứng dụng quy trình trên 50 mẫu bệnh phẩm lao .................................... 95 3.11.3 Xác định độ đồng thuận của phương pháp real time PCR với phương pháp kháng sinh đồ.................................................................................................... 97 CHƢƠNG 4KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................101 4.1 Kết luận .........................................................................................................101 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................102 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................103 iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFB : Acid Fast Bacilli AMK : amikacin BCG : Bacillus Calmette-Guérin CPM : Capreomycin CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia DNA : Deoxyribonucleic acid DR : Trình tự lặp lại trực tiếp (Directed Repeat) EMB : Ethambutol ETH : Ethionamide FQs : Fluoroquinolones INH : Isoniazid KM : Kanamycin MDR-TB : Lao kháng đa thuốc (multidrug-resistant TB) MIC : Minimum inhibitory concentration MIRU-VNTR : Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable Number of Tandem Repead MTB : Mycobacterium tuberculosis MTBC : M. tuberculosis complex PCR : Polymerase Chain Reaction PZA : Pyrazinamide RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RIF : rifampin RNA : ribonucleic acid SM : Streptomycin ST : spoligotyping TB : Tuberculosis WHO : Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) XDR-TB : Lao đa kháng thuốc mở rộng (extensively drug resistant TB) iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí các gen liên quan đến kháng thuốc ở MTB (Multidrug-resistance) 11 [11,12,26,28] .............................................................................................................11 Bảng 1.2 Nồng độ đánh giá của các loại thuốc kháng sinh chính trong ...................25 phương pháp tỷ lệ[5] .................................................................................................25 Bảng 2.1 : Trình tự và vị trí các mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài ......................42 Bảng 3.1 : Bảng thông số kỹ thuật của mồi và mẫu dò.............................................57 Bảng 3.2: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 1 – xác định đột biến gen katG tại vị tí 315 ...................................................................................58 Bảng 3.3: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 2- xác định đột biến gen rpoB tại vị trí 516 .......................................................................................58 Bảng 3.4: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 3- xác định đột biến gen emb306 (A→G) ..........................................................................................58 Bảng 3.5 : Kiểm tra năng lượng liên kết hetero –dimer trong phản ứng 4 – xác định đột biến gen emb306 (G→A) ....................................................................................58 Bảng 3.6: Bảng kết quả thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1 ..........................69 Bảng 3.7 : Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2 ......................................70 Bảng 3.8: Kết quả thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 ...................................71 Bảng 3.9: Bảng thông số kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 ..........................72 Bảng 3.10: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 1...................80 Bảng 3.11: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 2...................81 Bảng 3.12: Bảng chi tiết kết quả khảo sát về độ lặp lại của phản ứng 3...................82 Bảng 3.13: Bảng chi tiết kết quả khảo sát độ lặp lại phản ứng .................................82 Bảng 3.14: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 .........................83 Bảng 3.15: Hệ số biên thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 2 .........................84 Bảng 3.16: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 .........................85 Bảng 3.17: Hệ số biến thiên giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 4 .........................86 Bảng 3.18: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 1 ..............................................87 Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 ..............................................88 Bảng 3.20: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4 .............................................90 Bảng 3.21 : Bảng thành phần phản ứng ....................................................................93 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47]....................................................4 Hình 1.2 : Sơ đồ thống kê số ca nhiễm mới lao bình thường và lao kháng thuốc tại Việt Nam[47] ..............................................................................................................6 Hình 1.3. Cơ chế phát triể n tin ́ h kháng thuố c ở vi khuẩ n lao [33]............................10 Hình 1.4. Vi khuẩn lao nhuộm soi bằng phương pháp Ziehl – Neelsen[50] ............13 Hình 1.5 Mô hình hóa cấu trúc màng vi khuẩn lao[51] ............................................13 Hình 1.6. Các ống MGIT cho kết quả dương tính và âm tính ..................................28 Hình 1.7. Thử nghiệm khử nitrate với các chủng nhạy và kháng thuốc ...................30 (GC: growth control) .................................................................................................30 Hình 1.8 : Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp dideoxynucleotid ..33 Hình 1.9. Sản phẩm của phản ứng MAS-PCR trên đoạn gen rpoB ..........................36 Hình 1.10. Sản phẩm của phản ứng MAS-PCR trên đoạn gen KatG .......................37 Hình 2.1 : Sơ đồ quy trình tách chiết DNA vi khuẩn lao từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng ...48 Hình 2.2 : các giai đoạn trong phản ứng Real-time PCR ..........................................49 Hình 3.1 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng1 bằng phần mềm Annhyb ......................................................................................................................54 Hình 3.2 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb ......................................................................................................................55 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb ......................................................................................................................55 Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 4 bằng phần mềm Annhyb56 Hình 3.5 : Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315F đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI) ............................................................................59 Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315R đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI) ............................................................................60 Hình 3.7: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò katG 315 đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) .............................................................................61 Hình 3.8: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi rpoB-516F đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) ...................................................................62 vi Hình 3.9 : Khả năng đặc hiệu của mồi ngược rpoB-516R đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) .........................................................62 Hình 3.10 :Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò rpoB-516 đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) ....................................................................63 Hình 3.11: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306F1 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) ...................................................................63 Hình 3.12: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306R12 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) ...................................................................64 Hình 3.14: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306-F345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) ..........................................................65 Hình 3.15: Khả năng đặc hiệu của mồi ngược emb 306-R3 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) .........................................................65 Hình 3.16: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò 306-345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI) .............................................................................66 Hình 3.14c. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của các hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến ......................................................................................................67 Hình 3.14a. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến katG/315/AGCACC. ........................................................................67 Hình 3.14b. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến rpoB/516/GACGTC. ........................................................................67 Hình 3.15: Hình ảnh khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng 1 ......................................68 Hình 3.16: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng 2 .....................................................70 Hình 3.17: Bảng thông số khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3 .....................................70 Hình 3.18: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4 ................................................71 Hình 3.19: Kết quả khảo sát nồng độ mồi của phản ứng phát hiện đột biến kháng Isoniazid ở gen katG .................................................................................................73 Hình 3.20 : Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Rifampin tại gen rpoB ...............................................................................................73 Hình 3.21: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-GTG).........................................................................74 Hình 3.22: Kết quả khảo sát nồng độ mồi phản ứng xác định đột biến kháng Ethambutol tại gen emb(ATG-ATA) ........................................................................74 vii Hình 3.23 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1 .......................................75 Hình 3.24 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 2 ......................................76 Hình 3.25: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3 ........................................76 Hình 3.26 : Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4 .......................................77 Hình 3.27 : Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1 ...........................................77 Hình 3.28: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2 ...........................................78 Hình 3.29: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3 ...........................................78 Hình 3.30: Kết quả khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4 ...........................................79 Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 1 ............................................80 Hình 3.31: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 2 ............................................81 Hình 3.32: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 3 ............................................81 Hình 3.34: kết quả khảo sát độ lặp lại của phản ứng 4 .............................................82 Hình 3.34 : Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 1 ...................................83 Hình 3.36: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nghiệm của phản ứng 3 ....................................85 Hình 3.37: Độ lặp lại giữa 3 lần thí nhiệm của phản ứng 4 ......................................86 Hình 3.38: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng .................................................87 Hình 3.39: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 2 ..............................................88 Hình 3.40: Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng 3 và 4 .............................................89 Hình 3.42: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2 .........................................91 Hình 3.43: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 .................................92 Hình 3.44: Quy trình xác định đột biến kháng thuốc ở lao .......................................94 viii MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn gây bệnh lao đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay. Những liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh tỏ ra hiệu quả từ những năm 1960. Tuy nhiên, trong những thập niên 90 đến nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh, đe dọa hàng triệu người trên thế giới. Y học thế giới những năm gần đây đã ghi nhận chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng đa thuốc mới gọi là lao siêu kháng thuốc. Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn mới này cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng như trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần. WHO ước tính, đến nay đã có 27 ngàn ca bệnh lao mới kháng thuốc ở 41 quốc gia [47]. Việc điều trị cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc hết sức nghiêm ngặt, cần phải theo dõi liên tục trong 2 năm. Một số bệnh nhân sau một thời gian uống thuốc, thấy mình khỏe và không có triệu chứng gì, cho rằng mình đã khỏi bệnh nên tự ý bỏ trị lao. Bệnh nhân không biết rằng vi trùng lao “sống dai” và rất nguy hiểm. Sau một thời gian “nằm ẩn mình” và tìm cách chống lại thuốc lao, chúng sẽ hoạt động gây bệnh trở lại. Lúc này, người bệnh trở nên bị lao kháng thuốc, và bệnh sẽ nguy hiểm hơn lúc phát bệnh lao ban đầu. Ngoài ra, cũng có những bệnh nhân bị khó chịu do tác dụng phụ của thuốc lao trong quá trình điều trị, nhưng không đến tái khám để bác sỹ điều chỉnh thuốc, mà tự bỏ trị nửa chừng. Cũng có những bệnh nhân uống thuốc lao không đều đặn, hay uống không đủ liều thuốc…. Tất cả những trường hợp này đều tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng lao trở nên kháng thuốc. Nếu điều trị không đầy đủ, vi khuẩn kháng thuốc càng mạnh hơn và khả năng hồi phục càng trở nên mong manh. Và sẽ cực kỳ nguy hiểm cho cộng đồng, bởi lao kháng đa thuốc đã rất khỏe sẽ từ bệnh nhân lây lan trong cộng đồng do bị phát tán trong không khí, môi trường sinh hoạt [26,28]. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu [2]. Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 1 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn bệnh là 192 ca/nghìn dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là 2.7%, và trong tổng số ca đã qua điều trị là 19%. Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký điều trị lao tại TP. HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị [1,2]. Ở nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng 3 loại thuốcchủ yếu trong điều trị lao là Rifampin, Isoniazid, và Ethambutol. Để phát hiện lao đa kháng thuốc có các phương pháp như : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch cơ thể… và làm kháng sinh đồ lao . Quá trình nuôi cấy vi trùng và thử kháng sinh đồ này mất khoảng 2 đến 3 tháng mới có kết quả. Hiện nay, ở Việt Nam đã có xét nghiệm giúp phát hiện kháng thuốc sớm và nhanh hơn là Hain test (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 5 ngày) và Xpert MTB/RIF (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 2 giờ). Tuy nhiên, hai xét nghiệm này có giá thành đắt, và không dùng phổ biến cho mọi bệnh nhân bị lao[5]. Hiện nay các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ sinh học đang mang tới rất nhiều lợi ích ứng dụng trong y học. Một trong số đó là kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-time PCR để phát hiện các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol trên vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì những lý do trên nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “ Phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng kỹ thuật real-time PCR”. Đề tài nhằm các mục tiêu sau : 1. Xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol (đột biến gen emb tại codon 306 với 2 loại: ATG-GTG (Met306Val) và ATG-ATA(Met306Ile) ) . 2. Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm thực tế. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 2 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.1 Trên thế giới Bệnh lao đã tồn tại rất lâu cùng con người, khoảng 150000 – 200000 năm. Mặc cho mọi cố gắng của con người trong việc kiểm soát và khống chế bệnh lao, hàng năm vẫn có 8 - 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu người bị chết do căn bệnh này. Tỷ lệ mắc lao trên thế giới vẫn tiếp tục tăng 1% mỗi năm. Trong lịch sử nhân loại, bệnh lao đã 5 lần bùng phát và lan rộng thành các vụ đại dịch lao. Trong khoảng 100 - 150 năm gần đây vi khuẩn lao đã dần phát triển trong hầu hết các khu vực trên trái đất [1]. Theo WHO : - Lao là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 sau HIV. Năm 2012, có 8,6 triệu người nhiễm lao và 1,3 triệu người chết vì lao. - Hơn 95% số người chết tới từ các nước kém và đang phát triển và là một trong ba nguyên nhân gây chết lớn nhất cho phụ nữ từ 15-44 tuổi. - Vào năm 2012, có 530 nghìn trẻ em nhiễm lao và 74 000 trẻ em đã chết. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [47]. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông - Nam châu Á. Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học. Tuy nhiên thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện của cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 3 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển. Hình 1.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47] 1.1.2 Việt Nam Việt Nam là một trong 22 nước có tình trạng bệnh lao nặng nhất thế giới. Tại châu Á, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số lượng bệnh nhân lao. Hiện Việt Nam có khoảng trên 200.000 người mắc bệnh lao. Trong đó, số người mới mắc khoảng 185.000-187.000 người. Số người nhiễm lao ở Việt Nam chiếm tới 44% dân số. Số tử vong do lao rất cao, mỗi năm có khoảng 4% trường hợp tức là 3200 – 3500 tử vong. Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60 – 61/ 100.000 trẻ. Ước tính mỗi năm có khoảng 20.000 trường hợp lao trẻ em, song hiện nay trung bình chỉ điều trị khoảng 250 – 300 trẻ . Ở người lớn, bệnh lao gặp phổ biến ở người nghèo lứa tuổi 15 -55 tuổi, cao nhất trong lớp người 25 – 40 là những người đang đóng góp nhiều nhất cho xã hội [1,2]. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 4 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92% [2]. Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của WHO. Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới[2,31]. Hiện tại Việt Nam còn đang gia tăng số lượng người nhiễm lao kháng thuốc. Thep thống kê của WHO số ca lao kháng thuốc được biết tới cao nhất vào năm 2011 là 610 ca tới năm 2012 thì phát hiện thêm 273 ca. Việt Nam là một trong những nước đang phát triển, điều kiện chăm sóc y tế tại những nơi vùng sâu vùng xa còn kém. Người dân không có thói quen dùng thuốc và điều trị thuốc theo bác sỹ nên tình trạng kháng thuốc đang rất báo động [45,47]. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 5 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Hình 1.2 : Sơ đồ thống kê số ca nhiễm mới lao bình thường và lao kháng thuốc tại Việt Nam[47] 1.2 Bệnh lao Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay. Trên thế giới, chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao. Bệnh lao được phát hiện từ trước công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước vùng Trung Á. Năm 1908, Mantoux dùng phương pháp tiêm tuberculin trong da để phát hiện dị ứng lao. Cũng trong năm đó, Calmette và Guérin nghiên cứu vaccine phòng lao và đã thành công vào năm 1921 (vaccine BCG- Bacillus Calmette-Guérin). Đến năm 1944, Waksmann tìm ra kháng sinh chữa lao đầu tiên là streptomycine, năm 1952, thuốc isoniazid được đưa vào điều trị lao. Năm 1965, thuốc Rifampin được nghiên cứu thành công và năm 1978, cơ chế và tác dụng của pyrazynamide được xác định. Những thuốc này cùng với việc tiêm chủng phòng lao bằng vaccine BCG đã làm thay đổi được tình hình lao trên thế giới [27]. Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 6 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [41,47]. 1.2.1 Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 1.2.1.1 Bệnh lao kháng thuốc Vi khuẩn lao kháng thuốc đang là một trở ngại lớn đối với công tác phòng chống lao toàn cầu. Theo thông báo của WHO năm 2007, tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 4,8%. Tỷ lệ lao kháng thuốc tiên phát với ít nhất 1 loại thuốc là 17% (từ 0% đến 56,3%), kháng isoniazid là 10,3%, kháng đa thuốc thay đổi từ 0% đến 22,3%. Trường hợp kháng thuốc thứ phát: kháng ít nhất 1 loại thuốc là 35%, kháng isoniazid là 27,7%, tỷ lệ kháng đa thuốc là 15,3%, tỷ lệ kháng đa thuốc mở rộng là 7,0%. Tại Uzbekistan tỷ lệ đa kháng thuốc lên đến 60,0%, Azerbaijan là 55,8%. Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga là những nước có tỷ lệ lao kháng thuốc lớn nhất. Hiện nay 69 nước và vùng lãnh thổ được xác định là xảy ra lao kháng đa thuốc, và 45 nước xuất hiện lao kháng đa thuốc mở rộng. Theo ước tính của WHO, tỷ lệ lao kháng đa thuốc mở rộng tăng từ 1 triệu ca đến 1,5 triệu ca trong khoảng thời gian từ 2-3 năm. Vi khuẩn lao kháng đa thuốc đang là một thách thức lớn cho toàn cầu. Trong khi thuốc chống lao hàng đầu chỉ có 5 thuốc, thì thuốc chống lao loại hai thường có độc tính cao và giá thành rất đắt. Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn kháng đa thuốc mở rộng cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần [46,48]. Tại Việt Nam, theo CTCLQG năm 2006, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại, tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 30,7% vào loại cao trên thế giới. Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%, trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19.3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát là 2,7%. Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 [2]. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 7 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng sau vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para - aminosalysilic, isoniazid, Rifampin,… nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thời gian điều trị nhất định. Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95 - 100 % đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc là 20 - 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [29,32]. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự khác biệt với các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh. Trong các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt: Lao kháng thuốc là những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin. - Lao kháng đa thuốc (MDR-TB): là vi khuẩn lao kháng ít nhất với cả 2 loại thuốc là isoniazid và Rifampin, đây là 2 loại thuốc chống lao dòng thứ nhất thường được sử dụng đầu tay để điều trị cho tất cả các bệnh nhân, và có thể kháng thêm một số tác nhân hoá trị liệu khác. - Lao đa kháng thuốc phổ rộng (XDR-TB): là sự đề kháng với isoniazid và rifampin cộng với fluoroquinolone và ít nhất 1 trong số 3 thuốc chống lao dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin hoặc capreomycin). Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xẩy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào, còn kháng thuốc thứ phát là sự phát triển của kháng thuốc trong hoặc sau liệu pháp điều trị bằng hoá chất. Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng thuốc của các chủng kiểu dại với các thuốc đặc hiệu. Ví dụ: tất cả các chủng M. bovis kiểu dại đều có tính kháng thuốc tự nhiên với HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 8 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn pyrazinamide, Mycobacterium tuberculosis có tính kháng tự nhiên với penicillin [2,46]. 1.2.1.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là một sự khuếch đại nhân tạo của một hiện tượng tự nhiên liên quan đến sự phát sinh các đột biến một cách ngẫu nhiên ở các gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn. Không giống với nhiều vi khuẩn khác, vi khuẩn lao không có sự chuyển gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua các gen nhảy hoặc plasmid,... Các chủng vi khuẩn lao kiểu dại không tiếp xúc với các thuốc chống lao sẽ không bao giờ xuất hiện tính kháng thuốc ngoại trừ tính kháng thuốc tự nhiên của các loài vi khuẩn với một số thuốc như M. bovis kháng pyrazinamide, M. tuberculosis kháng penicillin, ... Trong quá trình nhân lên của trực khuẩn lao, tính kháng thuốc được phát triển theo những trật tự xác định. Trong mỗi ổ lao thường có khoảng 107 tế bào trở lên trong khi đó tần số xuất hiện đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao khoảng 10-7 đến 10-9 còn tần số đột biến kháng Rifampin là khoảng 10-10. Tính kháng thuốc do sự phát sinh ngẫu nhiên các đột biến liên quan này được gọi là tính kháng di truyền . Khi không có mặt của thuốc kháng sinh , các chủng vi khuẩ n lao mẫn cảm thuốc phát triển lấn át các chủng kháng thuốc. Sự có mặt của thuốc kháng sinh trong điều trị đã cung cấp một áp lực chọn lọc cho các chủng vi khuẩn lao. Các chủng mẫn cảm bị ức chế sinh trưởng, thậm chí bị tiêu diệt, các chủng kháng thuốc trở thành ưu thế hình thành tính kháng thuốc thu được, đặc biệt là trong các bệnh nhân có chứa một lượng lớn trực khuẩn lao. Sự lây lan của các chủng kháng thuốc này sang những người khác làm cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu (tính kháng thuốc sơ cấp) [24,27,29,46]. Tính kháng nhiều loại thuốc khác nhau của vi khuẩn liên quan đến sự có mặt đồng thời các đột biến ở các gen đặc hiệu. Ví dụ, tính kháng isoniazid của vi khuẩn lao có tần số là từ 10-7 đến 10-9, sự xuất hiện các đột biến liên quan đến tính kháng Rifampin có tần số khoảng 10-10, và sự xuất hiện các đồng thời các đột biến liên quan đến tính kháng cả 2 loại thuốc này có tần số khoảng 10-14. Tuy nhiên, trong HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 9 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn một quần thể vi khuẩn chỉ kháng isoniazid, các đột biến ngẫu nhiên phát sinh có thể dẫn đến tính kháng rifampcin ở một vài cá thể. Khi bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và Rifampin, các chủng kháng cả 2 loại thuốc này sẽ được chọn lọc phát triển ưu thế. Tương tự như vậy, sự xuất hiện của các đột biến có thể dẫn đến tính kháng tổ hợp các loại thuốc kháng sinh khác ở vi khuẩn lao [36]. Hình 1.3. Cơ chế phát triể n tính kháng thuố c ở vi khuẩn lao [33] HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 10 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
- Xem thêm -