Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diệp hạ châu (phyllanthus amarus l.) mọc hoang ở tỉnh cà mau

  • Số trang: 92 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 15 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG MỘNG TUYỀN VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSSV: 3104003 LỚP: VSV K36 Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG MỘNG TUYỀN VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSSV: 3104003 LỚP: VSV K36 Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Trương Mộng Tuyền DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………. Cần thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học đã tận tình dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích và những kỹ năng thao tác nghiên cứu trong suốt quá trình em theo học tại Viện. Phó Giáo sư – Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, thầy đã hướng dẫn tận tình, cho em những lời khuyên bổ ích trong thời gian em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Cán bộ ở tất cả các phòng thí nghiệm và đặc biệt là các anh chị trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật, thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã luôn giúp đỡ em hoàn thành đề tài. Các bạn bè những người đã động viên, cổ vũ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Đặt biệt là sự quan tâm chia sẻ của gia đình và người thân trong khoảng thời gian xa nhà và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gởi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý Thầy Cô, các anh chị và tất cả những người bạn của tôi. Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 Sinh viên thực hiện Trƣơng Mộng Tuyền TÓM LƢỢC Mười sáu dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ, thân, lá, và trái của cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) ở Tỉnh Cà Mau. Trong đó, mười hai dòng vi khuẩn được phân lập tế bào có hình que ngắn và bốn dòng tế bào có hình que dài. Bảy dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương còn lại 9 dòng là Gram âm. Mười sáu dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định NH4+ và tổng hợp IAA. Dòng H8 có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất (1,41µg/ml), nồng độ IAA được sinh ra nhiều nhất là 19,15µg/ml (do dòng T9 tổng hợp). Chín dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan. Dòng T9, R7, R10B kháng vi khuẩn Escherichia coli, dòng R7, R10B, R12 kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla. Ba dòng vi khuẩn T9, R7 và R10B có khả năng kháng khuẩn được nhận diện bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rDNA. Dòng T9 được nhận diện là Bacillus subtilis có mức đồng hình 99%, dòng R7 được nhận diện là Bacillus amyloliquefaciens có mức đồng hình 98% và dòng R10B được nhận diện là Bacillus methylotrophicus có mức đồng hình 99%. Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus, Bacillus subtilis,cố định NH4+,Diệp Hạ Châu, kháng khuẩn, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. i MỤC LỤC TÓM LƢỢC .................................................................................................................. I MỤC LỤC .................................................................................................................... II DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................V DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................VI TỪ VIÊT TẮT ............................................................................................................VII PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1 PHẦN II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................... 3 VỊ TRÍ ĐỊA LÝ TỈNH CÀ MAU ...................................................................... 3 I. II. GIỚI THIỆU CÂY DIỆP HẠ CHÂU ............................................................... 4 III. MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH ..................................................... 6 1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp ......................................................... 7 1.1. Vi khuẩn Azospirillum sp .......................................................................... 8 1.2. Vi khuẩn Azotobacter sp .......................................................................... 8 1.3. Vi khuẩn Bacillus sp ................................................................................. 8 1.4. Vi khuẩn Burkholderia sp. ...................................................................... 11 1.5. Vi khuẩn Enterobacter sp ....................................................................... 12 1.6. Vi khuẩn Klebsiella sp ............................................................................ 12 1.7. Vi khuẩn Pseudomonas sp ...................................................................... 12 2. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ........................................................... 14 IV. 2.1. Khả năng cố định đạm............................................................................. 14 2.2. Khả năng tổng hợp IAA .......................................................................... 14 2.3. Đối kháng sinh học.................................................................................. 15 MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN GÂY BỆNH ................................................ 15 1. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ................................................................... 15 2. Vi khuẩn Escherichia coli .............................................................................. 16 V. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) TRONG NƢỚC VÀ THẾ GIỚI ..................................................... 16 1. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................................... 17 2. Tình hình nghiên cứu thế giới ........................................................................ 19 PHẦN III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 20 ii I. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .................................................................... 20 1. Địa điểm – thời gian ....................................................................................... 20 2. Vật liệu ........................................................................................................... 20 3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 20 4. Hóa chất ......................................................................................................... 21 4.1. Môi trường phân lập vi khuẩn .................................................................... 21 4.2. Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân ................................................. 21 4.3. Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+, IAA .................................. 21 4.4. Môi trường khảo sát khả năng kháng khuẩn .............................................. 22 4.5. Hóa chất dùng để khử trùng mẫu................................................................ 22 4.6. Hóa chất dùng để nhuộm Gram .................................................................. 22 II. PH ƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 23 1. Phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây Diệp Hạ Châu ....................................... 23 1.1. Quy trình phân lập vi khuẩn .................................................................... 23 1.2. Quan sát, mô tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn ........... 24 1.3. Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh ............................... 25 1.4. Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh .............................................................. 26 2. Xác định khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập được .... 27 2.1. Nguyên tắc............................................................................................... 27 2.2. Hóa chất: ................................................................................................. 27 2.3. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) ................................................................................................................ 28 3. Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập ........................................................................................................................ 29 3.1. Chuẩn bị .................................................................................................. 29 3.2. Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) ......................... 29 4. Thí nghiệm khảo sát khả năng hòa tan lân ..................................................... 30 5. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được30 6. Nhận diện một số dòng vi khuẩn có đặc tính kháng khuẩn ........................... 30 PHẦN IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ................................................................... 33 I. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN ............................................................... 33 1. Phân lập vi khuẩn ........................................................................................... 33 iii 2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập .................................... 34 II. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP ............................... 36 III. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN ............. 38 IV. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN ............... 40 V. KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP . ........................................................................................................................... 41 VI. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ........................................................................................................................ 42 1. Khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli .................. 42 2. Khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila ....... 43 VII. ĐỊNH DANH NHỮNG DÒNG VI KHUẨN TRIỂN VỌNG .................... 45 PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ........................................................................ 49 I. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 49 II. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 50 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 54 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Bản đồ địa lý Tỉnh Cà Mau .............................................................................. 4 Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu ............................................................................................ 5 Hình 3: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................... 13 Hình 4: Dụng cụ phòng thí nghiệm ............................................................................. 20 Hình 5: Phương pháp pha loãng .................................................................................. 24 Hình 6: Vòng pellicle của vi khuẩn trên môi trường NFb bán đặc ............................. 34 Hình 7: Đặc điểm một số khuẩn lạc phân lập được..................................................... 35 Hình 8: Nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập.......................................... 37 Hình 9: Khả năng tổng hợp NH4+ của 7 dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6, 8 ngày chủng trên môi trường NFb .......................................................................................................... 39 Hình 10: Khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6 ngày chủng 41 Hình 11: Vòng sáng hòa tan lân của dòng T8 (trái) và dòng R9 (phải) ...................... 41 Hình 12: Hiệu suất hòa tan lân của 9 dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6 ngày chủng .............. 42 Hình 13: Vòng sáng kháng vi khuẩn Escherichia coli của dòng R10B ngày thứ 3 .... 42 Hình 14: Tính kháng vi khuẩn E. coli của 3 dòng vi khuẩn phân lập ......................... 43 Hình 15: Vòng sáng kháng vi khuẩn A. hydrophila của dòng R12 ngày thứ 3 ........... 44 Hình 16 : Tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của 4 dòng qua 3 ngày khảo sát ........................................................................................................................ 44 Hình 17: Phổ điện di 3 dòng vi khuẩn ......................................................................... 45 Hình 18: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T9 ....................................... 46 Hình 19: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R7 ....................................... 47 Hình 20: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R10B................................... 48 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần môi trường Potato Dextro Agar (có bổ sung đạm 1g KNO3/L). 21 Bảng 2: Thành phần Môi trường NBRIP đặc .............................................................. 21 Bảng 3: Thành phần môi trường NFb ......................................................................... 21 Bảng 4: Thành phần môi trường LB (Luria – bertani) ................................................ 22 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA . 35 Bảng 7: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ....... 37 Bảng 8: Khả năng tổng hợp NH4+ của 7 dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6, 8 ngày chủng (nhóm A)...................................................................................................................... 38 Bảng 9: khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn sau 2,4,6 ngày chủng .......... 40 Bảng 10: Trình tự gene 16S rDNA của dòng T9......................................................... 46 Bảng 11: Trình tự gene 16S rDNA của dòng R7 ........................................................ 47 Bảng 12: Trình tự gene 16S rDNA của dòng R10B .................................................... 48 vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ TỪ VIÊT TẮT DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxy-nucleotide triphosphates IAA Indole-3-acetic acid LB Luria - bertani NBRIP National Botanical Research Institute’s Phosphate OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextro Agar vii Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu cây Diệp Hạ Châu (hay còn gọi là cây chó đẻ) đã được y học cổ truyền dùng để chữa các bệnh như thanh Can lương huyết, sát trùng giải độc. Nhiều nghiên cứu khoa đã cho thấy đây là một thảo dược có tác dụng rất tốt trong việc điều trị sỏi thận, sỏi mật và viêm gan siêu vi B. Diệp Hạ Châu là một loại thảo dược rất phổ biến ở Việt Nam và một số nước châu Á dùng để chữa nhiều bệnh như phù thủng, bệnh gout, sốt rét, thương hàn, cảm cúm, bón uất, kiết lỵ, ung nhọt, lở loét, tiểu đường...Sở dĩ nó có nhiều tác dụng như vậy là vì trong cây Diệp Hạ Châu có chứa một số hoạt chất có tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa (http://www.lrc-hueuni.edu.vn). So sánh với kháng sinh tây y, có thể thấy các cây thuốc kháng sinh tuy hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Không những thế, chúng còn có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tây y không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Đây là chuyện nan giải đối với kháng sinh tây y hiện nay, nhưng đối với kháng sinh thực vật người ta chưa thấy hiện tượng này. Đó là chưa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong, trong khi ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm. Bên cạnh đó, phần lớn các kháng sinh thực vật lại rất bền vững và dễ hoà tan trong nước, nên có thể được dùng dưới dạng thuốc sắc là dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh tự nhiên của cây cỏ. Đến nay, Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Khi canh tác cây dược liệu đa phần sử dụng phân bón hóa học hay phân bón hữu cơ. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh sống trong cây dược liệu có khả năng kích thích cây phát triển tốt thông qua khả năng cố định đạm, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh với 1 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ cây chưa được quan tâm nhiều. Việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay. Vì vậy, việc nghiên cứu “Phân lập những dòng vi khuẩn nội sinh Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) ở Tỉnh Cà Mau” để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học được thực hiện. Mục tiêu đề tài : Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. 2 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ PHẦN II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU I. VỊ TRÍ ĐỊA LÝ TỈNH CÀ MAU Tỉnh Cà Mau được tái lập từ cuối năm 1996, là mảnh đất tận cùng của Việt Nam với 3 mặt tiếp giáp với biển: phía Đông giáp với biển Đông, phía Tây và phía Nam giáp với vịnh Thái Lan, phía Bắc giáp với 2 tỉnh Bạc Liêu và Kiên Giang. Hình 1: Bản đồ địa lý Tỉnh Cà Mau (*Nguồn: http://dulichdatmui.blogspot.com/, ngày 03/08/2013) Cà Mau là vùng đất thấp, thường xuyên bị ngập nước và khá bằng phẳng đã hình thành nơi đây 3 vùng đất tự nhiên có đặc điểm và tiềm năng kinh tế đặc trưng:  Nhóm đất mặn chiếm 40% diện tích tự nhiên phân bố chủ yếu ở các huyện Ngọc Hiển, Năm Căn, Đầm Dơi, Cái Nước, Phú Tân và xen kẽ ở Trần Văn Thời, U Minh, Thới Bình, thành phố Cà Mau có độ mặn ít, là vùng lúa - cá đồng, thuận tiện cho các ngành kinh tế công, nông và thương nghiệp phát triển.  Nhóm đất phèn chiếm 52,18% diện tích tự nhiên phân bố chủ yếu ở các huyện Thới Bình, U Minh, Trần Văn Thời và xen kẽ các huyện khác thuận tiện phát triển nông, lâm nghiệp .  Nhóm đất phèn nhiễm mặn phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thích hợp với nuôi trồng thủy sản. Đây là khu vực có nhiều đầm, phá còn nguyên nét hoang 3 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ sơ như đầm Bà Tường, phá Tam Giang, đặc biệt nổi tiếng là rừng đước ngập mặn Cà Mau. Ngoài ra còn có nhóm đất than bùn phân bố chủ yếu trong khu vực rừng tràm. Tỉnh Cà Mau mang đặc trưng của khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, với nền nhiệt độ cao vào loại trung bình trong tất cả các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,5oC. Nhiệt độ đất trung bình năm thường biến thiên trong khoảng từ 29 đến 30oC. Những tháng 2, 3, 4, 5 thường trên 30oC. Cà Mau có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô. Mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11; mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau. Độ ẩm tương đối của lớp không khí tầng thấp nhìn chung cao, trung bình năm là 85,6% (http://www.chinhphu.vn/). Cà mau có nhiều sông lớn: Tam Giang, Gành Hào, sông Đốc, sông Trẹm…với trữ lượng nước lớn, có giá trị đối với việc phát triển kinh tế xã hội; tạo nguồn nước tưới, lượng phù sa bồi đắp thêm để phát triển nông nghiệp,… II. GIỚI THIỆU CÂY DIỆP HẠ CHÂU Diệp Hạ Châu hay còn gọi là cây chó đẻ, chó đẻ răng cưa, cam kiềm, rút đất, kham ham (Tày). Tên khoa học: Phyllanthus amarus L. (tên đồng nghĩa Phyllanthus niruri) Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae). Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu (*Nguồn: http://viemganb.vn/dieu-tri-viem-gan-b, ngày 05/08/2013) 4 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ý nghĩa về tên Chó đẻ răng cưa: Chó sau khi đẻ thường tìm ăn 1 số cây, trong đó có cây này. Lá mọc trên cành trông như răng cưa. Rút đất: Cây này vào buổi chiều hoặc khi cắt khỏi gốc, lá cụp vào trông rất giống cây rau rút thả nổi trên ao. Diệp Hạ Châu: là ngọc dưới lá vì hàng quả dưới lá khi có ánh sáng chiếu vào trông như hạt ngọc. Còn có hàm ý cây này quý như ngọc. Đặc điểm: Cây thảo, sống hằng năm hay sống dai, cao khoảng 20-30cm, có thể đến 60-70cm. Thanh nhẵn, mọc thẳng đứng, lá mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy như một lá kép hình lông chim. Phiến lá thuôn, dài 1-1,5cm, rộng 3-4mm, đầu lá nhọn hay hơi tù, mép có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu xanh lơ; cuống lá rất ngắn (Trương Công Quyền, 1978). Hoa mọc ở kẽ lá, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực ở đầu cành có 6 lá dài, 3 nhị, chỉ nhị ngắn; hoa cái ở cuối cành, 6 lá dài, bầu hình trứng. Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 7-9. Phân bố, sinh thái: Chi Phyllanthus L. có nhiều loài, gồm những cây thảo đến các cây bụi hay gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong đó đáng chú ý là 2 loài Phyllanthus urinaria L. và P. niruri L. có hình dáng gần giống nhau, mọc rải rác khắp nơi trừ vùng núi cao lạnh. Trên thế giới, các loài này cũng có vùng phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới Châu Á khác như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Nam Trung Quốc. Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L. ) là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở ruộng cao (đất trồng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa…) pH từ 5,0 đến 6,5. Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân; sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25-30oC. Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gần nên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loại cỏ dại và cây trồng khác, vòng đời kéo dài 3-5 tháng (Đỗ Huy Bích et al., 2011). 5 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Thành phần hóa học: Theo Patel et al., (1996) Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) chứa nhiều chất thuộc các nhóm hóa học: Flavonoid: kaempferol, quercetin, rutin. Triterpen: stigmasterol, stigmasterol-3-0-β-glucosid, β- sitosterol glucosid, lup20(29)-en-3β-ol. Tannin: acid elagic, acid 3, 3’, 4-tri-0-methyl elagic, acid lagic. Phenol: methylbrevifolin carboxylat. Acid hữu cơ: acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic. Và các thành phần khác: n-octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triacontanol, phylanthurinol acton. Ligna: phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phyltetralin. Tính vị, công năng: Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) có vị hơi đắng, tính mát có tác dụng tiêu độc, sát trùng, tiêu viêm, tán ứ, thông huyết mạch, lợi tiểu. Công dụng: Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) được dùng chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lỡ ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má. Ngoài ra còn dùng chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn. Trong y học, người ta dùng nước ép lá cho vào sữa dừa dùng cho trẻ em làm ăn ngon miệng. Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) còn được coi là thuốc làm săn, khai thông và sát trùng, và được dùng trị khó tiêu, lỵ, phù, bệnh đường niệu–sinh dục, bệnh lậu và đái tháo đường. Lá và quả diệp hạ châu được giã và làm thành bột nhão với nước sữa, tỏi và hạt tiêu dùng uống trị vàng da. Dưới dạng thuốc đắp bào chế với nước gạo được dùng chữa sưng phù và loét, dược liệu này còn được dùng trị giun trẻ em (http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc). III. MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, 6 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003). Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với cả sức ép vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997). Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum (Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al., (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang. Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây. 1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp Cá như Azospirillum, Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus và Pseudomonas. 7 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 1.1. Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn Azospirillum sp. Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum). Đây là vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và một số chất dinh dưỡng khác. Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986). Trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất kích thích tố thực vật (Broek và Vanderleyden, 1995), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003). 1.2. Vi khuẩn Azotobacter sp. Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ. Bà cho rằng Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm. 1.3. Vi khuẩn Bacillussp. Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí 8 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacilluscó thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩnBacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-450C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong xử lý môi trường,… Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Bacillus amyloliquefaciens: Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích thước (0,7-0,9) x(1,8-3)m, nội bào tử (0,6-0,8) x (1-1,40)m, là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH=7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn 15-50oC, nhiệt độ tối ưu 30-40oC (Artidtaya Bhoonobtong et al, 2012). Bacillus cereus: Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1-1,5) x (3-5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2-1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983). 9 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -