Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) trồng ở thành phố cần thơ

  • Số trang: 137 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 37 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỊ THANH TRÚC MSSV: 3103997 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỊ THANH TRÚC MSSV: 3103997 LỚP: VSV K36 Cần Thơ, Tháng 11 / 2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp (ký tên) Nguyễn Thị Thanh Trúc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ  Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trƣờng Đại Học Cần Thơ và đƣợc thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hƣớng dẫn tận tình của quý Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Vi Sinh Vật Học, dù gặp phải rất nhiều khó khăn và trở ngại. Tôi xin trân trọng cảm ơn: Quý Thầy Cô Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. Thầy PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp, Trƣởng bộ môn Vi Sinh Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Các cán bộ ở tất cả các phòng thí nghiệm và đặc biệt là các anh chị phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Gia đình, đồng nghiệp và các bạn bè đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, quý thầy cô và tất cả các bạn bè của tôi. Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Thanh Trúc Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Hai mươi dòng vi khuẩn được phân lập từ cây Diếp Cá trồng ở Thành Phố Cần Thơ. Chúng có hình dạng que ngắn, que dài và cầu đôi... Và đa số vi khuẩn thuộc gram âm. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA sau 2 ngày tăng sinh trong môi trường Nfb. Chín dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của 20 dòng vi khuẩn phân lập được trên 2 dòng vi khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila, kết quả cho thấy 12/24 dòng vi khuẩn có khả năng kháng tốt đối với Escherichia coli và 10/24 dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila. Tuyển chọn 4 dòng vi khuẩn R1, R2, T4 và L3 có hiệu quả kháng khuẩn tốt để giải trình tự. Khi so sánh kết quả với dữ liệu của ngân hàng gen 4 dòng vi khuẩn R1, R2, T4 và L3 theo thứ tự được nhận diện như là Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabhattai và Bacillus flexus, Từ khóa: cây Diếp Cá, kháng khuẩn, PCR, tổng hợp NH4+ - IAA, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT .............................................................................................................. LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... TÓM TẮT ........................................................................................................................... i MỤC LỤC .......................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................ vi DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................ vii TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................................. ix CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu đề tài........................................................................................................ 2 CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................ 3 Tổng quan về Thành Phố Cần Thơ ........................................................................ 3 2.1 2.1.1 Vị trí địa lý ....................................................................................................... 3 2.1.2 Điều kiện tự nhiên ............................................................................................ 3 Địa hình ............................................................................................................... 3 a. b. Khí hậu................................................................................................................. 4 c. Thủy văn .............................................................................................................. 4 2.2 Giới thiệu về cây Diếp Cá ...................................................................................... 5 2.3 Tác dụng của Diếp Cá trong y học ........................................................................ 6 2.3.1 Tác dụng kháng khuẩn ..................................................................................... 6 2.3.2 Tác dụng kháng viêm ....................................................................................... 7 2.3.3 Tác dụng trên hệ miễn nhiễm ........................................................................... 7 2.3.4 Tác dụng lợi tiểu............................................................................................... 7 2.3.5 Tác dụng trên hệ hô hấp ................................................................................... 7 2.3.6 Tác dụng chống oxy hóa .................................................................................. 8 2.3.7 Tác dụng chống ung thƣ ................................................................................... 8 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh ................................................................................... 8 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp ............................................................... 9 2.5.1 Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................... 10 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 a. Trường Đại học Cần Thơ Bacillus amyloliquefaciens ................................................................................ 10 b. Bacillus cereus ................................................................................................... 10 c. Bacillus polymyxa .............................................................................................. 11 d. Bacillus subtilis.................................................................................................. 11 e. Bacillus megaterium .......................................................................................... 12 2.5.2 Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................. 13 2.5.3 Vi khuẩn Azospirillum .................................................................................... 14 2.5.4 Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................ 15 2.5.5 Vi khuẩn Azotobacter ..................................................................................... 15 2.5.6 Vi khuẩn Enterobacter ................................................................................... 16 2.5.7 Vi khuẩn Burkholderia ................................................................................... 16 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. ................................................................ 17 2.6 2.6.1 Vi khuẩn E. coli (Escherichia coli) ................................................................ 17 2.6.2 Vi khuẩn A. hydrophila (Aeromonas hydrophila) ......................................... 19 Tình hình nghiên cứu Diếp cá trong và ngoài nước ............................................ 22 2.7 2.7.1 Trong nƣớc ..................................................................................................... 22 2.7.2 Ngoài nƣớc ..................................................................................................... 22 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 24 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 24 3.1 3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện ..................................................................... 24 3.1.2 Dụng cụ - thiết bị ............................................................................................ 24 3.1.3 Vật liệu ........................................................................................................... 25 3.1.4 Hóa chất.......................................................................................................... 25 a. Môi trƣờng phân lập vi khuẩn nội sinh ............................................................. 25 b. Môi trƣờng khảo sát khả năng hòa tan lân ........................................................ 25 c. Môi trƣờng khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ .................................................. 26 d. Môi trƣờng khảo sát khả năng kháng khuẩn ..................................................... 27 e. Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn ........................................................................ 27 f. Hóa chất trích DNA ........................................................................................... 27 g. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR .................................................................... 28 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 29 3.2 3.2.1 a. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn nội sinh ....................................................... 29 Thu mẫu ............................................................................................................. 29 b. Xử lý mẫu và phân lập ....................................................................................... 29 3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ......................... 31 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh ..................................................................... 32 3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ ................................................................. 33 a. Nguyên tắc ......................................................................................................... 33 b. Hóa chất ............................................................................................................. 33 c. Tiến hành thí nghiệm: ........................................................................................ 34 d. Định lƣợng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng).... 34 3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân ....................................................................... 35 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA .................................................................. 35 a. Chuẩn bị ............................................................................................................. 35 b. Hóa chất ............................................................................................................. 35 Phƣơng pháp ...................................................................................................... 36 c. 3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn .......................... 36 3.2.8 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu ....................................... 37 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 39 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ cây Diếp Cá. ......................................................... 39 4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn. ............................................................. 39 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của 20 dòng vi khuẩn .................................................... 41 4.1.3 Hình dạng và khả năng di chuyển của 20 dòng vi khuẩn .............................. 43 4.1.4 Kết quả nhuộm Gram của 20 dòng vi khuẩn. ................................................ 45 4.2 Khả năng tổng hợp NH4+. .................................................................................... 47 4.3 Khả năng hòa tan lân. .......................................................................................... 51 4.4 Khả năng tổng hợp IAA. ...................................................................................... 54 4.5 Khả năng kháng khuẩn. ....................................................................................... 59 4.5.1 Tính kháng khuẩn Escherichia coli (E. coli). ............................................... 59 4.5.2 Tính kháng khuẩn với Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) ..................... 65 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 4.6 Trường Đại học Cần Thơ Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn .................................................................. 69 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 74 PHỤ LỤC ............................................................................................................................. Phụ lục 1 Kết quả hàm lượng NH4+ của 20 dòng vi khuẩn Phụ lục 2 Đường chuẩn NH4+ của 4 ngày đo Phụ lục 3 Kết quả thống kê hàm lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Phụ lục 4 Kết quả thống kê hàm lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân Phụ lục 5 Kết quả thống kê hàm lượng NH4+ của các dòng vi khuẨn phân lập từ lá Phụ lục 6 Kết quả hàm lượng IAA của 20 dòng vi khuẩn Phụ lục 7 Đường chuẩn IAA của 3 ngày đo Phụ lục 8 Kết quả thống kê hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ Phụ lục 9 Kết quả thống kê hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân Phụ lục 10 Kết quả thống kê hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá Phụ lục 11 Đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng trong khảo sát khả năng kháng Escherichia coli của các dòng vi khuẩn phân lập được Phụ lục 12 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn trong khảo sát khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn Phụ lục 13 Phân tích thống kê đường kính vòng vô khuẩn trong khảo sát khả năng kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trƣờng PDA. ................................................................................................. 25 Bảng 2: Môi trƣờng NBRIP đặc (Nautiyal, 1999). ........................................................... 25 Bảng 3: Môi trƣờng NFb (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997). ................................................... 26 Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lƣợng ........................................................................... 26 Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamine .......................................................................... 27 Bảng 6: Môi trƣờng LB (Lauria Betani) ........................................................................... 27 Bảng 7: Thành phần các chất trong phản ứng PCR........................................................... 28 Bảng 8: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ rễ, thân và lá của cây Diếp Cá ............... 40 Bảng 9: Đặc điểm của 20 dòng vi khuẩn đã đƣợc phân lập .............................................. 41 Bảng 10: Đặc tính của 20 dòng vi khuẩn .......................................................................... 43 Bảng 11: Kết quả nhuộm Gram của 20 dòng vi khuẩn. .................................................... 45 Bảng 12: Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của 20 dòng vi khuẩn ........................... 52 Bảng 13: Khả năng kháng A. hydrophila của 10 dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. ............. 66 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Diếp cá (Houttuynia cordata T.) ............................................................................ 5 Hình 2: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ..................................................................... 14 Hình 3: Vi khuẩn Escherichia coli (E .coli) ...................................................................... 18 Hình 4: Bệnh xuất huyết trên cá ........................................................................................ 19 Hình 5: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ........................................................................ 20 Hình 6: Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá .............................................. 30 Hình 7: Quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh trên Diếp Cá .............................................................................................................................. 37 Hình 8: Sự phát triển của vi khuẩn tạo vòng pellicle ........................................................ 39 Hình 9: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trƣờng PDA ................................. 43 Hình 10: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn .......................................................................... 46 Hình 11: Phản ứng màu của đƣờng chuẩn NH4+. .............................................................. 47 Hình 12: Hàm lƣợng NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ theo thời gian ............ 48 Hình 13: Hàm lƣợng NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân theo thời gian ........ 49 Hình 14: Hàm lƣợng NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá theo thời gian ............ 50 Hình 15: Biểu đồ hàm lƣợng NH4+ trung bình các ngày của các dòng vi khuẩn . ........... 51 Hình 16: Một số hình ảnh vòng halo của vi khuẩn trên môi trƣờng NBRIP .................... 53 Hình 17: Phản ứng màu của đƣờng chuẩn IAA ................................................................ 54 Hình 18: Hàm lƣợng IAA tổng hợp đƣợc của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ theo thời gian .................................................................................................................................... 55 Hình 19: Hàm lƣợng IAA tổng hợp đƣợc của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân theo thời gian ............................................................................................................................. 56 Hình 20: Hàm lƣợng IAA tổng hợp đƣợc của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá theo thời gian .................................................................................................................................... 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 21: Biểu đồ hàm lƣợng IAA trung bình từng ngày các dòng vi khuẩn .................... 58 Hình 22: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ .... 60 Hình 23: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân 61 Hình 24: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá .... 63 Hình 25: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn trung bình của 12 dòng vi khuẩn ............ 64 Hình 26: Một số hình ảnh sự tạo vòng sáng vô khuẩn kháng E. coli. ............................... 65 Hình 27: Biểu đồ so sánh vòng sáng vô khuẩn trung bình của 10 dòng ........................... 67 vi khuẩn ............................................................................................................................. 67 Hình 28: Một số hình ảnh về sự tạo vòng kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn ... 68 Hình 29: Phổ điện di của sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ đoạn 16S rRNA của 4 dòng vi khuẩn ................................................................................................................................. 69 Hình 30: Mức độ tƣơng đồng của dòng R1 với dòng Bacillus megaterium trên cơ sở dữ liệu NCBI. .......................................................................................................................... 70 Hình 31: Mức độ tƣơng đồng của dòng R2 với dòng Bacillus subtilis trên cơ sở dữ liệu NCBI. ................................................................................................................................. 70 Hình 32: Mức độ tƣơng đồng của dòng T4 với dòng Bacillus aryabhattai trên cơ sở dữ liệu NCBI. .......................................................................................................................... 71 Hình 33: Mức độ tƣơng đồng của dòng L3 với dòng Bacillus flexus trên cơ sở dữ liệu NCBI. ................................................................................................................................. 72 Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TỪ VIẾT TẮT A. hydrophila Aeromonas hydrophila BLAST Basic Local Alignment Search Tool DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long E. coli Escherichia coli EAC Ehrlich Ascites Carcinoma EAEC Enteroaggregative E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli EHEC Enterohemorrhagic E. coli EPEC Enteropacthogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli IAA Indole–3–Acetic Acid LB Luria - Bertani NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar Chuyên ngành Vi sinh vật học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Từ thời xa xƣa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phƣơng thuốc y học cổ truyền từ những nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên. Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội thì các kỹ thuật ngày càng hiện đại và tiên tiến hơn, từ đó nhiều loại thuốc đƣợc ra đời. Nhờ sự phát triển của hóa học và dƣợc học, một số hoạt chất có trong dƣợc liệu thảo mộc đƣợc phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học, tác dụng dƣợc lý và sử dụng dƣới dạng tinh khiết. Tuy nhiên, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dƣợc, ngoài những ƣu điểm nổi bật nhƣ hiệu quả nhanh, dễ sản xuất, bảo quản và sử dụng, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc kèm theo, đặc biệt trong những trƣờng hợp điều trị lâu dài. Vì vậy, ngày nay ngƣời ta có xu hƣớng trở về với thiên nhiên. Đất nƣớc Việt Nam ta với nguồn tài nguyên dƣợc liệu dồi dào, phong phú là một thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu sức khỏe con ngƣời. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nƣớc ta đƣợc xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của các loại cây cỏ, trong đó có không ít các loại cây đƣợc sử dụng làm thuốc hiệu quả. Có những loại dƣợc liệu thảo mộc rất thông dụng trong nhân gian, nhƣng lại đƣợc các nhà khoa hoc chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với các loại thuốc tân dƣợc hiện nay. Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dƣợc liệu có tính kháng khuẩn nhƣ cây Sài đất (Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)… đã đƣợc nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton nhƣ methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen, camphen,.....Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006; Shu-Chen et al, 2008). Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, hòa tan lân, tổng hợp các hormone tăng trƣởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dƣỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dƣợc liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dƣợc liệu. Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella…(Hardoim et al, 2008; Kaul et al, 2008) 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn đƣợc các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp Cá (Houttuynia corata T.) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Thành Phố Cần Thơ 2.1.1 Vị trí địa lý Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lƣu của Sông Mê Kông và ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí Minh 169 km, cách thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách biển khoảng 100 km theo đƣờng sông Hậu. Cần Thơ có tọa độ địa lý 105°13’38” - 105°50’35” kinh độ Đông và 9°55’08” - 10°19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Thành phố Cần Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân số vào khoảng 1.200.300 ngƣời, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 ngƣời/km². Cần Thơ cũng là thành phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lƣu sông Mê Kông. (nguồn: http://cantho.gov.vn/wps/portal/, ngày 27/07/2013) 2.1.2 Điều kiện tự nhiên a. Địa hình Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi đắp và đƣợc bồi lắng thƣờng xuyên qua nguồn nƣớc có phù sa của dòng sông Hậu. Địa hình nhìn chung tƣơng đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngƣ nghiệp, với độ cao trung bình khoảng 1 – 2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam. Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lƣới sông, kênh, rạch khá chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hƣởng lũ trực tiếp hàng năm. Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hƣởng triều cùng lũ cuối vụ. Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ b. Khí hậu Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm, không có mùa lạnh. Mùa mƣa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả năm khoảng 2.249,2h, lƣợng mƣa trung bình năm đạt 1600 mm. Độ ẩm trung bình năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hƣởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong năm. Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trƣởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo ra 1 hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con, tạo nên sự đa dạng trong sản xuất và trong chuyển dịch cơ cấu sản xuất c. Thủy văn Thành phố Cần Thơ có hệ thống kênh rạch dày đặc, với hơn 158 sông, rạch lớn nhỏ là phụ lƣu của 2 sông lớn là Sông Hậu và sông Cần Thơ đi qua thành phố nối thành mạng đƣờng thủy. Các con sông lớn khác nhƣ rạch Bình Thủy, Trà Nóc, Ô Môn, Thốt Nốt, kênh Tham Rôn và nhiều kênh rạch khác tại các huyện ngoại thành, cho nƣớc ngọt suốt hai mùa mƣa nắng, tạo điều kiện cho nhà nông làm thủy lợi và cải tạo đất. (Nguồn:http://cantho.gov.vn/wps/portal/!ut/p/b1/vZRfb4IwEMA_i5-gh4W2PhZwtKQwKXUvhgMzshQzGI2x6cfW3wycb5s3CWXXPK7_u6hOWRQSQm2KMPEQStkjtX7fled992xar97Q9Zcuzqapdim4pmB 9FlicSVd4eABKAfAC7iwqQJgKnBAcpHrWYIxcPxofolKdyjmhmOeD1JRQrgLuHDIFfjN8wPAneCAygGgd1dRF GVoBfY6bT5Psn_tdUMTiBo5jXp5GV7oM3j47wN4_opPs8_LtAUUfYWQDo_RSnYfVqLRV3o3OXuQof1ywOh b48tJGMLnZGFajqyMIORhfj_hbGgIDOmYpVawODvP02IzK7tNsNxWXooFt1hiw6mVUSLfnWTWz6ZfAGO__c k/dl4/d5/L2dBISEvZ0FBIS9nQSEh/, ngày 27/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 2.2 Trường Đại học Cần Thơ Giới thiệu về cây Diếp Cá Hình 1: Diếp cá (Houttuynia cordata T.) (Hình chụp, ngày 27-7-2013) Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata T., thuộc họ lá Giấp (Saururaceae). Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim), fish mint, fish herb, hay lizardtail (đuôi thằn lằn). Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngƣ tinh thảo. Diếp cá là loại thân thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dƣới đất. Phần thân trên mặt đất cao 15-50 cm, màu lục hoặc màu tím đỏ. Lá mọc so le. Cuống lá dài, phiến lá hình tim dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 5-7 gân gốc. Hoa nở vào tháng 5-8. Cụm hoa là 1 bông dài 2,5 cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Trông toàn bộ bề ngoài cụm hoa và lá bắc giống nhƣ một cái hoa đơn độc. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn. Toàn cây vò có mùi tanh nhƣ mùi cá. Vị hơi chát, se. Cây Diếp cá phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc tới Nepal, Ấn Độ, các nƣớc Đông Dƣơng và Indonesia. Ở nƣớc ta, cây mọc rất phổ biến. Thƣờng gặp mọc hoang nơi ẩm ƣớt trên các bãi ven suối, bờ sông. Cũng thƣờng đƣợc trồng làm rau ăn và làm thuốc. Thu hái cành lá quanh năm, thƣờng dùng tƣơi. Có thể phơi hay sấy khô để dùng dần. Thành phần hoá học của cây Diếp cá nhƣ sau: Nƣớc 91,5%; protid 2,9%; glucid 2,7%, lipit 0,5%, cellulose 1,8%, dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng toàn phần 1,1% (Ngoài ra trong đó có calcium, kali, caroten, vitamin C). Trong cây có tinh dầu mà thành Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ phần chủ yếu là methylnonylketon, decanonylacetaldehyde và một ít alcaloid là cordalin, một hợp chất sterol v.v... Trong lá có quercitrin (0,2%); trong hoa và quả có isoquercitrin. Theo Đỗ Tất Lợi (2000), trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axit caprinic và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%. 2.3 Tác dụng của Diếp Cá trong y học Rau Diếp cá là một loại rau rất quen thuộc trong bữa ăn của ngƣời Việt Nam. Ngoài công dụng đƣợc xem nhƣ một vị rau ngon, Diếp cá còn có rất nhiều những công dụng khác. Theo Đông y, Diếp cá có vị đắng, tính ôn, tác dụng vào kinh mạch Đại tràng và Phế, vì vậy có tác dụng: Giải nhiệt và giải độc, làm giảm sƣng viêm, trị mụn nhọt trong các trƣờng hợp ung nơi phổi, do hỏa vƣơng tại Phế với đờm dày đặc màu vàng xanh, trị ho ra máu. Giải độc ung nhọt ngoài da, chữa vết thƣơng do rắn cắn hay côn trùng cắn. Làm thông khí ứ đọng, giúp tiêu hóa tốt và lợi tiểu. Đặc biệt tác dụng chữa bệnh trĩ rất hiệu quả, do khả năng bảo vệ làm bền mao mạch. (Nguồn: Zhang Y., Li S and Wu X. (2008), “Pressurized liquid extraction of flavonoid from Houttuynia cordata Thunb.”, Separation and Purification Technology, 58: 305-310.). 2.3.1 Tác dụng kháng khuẩn Diếp cá có khả năng chống lại Herpes type I và II. Trong đó khả năng chống lại Herpes type II mạnh hơn so với type I. Ngoài ra, Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản sự sinh sản của các vi khuẩn Streptococcus pneumonia (gây sƣng phổi ) và Staphylococcus aureus (gây mụn nhọt có mủ) Tác dụng trên các vi khuẩn Shigella, Salmonella và E. coli (gây kiết lỵ, tiêu chảy ) thì yếu hơn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Diếp cá còn có khả năng diệt đƣợc Gonococcus (gây bệnh lậu mủ ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi trùng cảm cúm. 2.3.2 Tác dụng kháng viêm Hoạt chất trong Diếp cá có khả năng chống sƣng viêm và làm hạ sốt. Là do các acid béo trong lá khô có khả năng ngăn chặn sự tổng hợp prostaglandin – thủ phạm gây ra sƣng viêm (do phản ứng loại ức chế cyclooxygenase ) Diếp cá còn đƣợc dùng để điều trị hen suyễn, viêm mũi dị ứng do tác dụng ức chế phản ứng quá mẫn qua trung gian tế bào Mast. 2.3.3 Tác dụng trên hệ miễn nhiễm Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp cá có khả năng làm tăng tính thực bào của các bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng của hệ miễn nhiễm chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh do siêu vi trùng. 2.3.4 Tác dụng lợi tiểu Tác dụng này có đƣợc có thể do liên quan đến chất quercitrin, isoquercitrin và muối kali trong cay Diếp cá. Khi dùng dịch chiết nƣớc Diếp cá để ngâm tƣới trên thận của cóc và chân của ếch thì nhận thấy các vi mạch máu giãn nở, làm tăng sự lƣu thông của máu và tạo ra sự bài tiết nƣớc tiểu. Chất isoquercitrin còn có tác dụng làm tăng sự bền chắc của các vi mạch máu. Vì vậy các bệnh nhân cao huyết áp nên ăn thêm Diếp cá để giúp lợi tiểu, hạ huyết áp, đồng thời giúp mạch máu vững chắc hơn. 2.3.5 Tác dụng trên hệ hô hấp Khi chích dung dịch nƣớc Diếp cá qua màng phúc mô thỏ tác dụng hạ ho đƣợc nhận thấy rõ rệt. Khả năng trị bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp của Diếp cá cũng đƣợc chứng minh rõ ràng: Khi dùng liều cao (60g) để trị bệnh sƣng phổi ung nhọt, kết quả rất tốt, ung nhọt biến mất và không để lại di chứng sau 2 tuần điều trị. Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -