Tài liệu Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) ở tỉnh kiên giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH KIÊN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN MẠNH MSSV:3113729 LỚP : VI SINH VẬT K37 Cần Thơ, 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.) Ở TỈNH KIÊN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN MẠNH MSSV:3113729 LỚP : VI SINH VẬT K37 Cần Thơ, 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Mạnh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ  Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ đến nay tôi đã hoàn thành khóa học và trong quá trình làm luận văn, tôi luôn được sự hỗ trợ về mặt tinh thần và vật chất từ gia đình, Thầy, Cô và bạn bè đã giúp tôi vượt qua những khó khăn và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn đến: Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này. Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến gia đình, bạn bè lớp Vi sinh vật học khóa 37 đã động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này! Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2014 Nguyễn Mạnh Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Diếp cá là một loại cây trồng được ứng dụng làm thuốc trị bệnh từ rất lâu, từ rễ, thân, lá của cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) đã phân lập được mười lăm dòng vi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có dạng hình tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng sữa, dạng que ngắn, Gram âm và có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy, lượng ammonium và IAA cao nhất vào ngày thứ hai sau đó giảm vào ngày thứ tư và tăng lên vào ngày sáu sau khi chủng. Dòng ML4 và ML7 có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất so với các dòng còn lại (0,728 µg/ml và 0,755 µg/ml ), khác biệt không có ý nghĩa với nhau và lượng IAA cao nhất (5,640 µg/ml ) do dòng MR4 tổng hợp được vào ngày hai nhưng lại giảm vào ngày sáu sau khi chủng. Bên cạnh đó dòng MR4 cũng có khả năng hòa tan lân cao nhất vào ngày sáu sau khi chủng (161 E) so với các dòng còn lại, đồng thời có 6 dòng vi khuẩn có khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập từ rễ, thân, lá và có một dòng vi khuẩn kháng được vi khuẩn gây bệnh E.coli được phân lập từ thân cây Diếp cá. Đặc biệt, dòng MT1 có khả năng kháng lại cả hai vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hydrophila . Ba dòng vi khuẩn được nhận diện ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự 16S-rRNA. Dòng MT1 được nhận diện là Enterobacter cloacae (mức độ đồng hình là 94%). Dòng MT2 được nhận diện là Acinetobacter baumannii ( mức độ đồng hình là 98%). Dòng MR4 được nhận diện là Enterobacter cloacae (mức độ đồng hình là 97%) Từ khóa: Acinetobacter baumannii, Cây Diếp cá, Enterobacter cloacae, Kháng khuẩn, Vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC .................................................................................................................... i MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................... viii CHƯƠNG 1 GIỚITHIỆU ............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Kiên Giang ......................................................... 3 2.1.1 Vị trí địa lý ............................................................................................. 3 2.1.2 Đặc điểm. ............................................................................................... 4 2.2 Sơ lược về cây Diếp cá ................................................................................... 4 2.3 Tác dụng của cây Diếp cá ............................................................................... 5 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh ........................................................................... 7 2.4.1 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh : ................................................. 7 2.4.1.1 Khả năng cố định đạm: .................................................................. 8 2.4.1.2 Khả năng hòa tan lân khó tan: ....................................................... 8 2.4.1.3 Khả năng đối kháng:...................................................................... 9 2.4.2 Một số vi khuẩn nội sinh thường gặp: ................................................... 9 2.4.2.1 Vi khuẩn Enterobacter ................................................................. 10 2.4.2.2 Vi khuẩn Acinetobacter ............................................................... 10 2.4.2.3 Vi khuẩn Bacillus ........................................................................ 10 2.4.2.4 Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................... 13 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 2.4.2.5 Vi khuẩn Azospirillum ................................................................ 13 2.4.2.6 Vi khuẩn Azotobacter .................................................................. 14 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................ 14 2.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ..................................................... 15 2.5.2 Mồi (primer) sử dụng trong PCR ......................................................... 16 2.6 Điện di gel agarose ....................................................................................... 17 2.6.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di ........................................................... 17 2.6.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu ................................................................ 18 2.6.2.1 Điện di trên gel agarose ............................................................... 18 2.6.2.2 Điện di trên gel polyacrylamide .................................................. 18 2.7 Phương pháp giải trình tự DNA ................................................................... 18 2.7.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy ....................................... 18 2.7.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động .......................... 19 2.7.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã ............................... 19 2.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................. 19 2.8.1 Trong nước ........................................................................................... 19 2.8.2 Ngoài nước ........................................................................................... 20 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22 3.1 Phương tiện nghiên cứu: ............................................................................... 22 3.1.1 Thời gian – địa điểm thực hiện ............................................................ 22 3.1.2 Vật liệu: ................................................................................................ 22 3.1.3 Dụng cụ - thiết bị : ............................................................................... 22 3.1.4 Hóa chất ............................................................................................... 23 3.1.4.1 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh ....................................... 23 3.1.4.2 Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân .................................. 23 3.1.4.3 Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4 ............................. 24 3.1.4.4 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn ................................................. 25 3.1.4.5 Hóa chất trích DNA ..................................................................... 25 3.1.4.6 Hóa chất đo IAA: ........................................................................ 25 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 3.1.4.7 Hóa chất đo lượng đạm vi khuẩn cố định.................................... 25 3.1.4.8 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR .............................................. 25 3.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 26 3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh ................................................................... 26 3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyên động của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá .......................................................................................... 27 3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh ........................................................... 29 3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+....................................................... 29 3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân ............................................................. 31 3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA ........................................................ 31 3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số dòng vi khuẩn phân lập .................................................................................................................. 33 3.2.8 Sử dụng kỹ thuật PCR nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh có triển vọng ...................................................................................................... 33 3.2.9 Phần mềm xử lý số liệu ........................................................................ 35 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 36 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ........................................................................... 36 4.1.1 Phân lập vi khuẩn ................................................................................. 36 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc .............................................................................. 37 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn..................................................................... 39 4.2. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn .............. 41 4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập từ rễ, thân cây Diếp cá ( MR1 – MR4, MT1, MT2) ............................... 41 4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá cây Diếp cá ( ML1 – ML9) ............................................................. 42 4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá........................................................................ 43 4.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indole –3– acetic acid (IAA)của các dòng vi khuẩn ..................................................................................................... 45 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 4.3.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập từ rễ, thân cây Diếp cá (MR1 – MR4, MT1, MT2)................................................ 45 4.3.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá cây Diếp cá ( ML1 – ML9 ) .......................................................................... 46 4.3.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá .................................................................................. 48 4.4. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan ........................................... 49 4.5. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ................ 51 4.5.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh E.coli.............................................................................................. 51 4.5.2 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh ở cá Aeromonas hydrophila ............................................................................. 52 4.6. Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh ................................................... 56 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 58 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 58 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 59 PHỤ LỤC Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1 : Môi trường PDA ............................................................................................. 23 Bảng 2 : Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) ....................................................... 23 Bảng 3 : Môi trường NFb (g/l) (Krieg và Dobereiner, 1984)........................................ 24 Bảng 4 : Thành phần dung dịch vi lượng. ..................................................................... 24 Bảng 5 : Thành phần dung dịch vitamin ....................................................................... 24 Bảng 6 : Thành phần các chất trong phản ứng PCR...................................................... 26 Bảng 7 : Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ............... 34 Bảng 8 : Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây Diếp cá trên môi trường PDA ................................................................................................ 37 Bảng 9 : Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............................................................................................................................... 38 Bảng 10 : Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ....................................................................................................................................... 40 Bảng 11 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 1(MR1 – MR4, MT1, MT2) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ........................................................................... 42 Bảng 12 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (ML1 – ML9) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ........................................................................................... 43 Bảng 13 : Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1(MR1 – MR4, MT1, MT2) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ................................................................. 46 Bảng 14 : Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (ML1 – ML9) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml).................................................................................... 48 Bảng 15 : Hiệu quả hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc. .................................................................................................................... 51 Bảng 16 : Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.coli ....................................................................................................................................... 52 Bảng 17 : Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila .................................................................................................. 54 Bảng 18 : Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng .......................................... 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1 Bản đồ hành chính tỉnh Kiên Giang .................................................................... 3 Hình 2 Lá cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) ............................................................. 5 Hình 3 : Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 30 Hình 4 : Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 32 Hình 5 : Sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vòng pellicle trong môi trường NFb bán đặc .................................................................................................................................. 36 Hình 6 : Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............. 39 Hình 7 : Vi khuẩn Gram âm (A) và vi khuẩn Gram dương (B) được chụp dưới kính hiển vi quang học ........................................................................................................... 40 Hình 8 : Lượng NH4+ (µg/ml) trung bình do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá ............................................................................... 44 Hình 9 : Lượng IAA (µg/ml) trung bình do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá ............................................................................... 49 Hình 10 : Vòng halo do dòng MR2 và MR4 tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP đặc ..................................................................................................................... 50 Hình 11 : Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn MT1 với vi khuẩn E.coli ........... 52 Hình 12 : Khả năng kháng khuẩn của dòng R2, T2, R4 với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila .................................................................................................. 55 Hình 13 : Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA ................................ 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT A. hydrophila Aeromonas hydrophila BLAST Basic Local Alignment Search Tool DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid E. coli Escherichia coli IAA Indole – 3 – Acetic Acid LB Luria - Bertani NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, cùng với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại và tiên tiến, từ đó nhiều loại thuốc đã được ra đời, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả nhanh, dễ bảo quản và sử dụng,… thì vấn đề hạn chế cần đặc biệt quan tâm là tác dụng phụ của thuốc và thuốc còn mang tính độc kèm theo khi điều trị lâu dài sẽ dễ gây biến chứng. Vì vậy, ngày nay người ta có xu hướng trở về với thiên nhiên với những cây cỏ có tính kháng sinh và kháng khuẩn đã được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học tìm thấy và nghiên cứu, trong đó có cây Diếp cá. Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, động thực vật phong phú là tiền đề tốt để phát triển các sản phẩm từ dược liệu. Nguồn dược liệu dồi dào là nền tảng cho việc hình thành các cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu. Theo thống kê của Bộ Y tế, cả nước hiện có hơn 300 cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu trong nước, trong đó có 10 cơ sở đông dược đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của WHO. Nhiều công ty dược cũng có thương hiệu riêng từ thế mạnh của cây dược liệu. Trong các loài dược liệu phổ biến, Diếp cá là loại rau quen thuộc trong nhân dân, không chỉ được dùng làm rau ăn, gia vị mà còn dùng làm thuốc trị một số bệnh như táo bón, sởi, viêm cơ, nhiễm trùng, trĩ,… Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất αpinen, camphen,.....Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006). Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, hòa tan lân, tổng hợp các hormone tăng trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu. Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella. Đến nay có rất ít nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá vì vậy việc phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá ở tỉnh Kiên Giang được thực hiện. 1.2 Mục tiêu Phân lập và tuyển chọn đựợc các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) có những đặc tính: kháng khuẩn tốt, khả năng cố định đạm tốt, tổng hợp IAA tốt và khả năng hòa tan lân khó tan tốt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Kiên Giang 2.1.1 Vị trí địa lý Kiên Giang nằm ở phía Tây Nam của Tổ quốc, phần đất liền nằm trong tọa độ từ 9°23'50 - 10°32'30 vĩ Bắc và từ 104°26'40 - 105°32'40 kinh Đông, có đường biên giới chung với Vương quốc Campuchia dài 56,8 km, đường bờ biển dài trên 200 km. Phía Đông và Đông Nam giáp Cần Thơ, An Giang; phía Nam giáp Cà Mau và Bạc Liêu; phía Tây giáp vịnh Thái Lan. Phần hải đảo nằm trong vịnh Thái Lan bao gồm hơn 100 hòn đảo lớn nhỏ, trong đó lớn nhất là đảo Phú Quốc và xa nhất là quần đảo Thổ Chu. Nằm trong vùng vịnh Thái Lan, gần với các nước Đông Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Malaisia, Singapo Hình 1 Bản đồ hành chính tỉnh Kiên Giang (Nguồn : http://laptruyenhinhcap.com/Lap-dat-TH-An-Vien/An-Vien-Tai-Kien-Giang.html ngày 26/7/2014) Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 2.1.2 Đặc điểm. - Địa hình : Kiên Giang có đủ các dạng địa hình từ đồng bằng, núi rừng và biển đảo. Trong đó, phần đất liền có địa hình tương đối bằng phẳng, thấp dần từ đông bắc xuống tây nam. - Khí hậu : Kiên Giang có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm; nhiệt độ trung bình hàng tháng từ 27 – 27,5oC. Lượng mưa trung bình hàng năm khoảng 1.600 – 2.000 mm ở đất liền và 2.400 – 2.800 mm ở vùng đảo Phú Quốc. Mùa mưa bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 11; mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau. Kiên Giang rất ít thiên tai, không rét, không có bão đổ bộ trực tiếp, ánh sáng và nhiệt lượng dồi dào, nên rất thuận lợi cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi sinh trưởng - Tài nguyên đất : Kiên Giang có 4 vùng đất đai chính là vùng phù sa ngọt thuộc tây sông Hậu, vùng phèn ngập lũ thuộc tứ giác Long Xuyên, vùng nhiễm mặn thuộc bán đảo Cà Mau và vùng đồi núi, hải đảo ở hai huyện Phú Quốc và Kiên Hải. Trong đó, đất nông nghiệp, chiếm 64,2% diện tích tự nhiên, đất rừng chiếm 122,8 nghìn ha, đất chuyên dùng 35,4 nghìn ha, đất ở 10,1 nghìn ha. Ngoài ra tỉnh còn có trên 70 nghìn ha đất hoang hoá và sản xuất chưa ổn định với hơn 25 nghìn ha vườn tạp. - Tài nguyên biển : Kiên Giang là tỉnh có nghề đánh bắt hải sản phát triển. Với bờ biển dài trên 200 km, có diện tích biển khoảng 63.000 km2, Kiên Giang tiềm năng rất phong phú để phát triển kinh tế biển. 2.2 Sơ lược về cây Diếp cá Cây diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Dấp cá, có tên khoa học là Houttuynia cordata T., tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim), fish mint, fish herb, hay lizardtail (đuôi thằn lằn), thuộc họ Giấp (Saururaceae). Cây Diếp cá có nguồn gốc ở Nhật Bản, miền nam Trung Quốc, Đông Nam Á, Ấn Độ, Indonesia,… Diếp cá là loại thân cỏ, có hình trụ tròn, hay dẹt, cong dài 20 – 35cm, đường kính 2 – 3 cm. Rễ mọc ngầm dưới đất, lá mọc so le, hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp cuộn lại, cuống đính ở gốc lá dài khoảng 2 – 3cm, cuống dài 3 cm. Vị hơi chát, se. Mùa hoa nở vào tháng 5 – 8 và mùa quả vào tháng 7 – 10. Cụm hoa hình bông bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT Theo Đỗ Tất Lợi (2006), trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, caprinic acid và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%. Thành phần chủ yếu của cây Diếp cá như sau : Nước 91,5; protid 2,9; glucid 2,7, lipit 0,5, cellulose 1,8, dẫn xuất không protein 2,2, khoáng toàn phần 1,1 và theo mg%: calcium 0,3, kali 0,1, caroten 1,26, vitamin C 68. Trong cây có tinh dầu mà thành phần chủ yếu là methylnonylketon, decanonylacetaldehyde và một ít alcaloid là cordalin, một hợp chất sterol v.v... Trong lá có quercitrin (0,2%); trong hoa và quả có isoquercitrin. Hình 2 Lá cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) (Hình tự chụp ngày 25/7/2014) 2.3 Tác dụng của cây Diếp cá Theo đông y, Diếp cá có vị cay chua, mùi tanh giống mùi cá, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, sát trùng, chữa viêm phổi, viêm khớp, lở loét cổ tử cung, táo bón do thói quen, kiết lỵ do vi khuẩn cấp tính, viêm gan vàng mật cấp tính,… Tinh dầu Diếp cá có tác dụng kháng viêm, khánh khuẩn mạnh. Ngoài ra, cây Diếp cá còn ức chế trực tiếp virus herpes chủng I (HSV – 1), virus cúm, virus gây suy Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT giảm miễn dịch mắc phải ở người loại I (HIV – 1) mà không biểu hiện độc tính, nhưng không chống lại poliovirus và coxsackie virus. Ba thành phần chính có tác dụng là : xeton methyl n – nonyl, aldehyde lauryl và aldehyde capryl. Trong y học dân gian, Diếp cá được dùng chữa các chứng bệnh như: táo bón, trĩ, sởi, mề đay, viêm tai giữa, sưng tuyến vú, tắc tia sữa , viêm thận, phù thũng, kiết lỵ , tiểu buốt, tiểu rát Theo nghiên cứu của y học hiện đại, trong cây Diếp cá có chất decanoyl – acetaldehyde mang tính kháng sinh, có tác dụng ức chế tụ cầu vàng, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn bạch hầu, E.coli, trực khuẩn lỵ, xoắn khuẩn leptospira. Nó cũng có tác dụng đối với virus sởi, herpes, cúm và cả HIV, do tác động vào vỏ bọc protein của virus. Diếp cá còn diệt ký sinh trùng và nấm. Cũng theo Tây y, Diếp cá giúp lợi tiểu do tác dụng của chất quercitrin, làm chắc thành mao mạch, chữa trĩ do tác dụng của chất dioxy-flavonon. Ngoài ra, nó còn có tác dụng lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tăng sức miễn dịch của cơ thể. Một nghiên cứu tại Viện đại học Y dược Toyama, Nhật Bản, đã cho thấy tác dụng chống oxy-hóa của 12 loại dược thảo và hợp chất được chiết xuất từ chúng. Diếp cá là một trong 4 chất có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất Theo một nghiên cứu của Đại học Y khoa Koahsiung, Đài Loan, Diếp cá có tác dụng ức chế đáng kể đối với sự sinh sản của virus herpes simplex. Nó được xem là dược thảo chữa trị bệnh này. Đại học Koahsiung cũng phát hiện Diếp cá có tác dụng ngăn chặn tế bào ung thư máu. Công trình nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Thú y, thuộc Viện đại học Nông nghiệp Zbejiang, Hangzbou, Trung Quốc. Từ Houttuynia cordata, các nhà nghiên cứu đã chiết xuất được chất Houttuynia, sau đó cho Houttuynia phản ứng với bisulphat natri để có được chất Houttuynia bisulphat natri. Từ chất này họ đã chế biến được một dung dịch tiêm vào vú để điều trị bệnh viêm tuyến vú ở bò. (http://yume.vn/quangjimmy/article/rau-diep-ca-vi-thuoc-da-nang-35A8CEC7.htm, ngày 25/7/2014)) Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót và phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây con khi chúng ta phân phối hạt giống từ vùng này sang vùng khác. Chúng không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi et al., 2000; Bandara et al., 2006) Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Pantonae), Beijerinckia, Derxia, Pseudomonas, Enterobacteriaeae Alcaligenes, Azoarcus, (Klebsiella, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên, nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos and Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al., 1988). Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998), tổng hợp kích thích tố auxin (Barbieri et al, 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenblueth và Martinez, 2006), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh (Fahey et al., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007). 2.4.1 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh : Vi khuẩn nội sinh là nhóm sinh vật tiền nhân được liên kết với thực vật, chúng hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn ở các mô bên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật chủ, mà ngược lại chúng còn được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng nhờ vào các đặc tính sinh học của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002). Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014 Trường ĐHCT 2.4.1.1 Khả năng cố định đạm: Trong không khí có khoảng 78% thể tích là khí nitơ, tuy nhiên vì đây là khí trơ nên có rất ít loài sinh vật có khả năng sử dụng nguồn chất dinh dưỡng này. Sự cố định đạm sinh học chỉ giới hạn ở nhóm vi sinh vật sơ hạch chủ yếu là vi khuẩn và Archaea. Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrat do cây chủ cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao. Thông qua hoạt động của các vi sinh vật này, N2 được chuyển thành dạng NH3 hữu ích cho cây trồng nhờ sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase. N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Các vi sinh vật cố định đạm trong tế bào vi khuẩn hay vi khuẩn lam đều nhờ đến hệ thống gen nif, điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Enzyme này dễ bị phá hủy bởi oxy. Nhiều vi khuẩn ngừng sản xuất enzyme này trong sự hiện diện của oxy. Nhiều vi sinh vật cố định đạm chỉ tồn tại trong điều kiện kỵ khí, vi hiếu khí hoặc ràng buộc oxy với một protein như leghemoglobin. Theo Klucas (1991), để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung cấp đầy đủ các chất cần thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sự cố định đạm liên kết. Do đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của các gen nif trong bộ gen của vi khuẩn được giả định là cố định đạm thường được xem là vật chỉ thị đáng tin cậy để phân loại vi khuẩn (Elmerich, 2007). 2.4.1.2 Khả năng hòa tan lân khó tan: Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer and Schinner, 1992). Nhìn chung, lân sẵn có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong đất khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho cây (Zou et al., 1992). Việc thiếu lân ở đất là một trong những nhân tố quan trọng nhất ở đất hạn chế sự sinh trưởng của thực vật, vì vậy để đạt được năng suất thực vật tối đa người ta thường dùng các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây. Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của phân lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được như Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC & PT CNSH