Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (tridax procumbens l.) mọc hoang ở thành phố cần thơ

  • Số trang: 138 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 23 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.) MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS - TS. NGUYỄN HỮU HIỆP TÔ HOÀNG DIỄM MSSV: 3108481 LỚP: VSVH-K36 Cần Thơ, Tháng 12/ 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.) MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGs-Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Tô Hoàng Diễm DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này. Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống. Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công. Cần Thơ, ngày 17 tháng 11 năm 2013 Tô Hoàng Diễm Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui (Tridax procumbens) trong môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, dạng hình que, Gram âm và có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định N và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy, lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ tư và giảm dần sau sáu ngày chủng. Dòng R6, T3, L4, L5, L6 có khả năng tổng hợp lượng NH4+ cao nhất so với các dòng còn lại (0,213 µg/ml - 0,221 µg/ml). Tuy nhiên các dòng vi khuẩn này tổng hợp lượng ammonium khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ngày thứ tư sau khi chủng và lượng IAA cao nhất (16,67 µg/ml) do dòng R5 tổng hợp trong điều kiện không có tryptophane vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Bên cạnh đó, dòng L5 có khả năng hòa tan lân cao nhất so với các dòng còn lại, đồng thời cũng có khả năng kháng khuẩn. Hai dòng R2 và T2 có khả năng kháng lại hai vi khuẩn E. coli và Aeromonas hydrophila gây bệnh. Kết quả giải trình tự gene 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene NCBI, dòng L5 được nhận diện là KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1, dòng R2 là KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244 và dòng T2 là KC465726.1 Bacillus subtilis dòng 14 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%, 99% và 95%. Từ khóa: Ammonium, hòa tan lân, IAA, khả năng kháng khuẩn, phân lập, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... viii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3 2.1 Thành phố Cần Thơ ............................................................................................... 3 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ ...........................................................................3 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ.................................3 2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) ............................................................. 5 2.2.1 Phân loại thực vật ............................................................................................... 5 2.2.2 Mô tả cây cúc mui ............................................................................................... 6 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui .............................................6 2.2.4 Đặc tính sinh học ................................................................................................ 7 2.2.5 Thành phần hoá học ............................................................................................ 7 2.2.6 Dược tính ............................................................................................................9 2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp ........................................................................9 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh .............................................................................10 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ............................................................................10 2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .............................................................. 13 2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ..................20 2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ cây ..........23 2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ............................................................. 23 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong nước ............................................................................................................................... 30 2.4.1 Trên thế giới ......................................................................................................30 2.4.2 Trong nước ........................................................................................................32 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................34 3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 34 3.1.1 Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 34 3.1.2 Địa điểm thực hiện ............................................................................................ 34 3.1.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 34 3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 34 3.1.5 Hóa chất ............................................................................................................35 3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 35 3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui ..................................................35 3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn. ..................................................................37 3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. .........39 3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. ....41 3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được. ....................................................................................................................................42 3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ............................. 43 3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .........................................44 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................48 4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................................... 49 4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn .................................................................................52 4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................54 4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) .......................................................... 54 4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1 - L7) .......................................................................................... 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ............................................58 4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. .................................................................................................60 4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan ............61 4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ..................................................................62 4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1- L7) ........................................................................................................64 4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ......................................................... 65 4.5 Kết quả khả năng tạo kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn .................................66 4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli).............66 4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh cá (Aeromonas hydrophila)....67 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.......................... 69 4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2 ................................................70 4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2 ................................................71 4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5 ................................................73 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................76 5.1 Kết luận ..................................................................................................................76 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 77 PHỤ LỤC .....................................................................................................................95 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường PDA ..........................................................................37 Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb ............................................................................37 Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP lỏng.................................................................42 Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar .....................................................................44 Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR ...................................................... 46 Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ................46 Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây cúc mui trên môi trường PDA .............................................................................................. 49 Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............................................................................................................................... 52 Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA .......................................................................................................................................53 Bảng 10. Lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ...................................................56 Bảng 11. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc .....................................................................................................................61 Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian(µg/ml) ................................................................ 63 Bảng 13. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.coli .............................................................................................................................. 67 Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ..................................................................................................68 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ ............................................................. 4 Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) ....................................................................5 Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ .............................................................. 6 Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) .................................................................8 Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli ...............................................................................29 Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.....................................................................30 Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 41 Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 43 Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA .........................................................................47 Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi chủng vi khuẩn (b) ........................................................................................................................ 48 Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA Agar….. .......................................................................................................................................51 Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L5) được chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100X. ............................................................... 53 Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra ............57 Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ....................... 59 Hình 15: Vòng halo do vi khuẩn tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. ......60 Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra được phân lập từ lá của cây cúc mui .........................................................................................................64 Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui .....................................................................................................66 Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli theo thời gian ................................................................................................................................ 67 Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá .............................................................................................. 68 Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S rDNA ................................ 70 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2 ........................................71 Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2.........................................72 Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5.........................................74 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 16S-rRNA 16S ribosomal RNA ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long Đ.K Đường kính DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid IAA Indol -3- acetic acid PCR Polymerase Chain Reaction PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria VKNS Vi khuẩn nội sinh VSV Vi sinh vật Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Thiên nhiên là một nguồn nguyên liệu của các loại dược phẩm khoảng hàng ngàn năm nay và một con số ấn tượng của các loại thuốc ngày nay đã được điều chế từ tài nguyên thiên nhiên. Một số loài thực vật và các giá trị cần thiết của chúng đã được nghiên cứu và công bố, nhưng cho đến nay nhiều loài trong số chúng vẫn còn chưa được khám phá. Vì vậy, điều cần thiết để khám phá công dụng của chúng và để tiến hành nghiên cứu ngành dược liệu học và y học để khám phá ra các loại thuốc chữa bệnh. Cây cúc mui (Tridax procumbens L.) là một thảo dược quý được tìm thấy ở khắp Ấn Độ nhưng tiếc là nó là một trong những cây dược liệu bị bỏ quên. Cây cúc mui là một loại thảo dược thường được sử dụng trong y học dân tộc, thuộc họ Cúc. Nó có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mỹ, nhưng nó đã được lan rộng ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và giữa các vùng ôn đới trên toàn thế giới. Cây cúc mui là một loại cây thân cỏ, mọc lan bò (procumbens) và dược tính của nó rất có giá trị. Từ thuở xa xưa con người đã biết sử dụng các cây cỏ để làm thuốc phòng chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe. Cùng với sự tồn tại và phát triển của lịch sử loài người, những kinh nghiệm nghiên cứu, sử dụng dược liệu để làm thuốc phòng chữa bệnh cũng ngày một phát triển. Trong sự nghiệp chăm sóc sức khỏe hiện nay, cây thuốcdược liệu càng được quan tâm và phát triển mạnh mẽ hơn. Theo số liệu thông kê gần đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật. Hàng năm cả nước sử dụng khoảng 50.000 tấn dược liệu (http://duoclieu.net/caythuo cvn2.html, ngày 20/8/2113). Với số lượng lớn như vậy có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc còn xa lạ với người dùng, hoặc nghe nhắc đến nhiều nhưng chưa hiểu đầy đủ về chúng. Ngày nay, dân số thế giới đang gia tăng với tốc độ đáng báo động, và một loạt các vấn đề mới về sức khỏe tăng lên. Ví dụ, số lượng các vi khuẩn kháng thuốc tăng lên là một nguyên nhân khá được quan tâm. Sự nghiên cứu về thuốc kháng sinh và các sản phẩm tự nhiên khác từ vi sinh vật là quan trọng trong cuộc chiến toàn cầu chống lại vấn đề ngày càng tăng của việc kháng kháng sinh. Vì vậy, để đối phó với số lượng ngày càng tăng của mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh (VKNS) có thể phục vụ như là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới. Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng VKNS thực vật đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi trên khắp thế giới. Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng và đồng hóa tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008). Nhiều nghiên cứu từ các cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia calendulacea, Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl nnonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen, camphen,… có tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006;) vì nguyên liệu làm thuốc từ các cây cỏ rất ít độc, rẻ tiền, dễ kiếm mà hiệu quả cao, sử dụng đơn giản, thân thiện với môi trường và giúp hạn chế điều kiện kháng thuốc. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ” nhằm nghiên cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ. 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Thành phố Cần Thơ 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc trung ương của Việt Nam. Ngày 24 tháng 6 năm 2009, thành phố Cần Thơ chính thức được Thủ tướng Chính phủ ra quyết định công nhận là đô thị loại 1 của Việt Nam thuộc vùng kinh tế trọng điểm của vùng đồng bằng sông Cửu Long và là vùng kinh tế trọng điểm thứ tư của Việt Nam (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013). 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ  Về vị trí địa lý: Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lưu của Sông Mê Kông và ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí Minh 169 km, cách thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách biển khoảng 100 km theo đường sông Hậu. Cần Thơ có tọa độ địa lý 105o13’38” - 105o50’35” kinh độ Đông và 9o 55’08” 10o19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc giáp tỉnh An Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây giáp tỉnh Kiên Giang, phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là 53 km². Thành phố Cần Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân số vào khoảng 1.200.300 người, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 người/km². Cần Thơ cũng là thành phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lưu sông Mê Kông (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013) (Hình 1). Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ (*Nguồn:http://cantho.gov.vn/wps/wcm/connect/sotnmt/sub+site/sitemenu/linhvucquanly/datdai/can+th o-qhsdd+den+nam+2020, ngày 30/07/2013)  Về điều kiện tự nhiên: Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù sa của dòng sông Hậu. Địa chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua quá trình bồi lắng trầm tích biển và phù sa của sông Cửu Long, trên bề mặt ở độ sâu 50 mét có hai loại trầm tích là Holocen (phù sa mới) và Pleistocene (phù sa cổ). Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngư nghiệp, với độ cao trung bình khoảng 1 - 2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam. Bên cạnh đó, thành phố còn có các cồn và cù lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn Khương, Cồn Sơn, Cù lao Tân Lập. Thành phố Cần Thơ có 3 dạng địa hình chính là Địa hình ven sông Hậu hình thành dải đất cao là đê tự nhiên và các cù lao ven sông Hậu. Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lưới sông, kênh, rạch khá chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hưởng lũ trực tiếp hàng năm. Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hưởng thủy triều cùng lũ cuối vụ. Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm, không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả năm khoảng 2.249,2 giờ, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 cm. Độ ẩm trung bình Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong năm (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013). Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo ra một hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con, đặc biệt là các cây cỏ hoang dại có tác dụng làm thuốc chẳng hạn như cây cúc mui (Tridax procumbens). 2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) 2.2.1 Phân loại thực vật (Amita et al., 2012) Giới : Thực vật Ngành phụ: Tracheobionta (Thực vật có mạch) Phân loại: Magnoliophyta (Thực vật có hoa) Lớp: Magnoliopsida (Cây song tử diệp) Lớp phụ: Asteridae Bộ: Asterales Họ: Asteraceae (Cúc) Giống (chi): Tridax Loài: Tridax procumbens (L.) Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012) Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu năm. Thân cao từ 30 - 50 cm, có lông trắng dày, phân nhánh, mọc bò sát mặt đất. Lá lá đơn, mọc đối, có lông ở cả hai mặt, mép có răng to, nhọn, không đều. Cụm hoa hình đầu, mọc ở ngọn thân, trên một cán dài 20 - 30cm. Hoa cái hình môi, màu trắng; hoa lưỡng tính hình ống, màu vàng. Quả bế còn lông, mào lông do 10 lông to dài và 10 lông ngắn. Đài hoa được tạo thành bởi các vảy hoặc mào lông ngắn lại. Hạt rơi xuống phôi và không có phôi nhũ. Cây ra hoa, kết quả tháng 4 - 6 và tháng 8 - 12. Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013) Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis. 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi cỏ, đất hoang, đồi núi. Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô (http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cuc-mui-5441/, ngày 24/11/2013). Nó không thể vi nhân giống bằng các cách thức như ở thực vật ví dụ như cắt. Sự nhân giống thông qua các hạt gây ra các biến thể. Các phương pháp đã được phát triển để bảo tồn sự di chuyển của chúng thông qua phương pháp vi nhân giống (Saini et al., 2008). Cây cúc mui phân bố rộng rãi là do thân sản xuất nhiều hạt và phát tán (Chauhan và Germination, 2008). Không giống như các cây lâu năm, cây cúc mui không có bất kỳ phương tiện phát tán, vì vậy nó được phân tán gần như hoàn toàn Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT bằng hạt của nó. Các chùm của lông trên quả bế cho phép chúng được phát tán theo gió. 2.2.4 Đặc tính sinh học Cây cúc mui là loài thảo dược lâu năm sinh sản bằng hạt và yêu cầu phải được tiếp xúc đầy đủ cho sự phát triển. Các loại thảo mộc này chịu được hạn hán, nhiệt độ và độ ẩm, ô nhiễm môi trường, bờ biển, độ dốc và gió (Amita et al., 2012). 2.2.5 Thành phần hoá học Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu từ cây cúc mui như: alkaloid, flavonoid, carotenoid, β-sitisterol, n-hexane, acid fumaric, luteolin, quercitin, oxoester, acid lauric, myristic, palmitic, arachidic, acid linoleic và tannin…(Singh và Ahirwar, 2010). Trước đây, nó đã được báo cáo về sự hiện diện của dexamethasone, luteolin, glucoluteolin, betasitosterol và quercitin (Reddy et al., 2006; Subramanian et al., 1968). Acid linolenic cũng đã được báo cáo trong các phần ở phía trên của cây. Hai polysaccharide tan trong nước; WSTP - IA và WSTP - IB có chứa chuỗi chính β - (1 6) - D - Galactan cũng đã được tinh chế từ lá của cây (Raju và Davidson, 1994). Sự xác định một số sterol bằng GC - MS và các thành phần lipid của cây cúc mui cũng đã được báo cáo. Một flavonoid mới "Procumbenetin" được phân lập từ các bộ phận phía trên của cây đã được mô tả là 3,6 dimetoxy - 5,7,2',3',4' - pentahydroxyflavone 7 - O β - glucopyranoside (Singh và Ahirwar, 2010). Thành phần khoáng chất được nghiên cứu từ lá của cây cúc mui có chứa calci, magie, kali, natri và selen. Nó đã được quan sát thấy rằng có thể phục vụ như một nguồn cung cấp protein thực vật và bổ sung kali, cũng như là nguồn tiềm năng của tiền chất vitamin A (caroten) cho người dân (Chen et al., 2008; Jude et al., 2009). Bốn terpenoid mới cùng với bis-bithiophene đã được báo cáo từ Tridax procumbens là acetate taraxasteryl, beta-amyrenone, acid lupeol và oleanolic (Ali và Jahangir, 2002). Hai flavon mới, 8,3'-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxy-6-O-β-D- glucopyranosyl flavone (1) và 6,8,3'-trihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone (2) được phân lập từ Tridax procumbens Linn., cùng với bốn hợp chất đã được biết là puerarin (3), esculetin (4), acid oleanolic (5) và acid betulinic (6) (Hình 4). Các cấu trúc của hai flavon mới đã được giải thích dựa trên phân tích hóa học và phương pháp quang phổ Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT (IR, 1D và 2D NMR, ESIMS, HR-ESI-MS). Các hoạt động chống oxy hóa của hai flavon mới được đánh giá bằng hai phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) hoạt động loại bỏ triệt để gốc tự do và các xét nghiệm làm giảm năng lượng chống oxy hóa của sắt (FRAP), và các dữ liệu cho thấy các hợp chất (1) và (2) có hoạt động chống oxy hóa nhất định, với các hoạt động chống oxy hóa của hợp chất (2) là mạnh hơn so với hợp chất (1). Có thể thấy rằng các phân tử 1 có cấu trúc taraxasteryl acetate, hình dạng của các mảnh triterpene trong số đó thực tế cũng giống như của taraxasterol acetate (Runsheg et al., 2010). Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) (*Nguồn: www.ijpbs.net/vol-3/issue-1/bio/P% 20 -% 2061.pdf, ngày 04/08/2013) Cây cúc mui giàu natri, kali và calci (Jude, 2009). Lá của nó chủ yếu chứa protein thô 26%, chất xơ thô 17%, và carbohydrate hòa tan 39%, calcium oxide 5%. Acid oleanolic cũng thu được với số lượng nhiều từ cây cúc mui và nó được cho là một tác nhân trị đái tháo đường tiềm năng khi thử nghiệm với a-glucosidase (Verma et al., 1998; Ali và Jahagir, 2002). Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -