Tài liệu Phân lập vi khuẩn lactobacillus spp. từ cá tra và cá trê có khả năng ức chế vi khuẩn edwardsiella ictaluri

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp. TỪ CÁ TRA VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN VĂN THÀNH SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN TRƢƠNG DUY ANH MSSV:3102719 LỚP:CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGS.TS. Nguyễn Văn Thành Nguyễn Trương Duy Anh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung i Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Đầu tiên con xin cảm ơn ba mẹ đã có ơn sinh thành và nuôi nấng con cho đến ngày con nên người. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Cảm ơn cô Bùi Thị Minh Diệu đã luôn dõi theo, tư vấn, dìu dắt cho em. Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, ân cần giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em thực hiện đề tài. Và cũng cám ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của anh Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang cùng toàn thể các anh chị, các bạn học viên cao học và các em sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn với tấm lòng trân trọng nhất! NGUYỄN TRƢƠNG DUY ANH ii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT Đề tài được thực hiện với mục đích tìm ra dòng Lactobacillus spp. có những đặc tính tốt nhằm sản xuất probiotic và bacteriocin trong phòng và trị bệnh cho cá tra. Từ các mẫu cá tra và cá trê thu ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long 17 dòng Lactobacillus spp. đã được phân lập. Trong 17 phân lập được, 8 dòng có khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt (Agar-spot test). Chỉ 2 dòng CT-TB7 và CT2-TB11 có khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khi được kiểm tra bằng phương pháp giếng thạch (Well-difusion-agar test). Môi trường MRS được bổ sung thêm yeast extract ở nồng độ 3% w/v là môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn Lactobacillus spp. tuyển chọn phát triển và tạo bateriocin ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Từ khóa: bacteriocin, cá tra, Edwardsiella ictaluri, Lactobacillus spp. iii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG ....................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii TÓM TẮT ......................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................... iv DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................... vii DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................... viii TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................................. ix CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU ............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................................ 2 1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 2 CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1. Tổng quan về cá da trơn ............................................................................................ 3 2.2. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh gan thận mủ do Edwarsdsiella ictaluri trên cá da trơn ............................................................................. 7 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn lactic, Lactobacillus spp. và tình hình nghiên cứu probiotic và bacteriocin .................................................................................................... 8 CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 18 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ........................................................................................... 18 3.1.1. Thời gian địa điểm .......................................................................................... 18 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 18 3.1.2. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 18 3.1.3. Hóa chất và môi trường ................................................................................... 18 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20 3.2.1. Thu mẫu........................................................................................................... 20 iv Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.2. Thí nghiệm 1. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống Lactobacillus ...................................................................................................... 20 3.2.3. Thí nghiệm 2. Tuyển chọn các dòng Lactobacillus spp. có khả năng kháng Eddwardsiella ictaluri cao ............................................................................................ 22 3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus spp. ............................................... 27 CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...........................................................................29 4.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc giống Lactobacillus ....................................................................................................................... 29 4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dạ dày-ruột cá tra và cá trê................................................. 29 4.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được ............... 30 4.2 Kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập đƣợc ....................................................................................... 37 4.2.1 Phương pháp nhỏ giọt .......................................................................................... 37 4.2.2 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ........................................................... 43 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus spp. ..................................................................................... 43 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ................................................................................ 47 1.Kết luận ............................................................................................................................ 47 2. Đề nghị .............................................................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................... 48 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 52 Phụ Lục 1. Phƣơng Pháp Nghiên Cứu .............................................................................. 52 1.1 Môi trƣờng ............................................................................................................. 52 1.1.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus spp. ......................... 52 1.1.2 Môi trường nuôi Edwardsiella ictaluri ............................................................. 52 v Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 1.1.3 Môi trường kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của các dòng Lactobacillus spp. phân lập ........................................................................................ 53 2. Quan sát hình thái, kích thƣớc, đo kích thƣớc các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc dƣới kính hiển vi................................................................................................ 53 2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn và khảo sát khả năng chuyển động của vi khuẩn ... 53 2.2 Nhuộm Gram và thực hiện các test sinh hóa để xác định dòng vi khuẩn phân lập được thuộc vi khuẩn lactic .................................................................................... 54 Phụ Lục 2. Kết Quả Thí Nghiệm ........................................................................................ 55 Phụ Lục 3. Phân Tích Thống Kê ........................................................................................ 58 vi Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo ra bởi LAB ........................... 9 Bảng 2. Thuộc tính của một vài bacteriocin .......................................................................... 13 Bảng 3. Khả năng ức chế một số vi khuẩn của plantaricin từ Lactobacillus plantarum ...... 14 Bảng 4: Thành phần của môi trường MRS broth .................................................................. 18 Bảng 5: Thành phần môi trường Trypticase (tryptic) Soy (TSB) ......................................... 19 Bảng 6: Các dòng vi khuẩn phân lập được từ cá tra, cá trê ở 2 tỉnh Đồng Tháp ,Vĩnh Long ............................................................................................ 29 Bảng 7: Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy ................................................................................................... 31 Bảng 8: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy ................................................................................................... 33 Bảng 9: Tổng hợp các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập ...... 35 Bảng 10: Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng Lactobacillus spp. phân lập khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt .................................. 37 Bảng 11: Khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch................................. 39 Bảng 12. Đường kính vòng vô khuẩn của dòng CT2-TB7 trên các loại môi trường MRS bổ sung...................................................................................................................... 42 Bảng 13. Đường kính vòng vô khuẩn của dòng CT2-TB11 trên các loại môi trường MRS bổ sung...................................................................................................................... 43 Bảng 14. Đường kính vòng vô khuẩn của 2 dòng vi khuẩn CT2-TB7 và CT2-TB11 trên các loại môi trường MRS bổ sung ............................................................................ 44 vii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Nuôi cá tra theo hình thức thâm canh ven sông Hậu ................................................ 5 Hình 2. Hình thái học cá tra.................................................................................................. 5 Hình 3.Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy ............................................................................................. 30 Hình 4. Hình thái các dòng vi khuẩn phân lập ở độ phóng đại 1000 lần .............................. 31 Hình 5. Vi khuẩn phân lập Gram dương sau khi nhuộm ở độ phóng đại 1000 lần ............... 33 Hình 6. Thử nghiệm catalase các dòng vi khuẩn phân lập .................................................... 33 Hình 7. Thử nghiệm oxidase các dòng vi khuẩn phân lập .................................................... 34 Hình 8. Các dòng vi khuẩn phân lập không có bào tử khi nhuộm và quan sát ở độ phóng đại 1000 lần ........................................................................................... 34 Hình 9 Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng CT1-TB1 phân lập khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt ........................................................ 36 Hình 10. Khả năng ức chế của bacteriocin do dòng Lactobacillus spp. sinh ra lên Edwardsiella ictaluri ............................................................................. 40 Hình 11. Biểu đồ so sánh khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của 8 dòng Lactobacillus spp. phân lập giữa phương pháp nhỏ giọt và phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ......................................................................................................................... 41 Hình 12. Biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các loại môi trường MRS được bổ sung các thành phần của 2 dòng vi khuẩn CT-TB7 và CT2-TB11. ........... 46 viii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT ATP : Adenosin triphosphate BHI: Brain Heart Infusion ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations ( Tổ chức lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) LAB: Lactic acid bacteria TSA : Trypicase soy agar WHO : World Health Organization ( Tổ chức Y tế thế giới) Cách đặt tên các dòng vi khuẩn phân lập: Tên loài cá thu mẫu - Địa điểm thu mẫu. Trong đó: CT là các dòng vi khuẩn phân lập từ cá trê CTR là dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra LV là mẫu được thu ở huyện Lấp Vò tỉnh Đồng Tháp TB là mẫu được thu ở huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long ix Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cá tra ( Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nuôi chính ở đồng bằng sông Cửu Long ( ĐBSCL). Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê, sản lượng cá tra năm 2012 ước đạt 1226 nghìn tấn. Do tốc độ phát triển nhanh cộng với mức độ thâm canh ngày càng cao đã phát sinh nhiều bệnh truyền nhiễm do một số loài vi khuẩn gây ra trên cá tra. Trong số đó, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung et al., 2005) đã gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho người nuôi. Tuy nhiên, do việc lựa chọn và sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh không đúng cách và diễn ra một cách bừa bãi nên đã làm cho độ nhạy của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đối với các loại thuốc kháng sinh ngày càng giảm và nguy cơ kháng thuốc dẫn đến không còn thuốc điều trị là rất cao (Nguyễn Đức Hiền, 2008). Bên cạnh đó việc lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến dư lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong thịt cá vượt mức cho phép gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dung và thương hiệu cá tra Việt Nam trên thị trường xuất khẩu. Hiện nay việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học đặc biệt là probiotic và bacteriocin để phòng trị bệnh cho cá tra đã thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm. Probiotic là những sinh vật sống mà khi tiêu thụ một lượng nhất định sẽ mang lại tác động tích cực cho vật chủ (FAO/WHO, 2001). Lactobacilli mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào biểu mô ở thành ruột, tồn tại và tăng mật số trong cơ thể vật chủ, hạn chế sự vào tế bào của các tác nhân gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh, kích thích miễn dịch cho vật chủ, tạo acid, H 2O2 và bacteriocin để ức chế sự trưởng của các tác nhân gây bệnh (Reid. 1999: Vá zquez et al., 2005). Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh trên cá như: A. hydrophila, E. tarda 524362. Bacteriocin khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y học do chúng là các phân tử proterin nên dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu hóa. Bacteriocin được tạo ra bởi một loài thuộc Lactobaciilus có thể ức chế nhiều loài vi khuẩn gây bệnh (Schillinger và Lucke (1989): Lewus et al. (1991); Karthikeyan và Santosh (2009)). Tuy nhiên cho đến nay có khá ít 1 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT nghiên cứu sử dụng Lactobaciilus spp. hay bacteriocin từ Lactobacillus spp. để ức chế lại E. ictaluri. Vì thế đề tài PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp. TRONG CÁ TRA VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri” đã được tiến hành. 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập tuyển chọn dòng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh ở cá tra. 1.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp. từ dạ dày của ruột cá tra và cá trê ở hai tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp. Kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri của các dòng Lactobacillus spp. phân lập được bằng hai phương pháp: phương pháp nhỏ giọt và phương pháp khuếch tán giếng thạch. Khảo sát ảnh hưởng của một số thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Edwarsiella ictaluri của dòng Lactobacillus spp. phân lập được. 2 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng Quan Về Cá Da Trơn 2.1.1 Giới thiệu về cá da trơn Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Siluriformes Bộ Cá da trơn hay bộ Cá nheo (danh pháp khoa học: Siluriformes) là một bộ cá rất đa dạng trong nhóm cá xương. Các loài cá trong bộ này dao động khá mạnh về kích thước và các thức sinh sống. Tất cả chúng đều không có vảy. Bộ cá này có tầm quan trọng kinh tế đáng kể; nhiều loài được chăn nuôi ở quy mô lớn để cung cấp cá thực phẩm, một vài loài được nuôi thả để làm cá câu thể thao. Nhiều loài cá nhỏ, cụ thể là các loài trong chi Corydoras, được nuôi làm cá cảnh trong các bể cá. . Tại thời điểm năm 2007, người ta công nhận khoảng 36 họ cá da trơn còn tồn tại với khoảng 3.023 loài còn tồn tại. Điều này làm cho bộ cá da trơn trở thành bộ động vật có xương sống đứng hàng thứ hai về sự đa dạng; trên thực tế, khoảng 1 trên 20 loài động vật có xương sống là cá da trơn theo. Các loài cá da trơn sống trong các vùng nước nội địa hay ven biển của mọi châu lục, ngoại trừ châu Nam Cực. Cá da trơn là đa dạng nhất tại khu vực nhiệt đới Nam Mỹ, châu Phi và châu Á. Trên một nửa số loài cá da trơn sinh sống tại châu Mỹ. Chúng là các loài cá duy nhất của bộ Ostariophysi đã di cư vào các môi trường sống nước ngọt ở Madagascar, Australia và New Guinea. Cá da trơn chủ yếu được tìm thấy tại các môi trường sống nước ngọt, mặc dù phần lớn sinh sống trong các môi trường nước nông và lưu thông (nước chảy). Các đại diện của ít nhất là 8 họ là các loài sinh sống ngầm dưới đất với 3 họ có khả năng sinh sống trong các hang hốc. Vì thế, cá da trơn là một trong những nhóm cá thành công nhất trong việc chiếm lĩnh các hang hốc. 3 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tại Việt Nam, có thể tìm thấy cá lăng (Hemibagrus elongatus), cá chiên (Bagarius bagarius), cá ngạnh (Cranoglanis sinensis) ở các sông đồng bằng miền Bắc như sông Lô, sông Hồng, sông Thao, sông Đà, sông Mã, sông Lam. Miền Nam thì có cá chiên sông (Bagarius yarrelli), cá lăng nha (Mystus nemurus), cá tra dầu (Pangasianodon gigas), cá trèn bầu (Ompok bimaculatus) được thấy tại các sông rạch như sông Đồng Nai, sông Sài Gòn và hạ lưu sông Cửu Long, vùng Tiền Giang, Hậu Giang. Cá da trơn là loài thủy sinh vật được chăn nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới và trở thành một nguồn thủy hải sản quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, được chế biến và tiêu thụ rộng rãi trên toàn cầu. 2.1.2 Sơ lƣợc về cá tra a) Phân loại cá tra Bộ : Siluriformes Họ : Pangasidae Giống : Pangasianodon Loài : Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) (http://www.maivietbio.com.vn/news_detail.php?id=346) Cá tra có nhiều đồng danh khác nhau và việc xác định tên khoa học của loài cá tra đến nay đã có nhiều tài liệu công bố, nhưng nhìn chung thì có sự khác, chưa có sự thống nhất. Tuy nhiên tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth (1996) sử dụng lần đầu tiên để chỉ định cho loài cá tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến đến nay. Do đó Pangasianodon hypophthalmus được sử dụng là tên khoa học của cá tra trong chuyên đề nay. b) Phân bố 4 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 1. Nuôi cá tra theo hình thức thâm canh ven sông Hậu (http://www.google.com.vn/imgres?q=nuoi+ca+tra+tham+canh+o+can+tho&um=1) Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông, có mặt ở cả 4 nước như: Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lưu vực sông Mê Kông và Chao phraya. Ở nước ta, cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởng thành chỉ thấy trong các ao nuôi, rất ít khi tìm thấy trong tự nhiên. c) Đặc điểm hình thái và sinh thái Hình 2. Hình thái học cá tra (http://www.google.com.vn/imgres?q ) Cá thân dài, không vảy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đôi râu dài. 5 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (độ muối từ 10 – 14%o), có thể chịu đựng được nước phèn với pH ≥ 4 (pH dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị sốc), ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nóng tới 390C. Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác. Bên cạnh đó cá có cơ quan hô hấp phụ và có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước có lượng oxy hòa tan thấp. Chính vì lý do này mà cá tra được nuôi với mật độ rất cao trong các ao nuôi cá tra thâm canh. d) Đặc điểm dinh dưỡng Cá hết noãn hoàn thì thích ăn mồi tươi sống, khi cá lớn tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, động vật đáy,… e) Đặc điểm sinh trưởng Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá tra trong tự nhiên 18kg và cá dài tới 1,8m. Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25kg ở cá 10 tuổi. Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1-1,5kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt 5-6kg/năm. f) Đặc điểm sinh sản Tuổi thành thục: Cá tra đực thành thục ở tuổi thứ 2, cá cái ở tuổi thứ 3 trở lên. Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp) nên nhìn hình dáng ngoài khó phân biệt cá đực hay cá cái. Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh, ở cá cái gọi là buồng trứng. Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch, cá sinh sản tụ nhiên ở những đoạn sông có điều kiện sinh thái phù hợp. Cá không sinh sản ở phần sông của Việt Nam. Ở Campuchia, bãi sinh sản của nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê Kông và Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache trở lên. Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi cho cá thành thục và sinh sản sớm hơn trong tự nhiên (3 tháng ) 6 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Trong tự nhiên không gặp tình trạng tái phát dục. Chỉ có trong điều kiện nuôi nhân tạo, cá tra có thể tái phát dục 1 – 2 lần trong năm. Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá được gọi là sức sinh sản tuyệt đối. Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra có thể từ 200.000 đến vài triệu trứng. (http://www.mekongfish.vn/vn/BanTinChiTiet.aspx?MaTin=TCN2) 2.2. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh gan thận mủ do Edwarsdsiella ictaluri trên cá da trơn 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Phân loại Ngành : Proteobacteria Lớp : Gammaproteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae Giống : Edwardsiella Loài : Edwardsiella ictaluri (http://en.wikipedia.org/wiki/Edwardsiella) Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa: Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, hình que và có kích thước biến đổi, không di động. Yếm khí tùy tiện, cho phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase, H2S, Indone. E. ictaluri phát triển tốt ở nhiệt độ 280C và phát triển yếu ở 370C trong khi E. tarda phát triển tốt ở 370C (Từ Thanh Dung et al., 2005). Khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri: Theo nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2008) thì do việc chọn và dùng thuốc kháng sinh không đúng cách đã làm cho độ nhạy của vi khuẩn E. ictaluri đối với các loại thuốc kháng sinh ngày càng giảm dần và nguy cơ không còn thuốc điều trị đang đến gần. 2.2.2. Tên bệnh và tác nhân gây bệnh Bệnh gan thận mủ còn có một số tên gọi khác là: bệnh trắng gan, bệnh mủ gan, bệnh ung thư gan. 7 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Từ Thanh Dung et al., 2005). 2.2.3. Phân bố, loài cá và giai đoạn nhiễm bệnh Vi khuẩn E. ictaluri xuất hiện đầu tiên trên cá nheo ở Mỹ, cá trê trắng ở Thái Lan. Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện trên cá tra, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Bệnh xuất hiện trên tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra. Tỉ lệ hao hụt lớn nhất ở cá giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá lứa cỡ 300 – 500g (Từ Thanh Dung et al., 2005). Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90% (http://www.angiang.gov.vn/wps/portal). 2.2.4. Dấu hiệu bệnh lý của bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri. Biểu hiện của cá: cá gầy, mắt hơi lồi. Cá bệnh nặng bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước và tỉ lệ chết cao. Dấu hiệu bệnh bên ngoài không rõ ràng. Bên trong: xuất hiện nhiều đốm trắng đục kích cỡ 1 -3 mm trên gan, thận và tỳ tạng (Từ Thanh Dung et al., 2005). 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn lactic, Lactobacillus spp. và tình hình nghiên cứu probiotic và bacteriocin 2.3.1. Vi khuẩn lactic và quá trình lên men acid lactic Vi khuẩn acid lactic (lactic acid bacteria – LAB) đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm. LAB là vi khuẩn Gram dương, oxydase âm tính, catalase âm tính, có dạng hình cầu hoặc hình que, không hình thành bào tử. Sản phẩm chủ yếu mà chúng tạo ra trong quá trình lên men carbonhydrate (glucose và lactose) là acid lactic. Một vài giống quan trọng như: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee et al., 1999). LAB được quan tâm đặc biệt do khả năng lên men cũng như những lợi ích về dinh dưỡng và sức khỏe cho người và vật nuôi. Vì vậy mà nhiều loài thuộc nhóm LAB đã được sử dụng như sinh vật chủ yếu trong các sản phẩm probiotic dùng cho người, chăn nuôi và thủy sản. Có được đặc tính này là do LAB tạo ra nhiều chất có khả năng ức chế các loài vi khuẩn khác (Bảng 1). 8 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 1. Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo ra bởi LAB Sản phẩm trao đổi chất Cơ chế kháng khuẩn CO2 Ức chế quá trình decarboxylation Giảm tính thấm của màng Diacetyl Tương tác với những protein gắn với arginine Lactoperoxidase/H2O2 Oxi hóa những protein nền Acid lactic Những phân tử acid lactic không phân ly sẽ xuyên qua màng tế bào làm giảm pH nội bào Làm cản trở quá trình trao đổi chất như phosphryl oxi hóa Bacteriocin Ảnh hưởng tới màng tế bào, sinh tổng hợp protein và DNA Lên men acid lactic là quá trình chuyển hóa yếm khí các chất glucose thành acid lactic nhờ hoạt động sống trực tiếp của vi sinh vật. Tùy thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà người ta chia quá trình lên men acid lactic thành hai loại: lên men acid lactic đồng hình và lên men acid lactic dị hình. Theo Abee et al., (1999) thì quá trình này có đặc điểm sau: Lên men acid lactic đồng hình: nhờ hoạt động lên men của nhóm vi khuẩn lactic đồng hình. Chúng biến đổi đường thông qua quá trình đường phân và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic. Quá trình lên men acid lactic đồng hình được cho là có lợi về mặt năng lượng (ATP) cho vi khuẩn acid lactic vì chúng tạo ra được 2 phân tử ATP và 2 phân tử acid lactic từ 1 phân tử đường được lên men. Có rất nhiều loài vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình: Lactobacillus lactis sspp. lactis, Lactobacillus lactis sspp. cremoris, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,… Quá trình lên men lactic đồng hình: 1 Glucose  2 acid lactic + 2 ATP Lên men acid lactic dị hình: nhờ hoạt động lên men của vi khuẩn lactic dị hình. Trong trường hợp này chỉ tạo thành 1 phân tử acid lactic từ 1 phân tử glucose được lên men, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid lactic, ethanol, CO 2. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Một số loài LAB lên men acid 9 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT lactic dị hình: Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides sspp. cremoris, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum,… Quá trình lên men acid lactic dị hình: 1 Glucose  1 Acid lactic + 1 CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + Một số sản phẩm phụ 2.3.2. Vi khuẩn Lactobacillus spp. Phân loại: Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus (http://en.wikipedia.org /wiki/Lactobacillus) - Đặc điểm: Lactobacillus là giống lớn nhất trong nhóm vi khuẩn acid lactic, giống này gồm nhiều loài có sự đa dạng lớn về các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa. Tuy nhiên, ngoài các đặc điểm chung của LAB thì đặc điểm điển hình để nhận ra giống này là chúng có hình que. Giống Lactobacillus bao gồm một nhóm vi khuẩn có đặc điểm: que dài và mảnh, đôi khi có dạng que cong, thường không chuyển động, không hình thành bào tử, gram dương, không dịch hóa gelatin, catalase và oxydase đều âm tính, không tạo indole và H2S, quá trình lên men luôn tạo sản phẩm chứa acid lactic. Lactobacillus rất phổ biến và được dùng như là giống chủng trong công nghiệp thực phẩm, nhiều loài thuộc giống Lactobacillus được sử dụng rộng rãi trong chế biến phô-mai (Lactobacillus delbrueckii spp., Lactobacillus helvericus, Lactobacillus casei), bơ sữa (Lactobacillus delbrueckii), sữa lên men (Lactobacillus acidophilus) và yoghurt (Lactobacillus delbrueckii). Ngoài ra Lactobacillus cũng được dùng trong sản xuất xúc xích (Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum) (Abee et al., 1999). 2.3.3. Những nghiên cứu về probiotic và bacteriocin từ vi khuẩn acid lactic Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ (FAO/WHO, 2001). 10 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học