Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá trèn, mắm cá tra

  • Số trang: 81 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 15 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ TRÈN, MẮM CÁ TRA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN HUỲNH THANH TRANG MSSV:3102869 LỚP:CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 5/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ TRÈN, MẮM CÁ TRA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN HUỲNH THANH TRANG MSSV:3102869 LỚP:CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 5/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) Bùi Thị Minh Diệu SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Huỳnh Thanh Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Cha, mẹ gia đình, và những người bạn đã luôn ủng hộ, tiếp sức cho tôi. Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, giúp tôi đến khi tôi hoàn thành luận văn. Tập thể cán bộ, sinh viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật và phòng thí nghiệm Sinh Hóa, đặc biệt xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến bạn Phạm Thái Vy, Trần Bá Phúc, Nguyễn Thị Cẩm Tiên, Lê Hùng Cường, Lư Trang Nguyên Thảo đã nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị cần thiết trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như chia sẽ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thưc hiện Huỳnh Thanh Trang TÓM LƢỢC Collagenase là enyme được ứng dụng trong nhiều nghành công nghiệp cũng như trong y tế, dược phẩm, mỹ phẩm đồng thời là enzyme có khả năng thủy phân collagen. Từ các ứng dụng đó, việc tìm ra phương pháp thu nhận enzyme collagenase rất được chú ý. Sử dụng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase để sản xuất collagenase là một phương pháp hiệu quả nhất, vừa an toàn, chi phí thấp, không gây ô nhiễm môi trường từ đó cũng rất được quan tâm. Lựa chọn nguồn phân lập là các sản phẩm lên men truyền thống an toàn và đa dạng chủng vi sinh vật như là mắm cá Trèn và mắm cá Tra. Phân lập được 46 dòng vi khuẩn trên môi trường gelatin và tuyển chọn được 46 dòng một lần nữa trên môi trường collagen (25 dòng từ nguồn mắm cá Trèn, 21 dòng từ nguồn mắm cá Tra). Các dòng có dạng hình tròn và hình thoi; độ nổi đa dạng gồm lài, mô, phẳng; màu sắc vi khuẩn chủ yếu là trắng đục và trắng trong. Trong 46 dòng vi khuẩn, chỉ có 22 dòng tạo được vòng thủy phân trên cơ chất collagen. Tuyển chọn 11 dòng vi khuẩn có vòng thủy phân lớn (lớn hơn 10mm) tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme. Sau khi nuôi tăng sinh trong môi trường Czapek 5 ngày ở 35°C, tất cả 11 dòng đều cho có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase và hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày thứ 4. Dòng TA10 phân lập từ nguồn mắm cá tra cho hoạt tính cao nhất 5,144 U/ml và dòng TN18 phân lập từ nguồn mắm cá trèn cho hoạt tính cao thứ 2 đạt 4,480 U/ml, cả hai dòng này đều có tiềm năng sản xuất enzyme collagenase. Kết quả quan sát hình thái, nhuộm gram vi khuẩn và khả năng sinh hóa cho thấy cả hai dòng TA10 và TN18 đều có khả năng di động, gram dương, vi khuẩn hình que, có khả năng sinh enzyme catalase và enzyme amylase , không có khả năng sinh acetyl–methylcarbinol. Trong thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase chỉ có dòng TN18 có khả năng sinh enzyme. Từ khóa: Collagenase, vi khuẩn phân giải collagen, collagen. MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ................................................................................................ LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... TÓM LƢỢC ............................................................................................................ i MỤC LỤC ................................................................................................................ ii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. vi TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................... 1 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU........................................................... 2 2.1. Tổng quan về mắm ............................................................................................ 2 . 2.1.1. Giới thiệu chung về mắm ......................................................................... 2 2.1.2. Vi sinh vật trong mắm .............................................................................. 2 2.2 Tổng quan về collagen ........................................................................................ 3 2.2.1. Giới thiệu collagen ................................................................................... 3 2.2.2. Thành phần và cấu trúc của collagen ....................................................... 3 2.2.3. Phân loại collagen.................................................................................... 7 2.2.4. Tính chất của collagen .............................................................................. 9 2.2.5. Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen ................................................. 10 2.3 Giới thiệu về gelatin............................................................................................ 10 2.4. Tổng quan về collagenase ................................................................................. 12 2.4.1. Khái niệm về collagenase ......................................................................... 12 2.4.2. Nguồn collagenase.................................................................................... 12 2.4.2.1. Collagenase của mô .................................................................... 13 2.4.2.2. Collagenase vi sinh vật ................................................................ 14 2.4.3. Một số tính chất cơ bản của các collagenase đã được phát hiện .............. 17 2.4.4. Ứng dụng của collagenase ........................................................................ 18 2.4.4.1. Sử dụng collagenase trong nghiên cứu collagen .......................... 19 2.4.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm ...................................................... 19 2.4.4.3. Trong y - dược .............................................................................. 20 2.4.4.4. Trong mỹ phẩm và các nghành công nghiệp khác ....................... 21 2.5. Vi sinh vật phân giải collagen đã đƣợc nghiên cứu ........................................ 21 2.6. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân hủy collagen ..... 22 2.6.1. Một số nghiên cứu trong nước................................................................... 22 2.6.2. Một số nghiên cứu ngoài nước .................................................................. 23 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 25 3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 25 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 25 3.2.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 25 3.2.2. Thiết bị và hóa chất ................................................................................... 25 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 26 3.3.1. Chuẩn bị mẫu vật và môi trường nuôi cấy ................................................. 26 3.3.2. Phân lập vi khuẩn ....................................................................................... 27 3.3.3. Đánh giá khả năng phân giải collagen của các dòng vi khuẩn ................... 29 phân lập được 3.3.4. Xác định hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn được tuyển .......... 31 chọn 3.3.5. Đặc tính hình thái và một số khả năng sinh hóa của các dòng ................... 33 được tuyển chọn. CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................ 36 4.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn sơ bộ các dòng vi khuẩn có khả năng .......... 36 sinh tổng hợp enzyme collagenase 4.2. Khả năng phân giải collagena của các dòng vi khuẩn phân lập .................. 40 đƣợc 4.3. Hoạt tính collagenase của các dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .................... 42 4.4. Xác định hình thái và một số khả năng sinh hóa của các dòng vi khuẩn ... 45 đƣợc tuyển chọn 4.4.1. Xác định hình thái vi khuẩn của các dòng vi khuẩn được ...................... 45 tuyển chọn 4.4.2. Một số đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn đươc tuyển ................... 46 chọn CHƢƠNG 5. KẾT LUÂN ĐỀ NGHỊ ................................................................. 48 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 48 5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 49 PHỤ LỤC .................................................................................................................. PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM .................................. PHỤ LỤC 2. MẬT SỐ VI KHUẨN .............................................................. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ........................................................ PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH ................ VI KHUẨN PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ ........................................................... DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Một số loài vi sinh vật trong các sản phẩm lên men .................................... 3 Bảng 2. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide .................................... 7 Bảng 3. Phân loại collagen ......................................................................................... 8 Bảng 4. Một số collagenase của mô đã đưoc nghiên cứu .......................................... 13 Bảng 5. Một số collagenase vi sinh vật ...................................................................... 15 Bảng 6. Thành phần môi trường Czapek cải tiến ...................................................... 26 Bảng 7. Thành phần môi trường Czapek tăng sinh .................................................... 27 Bảng 8. Phương pháp pha loãng ................................................................................. 28 Bảng 9. Đường chuẩn leucine .................................................................................... 32 Bảng 10. Các giai đoạn và hóa chất trong nhuộm Gram ............................................ 35 Bảng 11. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trong điều ..... 38 kiện hiếu khí Bảng 12. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .... 41 Bảng 13. Đặc tính hình thái của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ....................... 44 Bảng 14. Đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ........................ 45 DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cấu trúc tropocollagen (triple helix) ............................................................. 4 Hình 2. Trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi xoắn α của collagen ............... 5 loại I ở bò Hình 3. Cấu trúc sợi của collagen............................................................................... 6 Hình 4. Cấu trúc chuỗi cơ bản của gelatin ................................................................. 11 Hình 5. Nguyên lý nhuộm Gram ................................................................................ 34 Hình 6. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn .................................................. 38 Hình 7. Biểu đồ thể hiện đường kính vòng thủy phân của các dòng vi khuẩn .......... 39 phân lập được Hình 8. Vòng thủy phân của các dòng vi khuẩn ........................................................ 40 Hình 9. Mẫu vi khuẩn nhuộm gram............................................................................ 44 Hình 10. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hóa của các dòng vi khuẩn được ......... 46 tuyển chọn. TỪ VIẾT TẮT CFU Clony-Forming Unit DC Đối chứng MR Methyl red OD Optical Density STT Số thứ tự TCA Trichloroacetic acid VP Voges – Proskauer MR - VP Broth Môi trường methyl red - Voges – Proskauer UV Ultraviolet FACIT Fibril – Associated Collagen with Interrupted Triple helices Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Với xu hướng phát triển của công nghệ sinh học trong đời sống và công nghiệp ngày nay, công nghệ enzyme trở thành một kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học trong việc tối ưu hóa nhiều quy trình công nghiệp, nâng cao chất lượng và an toàn sản xuất. Nhiều enzyme vi sinh vật được quan tâm và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Khoảng 60% lượng enzyme được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, 16 enzyme hiện được coi là enzyme công nghiệp. Trong những năm gần đây, vai trò của công nghiệp collagen ngày càng quan trọng trong y học, thực phẩm, khoa học, mỹ phẩm. Enzyme collagenase được xem là enzyme duy nhất có khả năng phân giải collagen ở trạng thái nguyên thủy. Vì thế, việc tìm kiếm và sản xuất collagenase trở nên vô cùng hấp dẫn. Ngoài ra, collagenase là enzyme có nhiều ứng dụng trong các nghành công nghiệp như: thực phẩm (làm mềm thịt, cải thiện cảm quan của thi ), công nghiệp hóa chất, nghiên cứu khoa học (tách dòng tế bào như tinh trùng, tế bào mô da..) , đặc biệt là trong y tế (chữa bệnh Peyronie, phân lập tế bào), dược phẩm, mỹ phẩm (làm vỏ thuốc, da nhân tạo). Hiện nay đã có nhiều phương pháp sản xuất collagenase từ các phụ phẩm (da động vật, đầu tôm) bằng việc tách chiết tốn thời gian và chi phí cao, có khả năng gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy việc nghiên cứu các phương pháp sản xuất collagenase hiệu quả và thân thiện với môi trường là một vấn đề nóng hổi và bức bách. Đặc biệt là tại Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về enzyme collagenase. Với mục đích phân lập vi khuẩn có khả năng sản xuất collagenase làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng sản xuất collagen cung cấp cho các nghành khác, đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá Trèn, mắm cá Tra” được thưc hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh để hướng tới sản xuất collagen sinh học nhờ các phụ phẩm nông nghiệp. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về mắm 2.1.1. Giới thiệu chung về mắm Mắm cá là món ăn truyền thống lâu đời tại một số nước Đông Nam Á như: Lào, Cambodia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Myanmar, Indonesia và Philippines. Tại Việt Nam, mắm được sản xuất nhiều và là đặc sản của miền Tây Nam Bộ nói chung, Châu Đốc – An Giang nói riêng. Bên cạnh các loại mắm nổi tiếng như: mắm cá Linh, mắm cá Lóc, mắm cá Chốt, mắm cá tra, mắm ruột cá, mắm trứng cá mắm cá Trèn cũng được ưa chuộng bởi hương vị đặc biệt. Về mặt dinh dưỡng có thể mắm không bằng cá tươi nhưng có hương vị đặc thù và dễ phối hợp tạo ra những món ăn đặc sản của địa phương (bún mắm, lẩu mắm, mắm chưng,…). Những ưu thế của các sản phẩm mắm đối với dân cư trong khu vực là: khả năng chấp nhận sản phẩm cao, giá rẻ, dễ chuẩn bị, an toàn, cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thụ. Mắm được xem là sản phẩm của quá trình lên men lactic, còn được dùng để ngăn chặn một số loại vi khuẩn đường ruột và dạ dày (P.Saisithi et al., 1987). Cá lên men có thể trở thành loại thực phẩm tốt cho những người mắc bệnh kém hấp thu dinh dưỡng (Areekul et al., 1974). Các sản phẩm mắm đều có mặt vi khuẩn lactic (Saisithi et al., 1987). 2.1.2. Vi sinh vật trong mắm Một số nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trong mắm có sự hiện diện của 109 loại vi khuẩn khác nhau. Từ mắm đã phân lập được 91 loại vi khuẩn lactic các loại này có khả năng chịu được nồng độ muối cao và pH thấp. Đặc biệt là Staphylococus aureus chịu được ở pH = 1,5 – 3 trong hơn 5 giờ. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 1. Một số loài vi sinh vật trong các sản phẩm lên men Quốc gia Sản phẩm Vi sinh vật Nhật Bản Shottsuru Pediococcus homeri , Halobacteriium spp Ika-shiokara Micrococcus spp, Staphyloccus sp Debaryomyces spp Thái Lan Plara P.Halophilus, Staphylococcus spp, Taipla ( ruột cá lên men) Halobacterium spp, Halococcus spp. Budu Pediococcus spp, P. Halophilus; Staphylococcus spp. Pediococcus spp; P.Halophilus Philippines Patis Pediococcus spp, Bacillus spp; P.halophilus; Micrococcus spp; Halobacterium spp; Halococcus spp; Bacillus spp Việt Nam Mắm ruốc Staphylococcus sp, Bacillus sp, Halomonas sp, Kocuria sp 2.2. Tổng quan về collagen 2.2.1. Giới thiệu collagen Collagen là một loại protein chính của mô nối động vật và là protein dồi dào nhất ở những động vật có vú, chiếm khoảng 25% tới 35% trong tổng số các protein khung mạng cơ thể. Collagen tạo nên 1% tới 2% của mô cơ, và chiếm 6% về trọng lượng của gân, xương, dây chằng, sụn và hệ thống tim mạch trong cơ thể (Sikorski, 2001). Collagen tạo ra hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm… Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hay bị tổn thương, sợi collagen mất dần qua các tác động đó. 2.2.2. Thành phần và cấu trúc của collagen Hầu hết các collagen tự nhiên đều có cấu trúc giống nhau trừ một số loại collagen có cấu trúc đặc biệt của mô liên kết ở động vật có xương sống hoặc không có xương sống, các loại collagen này có thể có thành phần hoặc cấu trúc bậc cao hơi khác với các collagen thông thường khác. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Cấu trúc của collagen Mỗi phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc. Đơn vị cơ bản của collagen là Tropocollagen”, liên kết với nhau tạo thành những sợi nhỏ. Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗi α cuộn lại với nhau theo chiều từ trái qua phải tạo thành cấu trúc triple – helix, được gọi là đường xoắn ốc đặc biệt”, được ổn định bởi các liên kết hydro nội phân tử giữa các chuỗi. Mỗi chuỗi α cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải qua trái với 3 gốc trên 1 vòng xoắn, hay còn gọi là proline I (xoắn trái với 3,3 gốc aminoacid/vòng) (Fratzil.P, 2008). Hình 1. Cấu trúc tropocollagen (triple helix) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kì nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì thế collagen rất chắc, dai và bền. Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Thông thường các chuỗi theo mẫu sau: (-Gly-Pro-X-) hoặc (-Gly-Pro-Hyp-) tạo nên tính đặc trưng cho collagen (trong đó prolin và hydroxyprolin chiếm 20%) ở đây X là các acid amin bất kỳ với alanin chiếm 25% trong tổng số các acid amin). Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6 tổng số chuỗi. Xen giữa các đoạn lặp đó là các vùng có cực với tổng lượng gốc glycine chiếm 33% số chuỗi, nằm ở vị trí thứ nhất của gốc xoắn ba, ở các vị trí thứ hai và thứ ba thường là các acid amin có cực. Tại đây, chỉ các gốc glycine là nằm trong gốc xoắn và vì thế các acid amin khác trong các phân tử collagen có thể tham gia tương tác với nhau. Hình 2. Trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi α của collagen loại I ở bò Tại các đầu của từng chuỗi xoắn peptide của collagen, đặc biệt là tại đầu nitơ, thường tồn tại khoảng 15 gốc acid amin không có trình tự lặp lại đặc trưng của collagen và thường có thành phần giống thành phần của các protein hình cầu. Phần cấu tạo này không nằm trong vùng xoắn của collagen và có thể bị các protease khác tấn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT công trong khi chỉ có collagenase mới có khả năng tấn công các liên kết nằm trong vùng xoắn của collagen. Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh nhỏ. Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hình thành nên bộ ba tropocollagen. Sau đó tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cấp – collagen fiber. Hình 3. Cấu trúc sợi của collagen Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì thế collagen rất chắc dai và bền. Thành phần các acid amin có trong collagen Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline. Collagen không chứa tryptopan, và là một trong số ít các protein chứa hydroxylysine. Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 2. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide Bộ ba amino acid Tỷ lệ so với tổng bộ ba (%) Gly – X – X 44 Gly – X – Y 20 Gly – Y– X 27 Gly – Y – Y 9 Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau tạo thành một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Trong collagen không chứa tryptopan, cysteine như các loại protein khác, còn tyrosin, histidin và các aicd amin chứa lưu huỳnh hiện diện không quá 1%, điều này làm cho cầu nối disulfur (-S-S) trong cấu trúc collagen xuất hiện ít và là nguyên nhân cho tính mềm dẻo của nó so với keratin, nhưng chứa rất nhiều hydroxyproline. Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại proten khác không có, nó được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi được kết hợp vào vị trí Y có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc collagen do có gắn nhóm –OH ở vị trí cacbon gamma. Trong collagen có chứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine. 2.2.3. Phân loại collagen Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Tính đến thời điểm hiện nay, có 42 chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau tạo thành 27 loại collagen được tìm thấy và thông báo trong các tài liệu khoa học. Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III và IV. Dựa theo cấu trúc và tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagen được chia thành 7 dạng chính: collagen hình dạng sợi, FACIT collagen, collagen chuyển màng, collagen nền và các loại collagen có chức năng duy nhất khác (bảng 3). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 3. Phân loại collagen Dạng Loại I II Kết cấu chuỗi Phân bố (α1(I))2α2(I), Trimer da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương ( (α1(I))3 thành phần chính của xương) (α1(II))3 sụn xương( thành phần chính của sụn) có trong bắp ( thành phần chính của bắp), Collagen dạng sợi III tìm thấy bên cạnh collagen I. Mạch máo, (α1(III))3 van tim, hạ bì, ruột, nướu răng, thành tử cung. α1(V)α2(V)α3(V) hoặc V (α1(V))2α2(V) hoặc dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô (α1(v))3 Màng nền collagen Collagen vi sợi Sợi neo collagen Dạng XI α1(XI)α2(XI)α3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh. IV (α1(IV))2α2(IV) Thành phần chính cấu tạo màng tế bào VI α1(VI)α2(VI)α3(VI) có trong gan, thận, màng sụn, da, cơ tim. VII (α1(VII))3 Da, phổi, sụn, giác mạc. VIII Chưa biết có trong màng trong X (α1(X))3 Sụn IX α1(IX)α2(IX)α3(IX) Sụn XII (α1(XII))3 Gân, dây chằng. XIV Chưa biết sợi liên kết collagen XIX Chưa biết mạng lưới lục giác collagen FACIT collagen Chuyên ngành Công nghệ Sinh học mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu phát triển 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Collagen chuyển màng Trường ĐHCT Biểu mô giác mạc, phôi da, xương ức, XX (α1(XIX))3 XXI (α1(XXI))3 XIII (α1(XIII))3 XVII (α1(XVII))3 XV (α1(XV))3 XVI (α1(XVI))3 Nguyên bào sợi, phiến keratin,… XVII (α1(XVII))3 Phổi, gan,… sụn, gân,… Thành mạch máu,… Biểu bì, nang tóc, ruột, sụn bào, phổi, gan,… Vùng chuyển tiếp biểu bì – da… Nguyên bào sợi, các tế bào cơ trơn, thận, tụy,… (*Nguồn: K.Gelse et al., 2003) Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại tở các mô sụn, mô võng mạc, giác mạc và thủy tinh thể. Dạng này chứa một lượng lớn cacbonhydrat và hydroxylysin. Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật (da heo còn non chứa 50%), theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 – 10%, có trong thành mạch máu, trong da của phôi, trong cơ và trong gan. Những loại collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt. Đối với collagen thuỷ phân sẽ cung cấp được cho cơ thể các nhóm collagen loại I,II,III,IV,V. Các bệnh về collagen thường do sự khiếm khuyết của gene gây nên tác động cho quá trình tổng hợp sinh hóa, sự sắp xếp, sự sao chép bị thay đổi, hoặc các quá trình khác trong việc hình thành của collagen. 2.2.4. Tính chất của collagen Collagen là một protein cấu trúc. Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein. Tác dụng với nước Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước là trương nở collagen. Cứ 100g Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -