Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải của nhà máy giấy tái chế

  • Số trang: 77 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 19 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH METAN TRONG NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY GIẤY TÁI CHẾ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG NGUYỄN THỊ HOÀNG NGÂN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN MSSV: 3092493 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, 2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. Trần Nhân Dũng CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Nguyễn Thị Hoàng Ngân 2 ThS. Võ Văn Song Toàn DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp ở Trường Đại học Cần Thơ, bên cạnh những thuận lợi còn có nhiều khó khăn, thất bại. Không những bản thân cố gắng, tìm tòi nghiên cứu mà còn nhờ vào sự động viên, khích lệ của gia đình, sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đó là nguồn động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn – người thầy cố vấn chuyên môn của tôi - đã truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và cũng cố tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc, giúp tôi có định hướng nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn cuộc sống, đồng thời đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đặc biệt là Thầy Đỗ Tấn Khang luôn tận tình giúp đỡ và truyền dạy cho tôi kiến thức, giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên, cùng các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này. Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Đề tài: “phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải nhà máy giấy tái chế” được tiến hành dưới mục đích tìm ra và khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn sinh metan. Môi trường nuôi cấy không có thành phần carbon hữu cơ được chuẩn bị kị khí bằng cách sục khí N2 để đuổi khí O2, thời gian sục 40 phút ở tốc độ dây 1kg/cm3 cho 500ml môi trường là thời gian tối ưu. Khí N2 sau đó được thay thế bằng hỗnhợp khí H2 và CO2 theo tỉ lệ 1:4, hỗn hợp khí này đóng vai trò như cơ chất. Mặc dù thí nghiệm không phát hiện được vi khuẩn sinh metan, mà thay vào đó là 5 dòng vi khuẩn có khả năng cố định CO2 bằng những enzyme tương tự như những enzyme trong loài vi khuẩn sinh methan. 5 loài lần lượt là D1, D2, D3, D4 và D5. Trong đó có D1 thuộc loài Shigella với mức độ đồng hình là 97% và D3, D4 thuộc loài Enterobacteria với mức độ đồng hình đều là 99%. Tuy mức độ đồng hình của D3 và D4 với Enterobacteria cùng cao như nhau nhưng do có sự khác biệt về hình thái cũng như khả năng trao đổi chất nên 2 dòng D3 và D4 có thể là hai nhóm nhỏ khác nhau của cùng loài Enterobacteria. Nhìn chung, khả năng trao đổi chất của cả 5 dòng thể hiện qua độ giảm thể tích khí đều diễn ra mạnh và nhanh, trong đó mạnh nhất là 2 dòng D1: 7,67% và D4: 8% , kế đến là D3: 6,33%. Đường tăng trưởng của cả 5 dòng đều có pha chỉ số ngắn, trong vòng 12 giờ đầu, và đi vào pha chết ở ngày thứ 4 hoặc thứ 5. Từ khóa: áp suất, cố định CO2, đồng hình, kị khí, Methan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ..............................................................................................................i LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................................i TÓM LƯỢC .........................................................................................................................i MỤC LỤC .......................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ..........................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................................ viii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................ 1 1.1 Đăt vấn đề...................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài .............................................................................................. 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan: .................................................................... 3 2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí ............................................................................ 5 2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế ............ 7 2.4 Các nghiên cứu liên quan ............................................................................... 8 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 9 3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................. 9 3.1.1 Thời gian .................................................................................................... 9 3.1.2 Địa điểm ..................................................................................................... 9 3.1.3 Nguyên liệu ................................................................................................ 9 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất...................................................................... 9 3.2 phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí ........................................................... 12 3.2.2 Khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí ....... 13 3.2.3 Phân lập vi khuẩn ..................................................................................... 14 3.2.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí..................................................................................... 15 3.2.5 Khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn ................................ 16 3.2.6 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA........................................................... 17 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................... 19 4.1 Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí ................................................. 19 4.2 Kết quả khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí.......................................................................................................................... 21 4.3 Kết quả phân lập ........................................................................................... 23 4.4 Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa CO2 và H2 ................ 25 4.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn ................... 27 4.5.1 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D1 ........................................... 27 4.5.2 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D2 ............................................. 1 4.5.3 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D3 ........................................... 29 4.5.4 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D4 ........................................... 30 4.5.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D5 ........................................... 31 4.6 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn......... 33 4.6.1 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S RNA của dòng D1 ......................... 34 4.6.2 Kết quả giải trình tự dòng D3: ................................................................. 37 4.6.3 Kết quả giải trình tự dòng D4: ................................................................. 39 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 44 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 44 5.2 Kiến nghị ........................................................................................................ 44 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 45 PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ........................................................ 1 PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU KẾT QUẢ ................................................................................... 3 PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THỐNG KÊ VÀ GIẢI TRÌNH TỰ .......................................... 6 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1 Thành phần khí biogas .................................................................................... 6 Bảng 2. Thành phần môi trường theo Zeikus ............................................................ 10 Bảng 3. Thành phần khoáng ...................................................................................... 11 Bảng 4. Thành phần vitamin ...................................................................................... 11 Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí .............................................................. 15 Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn .................................................. 23 Bảng 7. Đặc điểm hình thái của 3 dòng D1, D3, D4 ................................................. 41 Bảng 8. Nồng độ oxy ở các nghiệm thức thời gian Bảng 9: Khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của các dòng vi khuẩn Bảng 10. Mật số vi khuẩn D1 Bảng 11. Mật số vi khuẩn D2 Bảng 12. Mật số vi khuẩn D3 Bảng 13. Mật số vi khuẩn D4 Bảng 14. Mật số vi khuẩn D5 Bảng 15: Số liệu thống kê hàm lượng oxy Bảng 16: Số liệu thống kê hàm lượng khí giảm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO2 ................................................... 4 Hình 2. Vai trò của F420 ............................................................................................. 4 Hình 3. Quá trình tổng hợp metan ............................................................................... 5 Hình 4. Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành 3 giai đoạn chính .................... 6 Hình 5: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR ............................................................... 1 Hình 6: Hệ Thống nuôi cấy kỵ khí. ........................................................................... 20 Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian. .............................................. 21 Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kết quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100.. 24 Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng .................................................. 25 Hình 10: Đường tăng trưởng của D1 ......................................................................... 27 Hình 11: Đường tăng trưởng của D2 ......................................................................... 28 Hình 12: Đường tăng trưởng của D3 ......................................................................... 29 Hình 13: Đường tăng trưởng của dòng D4 ................................................................ 30 Hình 14: Đường tăng trưởng của dòng D5 ................................................................ 31 Hình 15: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại vùng gene 16S rRNA trên gel agarose 1,5% của 3 dòng vi khuẩn. Sản phẩm điện di xuất hiện ở kích thước khoảng 1500bp........................................................................................................................ 33 Hình 16: Kết quả tra cứu trên Blast của D1 ............................................................... 34 Hình 17: Sơ đồ miêu tả đơn giản cơ chế cố định CO2 của enzyme PEPC ................ 35 Hình 18: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dong D1 và Shigella sonnei Ss046 .............................................................................................................. 36 Hình 19: Kết quả tra cứu trên Blast của D3 ............................................................... 37 Hình 20: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D3 và Enterobacter sp. REICA........................................................................................................................ 38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Hình 21: Kết quả tra cứu trên Blast của D4 ............................................................... 39 Hình 22: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D4 và Enterobacter sp. REICA........................................................................................................................ 40 Hình 23: Cây phả hệ (phylogenic tree) giữa các dòng D1, D3 và D4 với các loài đồng hình trên ngân hàng gene so sánh với một số chủng methanogen............ Error! Bookmark not defined. Hình 24: Phổ đồ giải trình tự gene 16S của D1 Hình 25: Phổ đồ giải trình tự 16s của D3 Hình 26: Phổ đồ giả trình tự của D4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT PEPC: Phosphoenolpyruvate carboxylase DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid TNHH: Trách nhiệm hữu hạn NT: Nghiệm thức Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đăt vấn đề Công nghiệp giấy là một trong những nền công nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong kinh tế quốc gia. Mỗi năm Việt Nam sản xuất 1,13 triệu tấn giấy, trong tổng số đó giấy tái chế chiếm 70% (Vũ Ngọc Bảo, 2010). Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn về kinh tế – xã hội, nghành công nghiệp này cũng phát sinh nhiều vấn đề môi trường bức xúc cần phải giải quyết, đặc biệt là nước thải. Nước thải của các nhà máy giấy có hàm lượng COD khá cao 22000-46500 mg/l, BOD chiếm từ 40-60% COD (Công ty môi trường Ngọc Lân, 2012). Do đó việc xử lý trước khi xả vào nguồn tiếp nhận là một điều tất yếu. Các phương pháp hóa lý đã được ứng dụng để giải quyết vấn đề một cách nhanh chóng. Tuy nhiên những phương pháp này để lại các chất tồn đọng gây ô nhiễm môi trường về lâu dài và có chi phí vận hành cao. Vì vậy, phương pháp xử lý sinh học được xem như là phương pháp triệt để nhất. Mặc dù vậy, phương pháp này còn bị hạn chế do thời gian xử lý chậm. Nên việc tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian xử lý là một ưu tiên hàng đầu. Dựa trên lý do đó đề tài được xây dựng với mục đích tìm kiếm những loài vi khuẩn sinh metan - một trong những loài sinh trưởng chậm, nhưng có hiệu quả kinh tế cao do khả năng sản xuất metan thu hồi- tối ưu về thời gian sinh trưởng và khả năng sinh khí để ứng dụng vào chu trình xử lý nước thải. Methanogen là vi khuẩn cổ sinh metan hoạt động như mắc xích cuối trong chuỗi chuyển hóa cơ chất ở hồ kị khí. Loài vi khuẩn này không những phân giải được các acid béo, methanol cùng nhiều chất gây ô nhiễm khác mà còn có khả năng sản sinh ra khí metan, một khí đóng vai trò quan trọng trong thành phần biogas do cung cấp nhiệt lượng cao. Ngoài hình thức sinh trưởng dị dưỡng, methanogen còn có hình thức hóa tự dưỡng. Chúng có khả năng sử dụng CO2 như nguồn cơ chất carbon. Làm giảm sự hiện diện của CO2 hòa tan trong nước thải - nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý môi trường, ức chế hoặc gây ngộ độc CO2 cho các sinh vật hiếu khí, gây mất cân bằng sinh thái. Đồng thời, do có sự hiện diện của loài vi sinh vật này mà hồ kị khí có khả năng tái tạo khí đốt khá cao góp phần đem lại giá trị kinh tế (metan thu hồi gần bằng 4% tổng lượng khí đốt) (Barker, 1956). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Tuy nhiên ở Việt Nam các nghiên cứu chuyên sâu về loài vi sinh vật này còn nhiều hạn chế dẫn đến những lợi ích mà loài này đem lại vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi. Vì vậy đề tài với mục đích tìm ra một số dòng methanogens trong nước thải nhà máy giấy tái chế để quan sát đánh giá về khả năng sinh methan và tốc độ tăng trưởng của từng dòng với hi vọng có thể chọn được những dòng có khả năng sinh methan cao trong thời gian ngắn nhằm hỗ trợ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sinh metan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan: Vi khuẩn sinh metan sống trong môi trường kị khí bắt buộc. Kết hợp với các vi sinh vật kị khí khác để phân giải các chất hữu cơ có trong nước thải, đầm bùn và dịch tiêu hóa cũng như các hệ sinh thái khác. Vi khuẩn sinh metan được chia thành nhiều nhóm với nhiều hình dạng khác nhau. Tuy vậy, tất cả có chung một vài đặc điểm nhất định. Các vi khuẩn này đều có khả năng sử dụng hidro như một nguồn năng lượng. Nguồn carbon chủ yếu từ forrmate, methanol. Một phương thức khác là có thể tổng hợp carbon cho tế bào từ CO2. Theo tính toán thì hydro và formate là nguồn năng lượng tương đương nhau, hai nguồn năng lượng thấp hơn là methanol và acetate. Phân tích trên một mol CH4 tạo thành cho thấy năng lượng do hô hấp hydro nhiều hơn khoảng 4 lần năng lượng do lên men acetate (Zeikus, 1977). Hình thái: Có 4 kiểu hình thái của vi khuẩn sinh metan: dạng hạt kê, hình que, hình cầu và dạng xoắn. Dạng hình que thường cong và có thể kết hợp thành hình chuỗi hoặc dạng sợi mảnh.Vi khuẩn sinh metan rất đa dạng về cấu trúc và không có những đặc điểm cấu trúc đặc trưng để nhận biết. Cấu trúc vách tế bào cũng hoàn toàn khác nhau, hầu hết là vi khuẩn Gram dương nhưng một số loài có thể là Gram âm hoặc đa dạng Gram. Chỉ mỗi loài Methanobacterium có thành tế bào là Gram dương đặc trưng (Ziekus, 1977). Phân loại sinh học: việc phân loại chủ yếu dựa vào hình dạng tế bào, nguồn carbon và đặc điểm sinh lý (Bryant, 1974). Sự khác nhau về hình thái, không giống nhau về tổ chức cấu tạo, nguồn dinh dưỡng đa dạng và giá trị G+C của DNA nằm ở các mức khác nhau cho thấy sự đa dạng về nguồn gốc và phương thức chuyển hóa nguồn năng lượng của các vi khuẩn sinh metan. Phương thức chuyển hóa: đặc điểm chuyển hóa nổi bật của các loài vi khuẩn này là kết hợp sự oxi hóa hydro và sự khử CO2. Sự khác nhau giữa vi khuẩn sinh metan và các loài sinh vật tự dưỡng sử dụng CO2 làm nguồn carbon cho tế bào là vi khuẩn sinh metan sử dụng CO2 cho cả việc cố định carbon và sự khử metan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Thành phần sinh hóa đặc trưng: hai thành phần sinh hóa được coi là đặc trưng của vi khuẩn sinh metan là Coenzyme M (CoM) (Tzeng et al, 1975) và F420 (Cheeseman et al, 1972). CoM có phân tử hóa học là HSCH2CH2SO3, cấu trúc phân tử và tổng hợp hóa học của CoM được nghiên cứu bởi Taylor và Wolfe (1974). Hình 1. Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO2 (*Nguồn: Gunsalus et al, 1978) Hợp chất huỳnh quang (Fluorescent compound), F420, hiện diện trong hầu hết các nghiên cứu về loài vi khuẩn này. Cấu trúc của F420 hiện tại vẫn chưa được tìm ra.Hợp chất này có đỉnh hấp thụ cao nhất tại bước sóng 420 nm ở trạng thái oxi hóa. Hình 2. Vai trò của F420 (*Nguồn: Tzeng et al, 1975) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Sự tổng hợp metan: Vi khuẩn sinh metan sử dụng hydro- carbon dioxide, formate, methanol, acetate, cơ chế chính xác cho mỗi cơ chất trên là tùy thuộc vào mỗi loài. Mô hình chuyển hóa được miêu tả như sau. Hình 3. Quá trình tổng hợp metan (*Nguồn: Barker, 1956) 2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí Đặc điểm nước thải có thể xử lý bằng hồ kỵ khí là hàm lượng chất hữu cơ cao như protein, chất béo, carbohydrate …. Các hệ thống yếm khí ứng dụng khả năng phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật trong điều kiện không có oxy. Quá trình phân hủy yếm khí chất hữu cơ rất phức tạp liên hệ đến hàng trăm phản ứng và sản phẩm trung gian. Tuy nhiên người ta thường đơn giản hóa chúng bằng phương trình sau đây: Chất hữu cơ lên men yếm khí Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 1 Thành phần khí biogas (*Nguồn: Thành phần Phần trăm Methane (CH4) 55¸65% Carbon dioxide (CO2) 35¸45% Nitrogen (N2) 0¸3% Hydrogen (H2) 0¸1% Hydrogen Sulphide (H2S) 0¸1% http://www.duongnhat.com.vn/tin-tuc/tin-moi-truong/253-cong-nghe- aao.htmlhttp ://www.duongnhat.com.vn/, ngày 6/8/2013) Methane có nhiệt trị cao (gần 9.000 kcal/m3). Do đó, nhiệt trị của Biogas khoảng 4.500 - 6.000 kcal/m3, tùy thuộc vào phần trăm của methane hiện diện trong Biogas. 1. Phân hủy các chất hữu cơ cao phân tử 2. Tạo nên các acid 3.Tạo metan Hình 4. Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành 3 giai đoạn chính (*Nguồn: McCathy và Donchin, 1981) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT 2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế Theo các nghiên cứu của Bộ Công Thương – Vụ Khoa Học Công nghệ (2009) thì các nhóm vi sinh, hầu hết là vi khuẩn, đều tham gia vào việc chuyển hoá các hợp chất hữu cơ cao phân tử phức hợp thành khí metan. Thêm vào đó là sự tương tác đồng bộ giữa các nhóm vi khuẩn liên quan đến quá trình phân hủy yếm khí các chất thải. Mặc dù có thể có sự hiện diện của một số nấm và nguyên sinh động vật, nhưng rõ ràng vi khuẩn luôn vượt trội về số lượng. Có bốn nhóm vi khuẩn liên quan đến việc chuyển hóa các chất phức hợp thành những phân tử đơn giản như metan và dioxit carbon. Những nhóm vi khuẩn này hoạt động trong một mối quan hệ đồng bộ, nhóm này phải thực hiện việc trao đổi chất của nó trước khi chuyển phần việc còn lại cho nhóm khác. - Nhóm 1: Vi khuẩn thủy phân: Các nhóm vi khuẩn yếm khí cắt vỡ các hợp chất hữu cơ phức hợp (cellulose) thành các đơn phân tử dễ hoà tan. Các đơn phân tử này sẵn sàng làm thức ăn cho nhóm vi khuẩn kế tiếp. Sự thủy phân các phân tử phức hợp được sự xúc tác của enzym cellulases. - Nhóm 2: Vi khuẩn tạo axít gây lên men: Nhóm vi khuẩn tạo acid (Acidogenic) chuyển đường thành những axít hữu cơ, rượu và các ketone (như ethanol, methanol, glycerol, acetone), acetate, CO2, và H2. Acetate là sản phẩm chính của quá trình lên men carbon hydrate. - Nhóm 3: Vi khuẩn tạo Aceton: Vi khuẩn tạo aceton chuyển các acid béo (như: acid propionic và butyric) và rượu thành acetate, hydro, and CO2, những chất này sẽ được sử dụng bởi nhóm vi khuẩn tạo metan. Nhóm này đòi hỏi nồng độ hydro thấp để chuyển hoá các axít béo và do đó cần phải theo dõi sát nồng độ hydro. Dưới điều kiện nồng độ hydro cục bộ cao, sự tạo thành acetate giảm và chất nền sẽ chuyển thành acid propionic, butyric và ethanol thay vì metan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 - Trường ĐHCT Nhóm 4: Vi khuẩn tạo khí metan: Trong tự nhiên vi khuẩn tạo mêtan khó tính này thường có ở các lớp bùn trầm tích hoặc trong dạ dày của các loài ăn cỏ. Nhóm này được tạo thành bởi các vi khuẩn gram âm và gram dương với các hình dạng khác nhau. Các vi sinh tạo mêtan sinh trưởng chậm trong nước thải, chu kỳ sinh có thể từ 2 ngày ở 350C cho đến 50 ngày ở 100C. Khoảng 2/3 mêtan được tạo ra từ sự chuyển hoá acetate của nhóm vi khuẩn này. 1/3 còn lại là do sự giảm CO2 tạo ra bởi hydro. 2.4 Các nghiên cứu liên quan Rất nhiều thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sinh metan đã và đang được thực hiện, với nguồn chủ yếu là từ dạ cỏ của động vật nhai lại hoặc trong hệ tiêu hóa của động vật nói chung. Hungate và Bryant là những người đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu về loài vi khuẩn này với các nghiên cứu về môi trường và hệ thống nuôi cấy. Hungate (1969) đưa ra phương pháp sửu dụng ống “hungate” – một ống roll tube có nắp cao su và nắp nhựa chuyên biệt để nuôi cấy kỵ khí vi khuẩn sinh methan. Bryant thành công trong việc xác lập môi trường nuôi cấy chuyên biệt mà sau này tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu về metahnogens đều dựa vào. Cheeseman (1972), Edward và McBride (1975) đưa ra phương pháp sử dụng kính huỳnh quang để nhận biết vi khuẩn sinh metan, trong đó sự phát hiện ra hợp chất huỳnh quang F420 đã giúp đỡ các nhà khoa học dễ dàng nhận biết loài vi sinh vật cổ này một cách nhanh chóng. Sau đó bằng cách đưa ra cấu tạo phân tử và sơ bộ hóa hoạt động của phân tử này Ferry, Smith và Wolfe (1974) đã củng cố thêm các thông tin khoa học xung quanh hợp chất này. Các đặc điểm về hình thái, tính chất, sinh lý của dòng vi khuẩn này đã được Zeikus (1977) nghiên cứu và phát hành. Skillman et al (2006) nhận thấy với những cặp mồi 16S khác nhau sẽ cho kết quả đa dạng sinh học khác nhau của một cộng đồng methanogens, vì thế việc lựa chọn cặp mồi phù hợp nên luôn được quan tâm. Cùng nhiều nghiên cứu có liên quan. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 – 12/2013. 3.1.2 Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Công nghệ Enzyme, phòng Sinh học Phân tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.3 Nguyên liệu Mẫu nước thải thu từ nhà máy TNHH Chế Biến và Thương mại Bao Bì Tân Hưng đường Cái Sơn Hàng Bàng , Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ. Thu và xử lý mẫu - Nguyên tắc: thu mẫu ở độ sâu 2m trong điều kiện kị khí bắt buộc. Sử dụng hệ thống ống thu có valve một chiều, dọc thân ống có phần cao su trong, mềm. - Tiến hành: Làm sạch ống thu bằng alcohol và tiệt trùng bằng dung dịch iodine. Lấy mẫu ở một độ sâu 2m. Sử dụng ống tiêm và kim tiêm. Làm đầy ống tiêm với hỗn hợp khí H2 và CO2. Giữ ống đứng thẳng, trút xuống để giữ khí hidro không bị thoát ra. Đẩy hết khí ra ngoài, hút mẫu, cho mẫu vào chai đã đóng nắp và được làm đầy bằng khí H2 và CO2, giữ mẫu tránh ánh sáng. Trữ mẫu ở 4oC. 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất - Dụng cụ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -