Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan từ phân trùn quế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN VÔ CƠ KHÓ TAN TỪ PHÂN TRÙN QUẾ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN THÚY HẰNG MSSV: 3113713 LỚP: VSV K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN VÔ CƠ KHÓ TAN TỪ PHÂN TRÙN QUẾ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN THÚY HẰNG MSSV: 3113713 LỚP: VSV K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) TS. Bùi Thị Minh Diệu Trần Thúy Hằng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện nghiên Cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngành Vi Sinh Vật Học. Tôi xin chân thành cám ơn: TS. Bùi Thị Minh Diệu đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn. Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu tại Viện. Quý thầy cô và cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học Phân Tử Thực Vật, Sinh Hóa đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành nghiên cứu. Gia đình, tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian học tập và nghiên cứu. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải lân từ phân của Trùn Quế. Từ các mẫu phân Trùn Quế thu tại các cơ sở nuôi Trùn Quế ở Sóc Trăng và Cần Thơ đã phân lập được tổng cộng 36 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan trên môi trường NBRIP. Phần lớn các khuẩn lạc có dạng hình tròn, có màu vàng hay cam. Tất cả các dòng vi khuẩn này đều dạng hình cầu, gram âm và có chuyển động. Trên môi trường NBRIP có chứa lân vô cơ khó tan, tất cả 36 dòng xác định là có khả năng phân giải lân dựa trên chỉ số PSI trong đó dòng PB2 có chỉ số PSI cao nhất (PSI = 3.167). Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của 14 dòng sơ tuyển bằng phương pháp so màu đã tuyển chọn được hai 2 dòng có khả năng phân giải lân tốt nhất là PV5 (255.30 mg/L) và (PB7 (241.32 mg/L). Khảo sát sự phát triển của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn trên các điều kiện nhiệt độ, pH và tốc độ lắc khác nhau cho thấy chúng thích nghi tốt ở nhiệt độ 320C, pH = 6.8 ở cả hai dòng, PB7 phát triển tốt ở tốc độ lắc là 150 vòng/ phút và PV5 phát triển tốt ở 75 vòng/ phút. Từ khoá: Phân giải lân, phương pháp Bergey, vi khuẩn phân giải lân. Chuyên ngành Vi Sinh Vật học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ...................................................................................................... CẢM TẠ ........................................................................................................................... TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................ vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 2 1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Sơ lược về trùn quế ................................................................................................. 3 2.1.1. Giới thiệu ....................................................................................................... 3 2.1.2. Đặc tính sinh học ........................................................................................... 4 2.1.3. Đặc tính sinh lý ............................................................................................. 4 2.1.4. Sự sinh sản và phát triển ............................................................................... 5 2.1.5. Hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của trùn quế................................................ 5 2.1.6. Đặc điểm và tác dụng của phân trùn quế ...................................................... 6 2.2. Đại cương về lân ..................................................................................................... 9 2.2.1. Các dạng lân trong đất................................................................................... 9 2.2.2. Cơ chế chuyển hóa lân nhờ vi sinh vật ....................................................... 13 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân ...................................... 14 2.3. Một số nhóm vi khuẩn phân giải lân .................................................................. 15 Chuyên ngành Vi Sinh Vật học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 2.3.1. Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................ 15 2.3.2. Vi khuẩn Acinetobacter ............................................................................... 16 2.3.3. Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................... 17 2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam ........................................ 18 2.4.1. Trên thế giới ................................................................................................ 18 2.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 19 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21 3.1. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 21 3.1.1. Dụng cụ, thiết bị .......................................................................................... 21 3.1.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 21 3.1.3. Hóa chất, môi trường.................................................................................. 21 3.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22 3.2.1. Thu mẫu....................................................................................................... 23 3.2.2. Phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan ........................................... 23 3.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn có tiềm năng phân giải lân vô cơ khó tan ................. 23 3.2.4. Tuyển chọn và nhận diện sơ bộ các dòng vi khuẩn phân giải lân mạnh. .... 26 3.2.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của ít nhất một dòng tiêu biểu ......................................................................... 29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31 4.1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn phân giải lân khó tan ............................. 31 4.1.1. Nguồn gốc và kết quả phân lập các dòng vi khuẩn ..................................... 31 4.1.2. Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được ............................................... 32 4.2. Khả năng phân giải lân khó tan của các dòng vi khuẩn dựa trên chỉ số PSI ................................................................................................................................. 36 4.3. Khảo sát khả năng phân giải lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập.. 38 4.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của các dòng vi khuẩn tiêu biểu ................................................................................. 43 Chuyên ngành Vi Sinh Vật học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 43 4.4.2 Ảnh hưởng của pH. ................................................................................... 44 4.4.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc.......................................................................... 45 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 47 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 47 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 48 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... Phụ lục 1: Các hình ảnh.......................................................................................... Phụ lục 2: Kết quả ................................................................................................... 1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt đo chỉ số PSI ........................................................... 2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của vi khuẩn bằng phương pháp so màu.......................................................................................................... 3. Kết quả thí nghiệm khảo sát một số yếu tố đến 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn ............................................................................................................. Phụ lục 3: Kết quả thống kê ................................................................................... 4. Kết quả thống kê thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải lân của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt đo chỉ số PSI ........................... 5. Kết quả thống kê thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải lân của 14 dòng sơ tuyển .............................................................................................. 6. Số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn ................................... Chuyên ngành Vi Sinh Vật học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1 – Thành phần các loại phân chuồng .................................................................... 7 Bảng 2 – Thành phần phân trùn nguyên chất .................................................................. 8 Bảng 3 – Thành phần môi trường NBRIP .................................................................... 22 Bảng 4 – Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 ........................................................ 27 Bảng 5 – Nguồn gốc phân lập các dòng vi khuẩn ......................................................... 31 Bảng 6 – Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập ........................................... 32 Bảng 7 – Đặc điểm hình thái tế bào và nhuộm Gram vi khuẩn .................................... 35 Bảng 8 – Chỉ số PSI của các dòng vi khuẩn sau 2 và 7 ngày nhỏ giọt.......................... 37 Bảng 9 – Khả năng phân giải lân khó tan của 14 dòng vi khuẩn sơ tuyển qua các ngày khảo sát .......................................................................................................................... 39 Bảng 10 – Các đặc tính sinh hóa của 2 dòng vi khuẩn PB7 và PV5 ............................. 41 Bảng 11 – Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn...................................................................................................................... 43 Bảng 12 – Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn ............................................................................................................................... 44 Bảng 13 – Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn...................................................................................................................... 46 Chuyên ngành Vi Sinh Vật học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1 – Trùn quế ............................................................................................................ 3 Hình 2 – Vòng tuần hoàn phospho trong tự nhiên ........................................................ 11 Hình 3 – Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................... 15 Hình 4 – Vi khuẩn Acinetobacter .................................................................................. 16 Hình 5 – Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................. 17 Hình 6 – Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường NBRIP ...... 34 Hình 7 – Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần ................................................................................................... 36 Hình 8 – Sự tạo thành vòng sáng halo quanh khuẩn lạc sau 7 ngày nhỏ giọt ............... 36 Hình 9 – Đường chuẩn P2O5 có giá trị dao động từ 0 đến 25 mg/L .............................. 39 Hình 10 – Hàm lượng lân trung bình qua các ngày khảo sát của 14 dòng vi khuẩn sơ tuyển .............................................................................................................................. 40 Hình 11 – Hình nhuộm Gram của dòng vi khuẩn PV5 và PB7 khi xem dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần........................................................................... 42 Hình 12 – Kết quả thử nghiệm catalase......................................................................... 42 Hình 13 –Kết quả thử nghiệm oxidase .......................................................................... 42 Hình 14 – Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn ........................................................................................................... 44 Hình 15 – Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn...................................................................................................................... 45 Hình 16 – Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn ........................................................................................................... 46 Chuyên ngành Vi Sinh Vật học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT OD Optical Density NBRIP National Botanical Research Institute’s phosphate PSI Phosphate Solubilizing Bacteria Chuyên ngành Vi Sinh Vật học vii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, sự phát triển không ngừng của nông nghiệp đã tạo sức ép cho nông dân về vấn đề năng suất cây trồng, ngày càng có nhiều nông hộ sử dụng phân hóa học không kiểm soát làm cho lượng phân hóa học dư thừa trong đất ngày càng nhiều. Lân là phân tử cơ bản rất cần thiết cho sự sống và đặc biệt đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng. Vì vậy, phân bón có chứa lân đặc biệt là phân hóa học có chứa lượng lớn lân hòa tan được áp dụng tối đa trong nông nghiệp để tối đa hóa sản xuất (Del Campillo et al.,1999; Shenoy and Kalagudi, 2005). Tuy nhiên, lân hòa tan trong phân bón lân thường dễ dàng và nhanh chóng kết tủa với các chất khoáng không hòa tan là các cation như Ca2+, Fe3+, Al3+, Co2+ hoặc Zn2+ hoặc hấp thụ với canxi carbonat, oxit nhôm, oxit sắt và nhôm silicat (Del Campillo et al., 1999; Wakelin et al., 2004). Cây trồng không thể hấp thu được nguồn lân khó tan này vì thế nó đã giảm hiệu quả phân bón cũng như trực tiếp hay gián tiếp làm ô nhiễm môi trường, giảm độ tơi xốp của đất, giết chết loài vi sinh vật có lợi trong đất làm mất cân bằng sinh thái. Ngoài ra, tốc độ đô thị hóa cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp như chế biến lương thực thực phẩm, sản xuất các sản phẩm sinh học, các ngành chăn nuôi….tạo ra số lượng lớn chất thải rắn và nước thải chứa nhiều polysaccharide, các hợp chất vô cơ, nitơ, phospho gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Do đó, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn phân giải lân khó tan là một trong những vấn đề được quan tâm và nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay nhằm nâng cao năng suất cây trồng cũng như giảm thiểu vấn đề ô nhiễm môi trường. Hiện nay, biện pháp sinh học là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phân giải lân khó tan thành lân dễ tan, chi phí đầu tư thấp, không có những tác dụng không mong muốn cho môi trường góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Một số nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn trong hệ tiêu hóa của trùn Quế gồm có các chi Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum , Acinetobacter, Klebsiella, Azotobacter.. cũng có khả năng phân giải lân, kích thích tăng trưởng cây trồng (Shinha et al., 2009) và tận dụng được lân không hòa tan trong các loại phân bón và đất (Rodríguez and Fraga, 1999). Vì thế đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan từ phân của trùn quế” được thực hiện. Chuyên ngành Vi sinh Vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập, đánh giá để tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan hiệu quả từ phân trùn quế hướng tới ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh. 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan từ phân trùn quế. Đánh giá để tuyển chọn ít nhất một dòng có hoạt tính phân giải lân mạnh từ các dòng phân lập được. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của hai dòng vi khuẩn tiêu biểu nhằm xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các dòng vi khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh Vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về trùn quế 2.1.1 Giới thiệu Phân loại khoa học Ngành: Giun đốt (Annelida) Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata) Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta) Họ: : Megascolecidae Tên khoa học: Perionyx excavatus Hình 1 - Trùn quế (Nguồn: http://www.vietlinh.vn/library/agriculture_livestock/trunque.asp) Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với quần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất. Trùn Quế là một trong những giống trùn đã được thuần hoá, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch. Chúng được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển hóa chất thải ở Philippines, Australia và một số nước khác (Gurrero, 1983; Edwards, 1995). Chuyên ngành Vi sinh Vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT 2.1.2 Đặc tính sinh học Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 cm, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ. Khi di chuyển, các đốt co duỗi kết hợp các lông tơ phía bên dưới các đốt bám vào cơ chất đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu O2 và thải CO2 trong môi trường nước. Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng Amoniac và Ure. Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất nhiều chất dinh dưỡng, những vi sinh vật cộng sinh này cùng với phân ra khỏi hệ thống tiêu hóa, nhưng chúng vẫn hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài. Đây được cho là nguyên nhân chính làm cho lượng phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn các lọaị phân hữu cơ thông thường khác. 2.1.3 Đặc tính sinh lý Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ, biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Chúng có thể sống ở phổ pH khá rộng từ 4 – 9, tuy nhiên trùn quế sống và sinh sản tốt nhất ở pH 7 – 7,5. Nhiệt độ thích hợp nhất cho trùn phát triển là từ 20oC - 30oC. Độ ẩm luống nuôi thích hợp cho trùn quế phát triển từ 70 - 80% . Ở 30oC và độ ẩm thích hợp chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ngược lại ở nhiệt độ quá thấp chúng sẽ ngừng hoạt động hoặc có thể chết. Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm,…) Tuy nhiên những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn vì giàu chất dinh dưỡng, giúp chúng sinh sản và phát triển. Chúng sẽ ngửi được và tự tìm đến Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, nơi có nhiều chất hữu cơ thối rửa và phân hủy như trong đống phân đang phân hủy hay rác đang hoai mục. Chúng rất ít hiện diện trong đồng ruộng canh tác dù ở những nơi này có nhiều chất thải Chuyên ngành Vi sinh Vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT hữu cơ. Có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo được điều kiện ánh sáng, ẩm độ thường xuyên. 2.1.4 Sự sinh sản và phát triển Trùn quế là sinh vật lưỡng tính - chúng có cả cơ quan sinh dục đực lẫn sinh dục cái, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu của cơ thể. Mặc dù vậy, chúng không thể tự sinh sản được mà phải tìm một con khác để trao đổi tinh trùng, giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng, kén trùn di chuyển dần về phía đầu. Kén áo hình dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sang xanh nhạt rồi vàng nhạt. Mỗi kén có thể nở từ 1 – 10 con. Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3mm, sau 5 – 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 –30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục (Arellano, 1997) ; từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản. Con trưởng thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể. Trùn Quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao. Cứ một tuần đẻ một lần, sau 3 tuần trứng nở, sau 3 tháng giun trưởng thành. Theo nhiều tài liệu, từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 –1.500 cá thể trong một năm. 2.1.5 Hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa cùa trùn quế. Trùn quế mang nhiều vi khuẩn trên da, trong chất nhầy ở trong ruột và đặc biệt là trong phân trùn. Ruột trùn quế chứa hàng triệu vi khuẩn có lợi, chúng sống cộng sinh trong ruột góp phần vào quá trình phân hủy vật chất hữu cơ khoáng hóa N và P cung cấp chất vi lượng cần thiết cho cây trồng thông qua sản phẩm bài tiết của chúng (Buchanan et al., 1988). Sự đa dạng của vi sinh vật phụ thuộc vào điều kiện sinh học và các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, độ pH và chất hữu cơ là một phần của chế độ ăn uống của chúng. Theo các nghiên cứu cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong đường tiêu hóa của trùn gắn liền với bốn nhóm vi khuẩn sau: kích thích tăng trưởng thực vật, cố định nitơ sống tự do, chất diệt sinh vật và phân giải lân chủ yếu gồm có các chi Bacillus, Pseudomonas, Chuyên ngành Vi sinh Vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT Acinetobacter, Azospirillum, Klebsiella, Azotobacter, Serratia, Aeromonas và Enterobacter. Ngoài các nhóm vi khuẩn sẵn có trong hệ tiêu hóa của trùn thì khi trùn nuốt thức ăn vào miệng có một lượng đất cũng như vi sinh vật có lợi trong đất sẽ theo thức ăn vào trong hệ tiêu hóa của trùn và dưới điều kiện thuận lợi có nhiều chất hữu cơ thì hệ vi sinh vật đất này sẽ sinh sôi gấp 10 lần và thực hiện quá trình phân hủy thức ăn và góp phần vào việc phân giải hợp chất hữu cơ cũng như khoáng hóa N, P một cách nhanh chóng. Kết quả của quá trình này cung cấp các chất dinh dưỡng cho cả trùn quế và vi khuẩn. Sau quá trình tiêu hóa ở ruột, số lượng lớn các vi khuẩn được phóng thích trở lại vào thùng nuôi trùn Quế cùng với phân trùn. Phân trùn Quế được các vi khuẩn chuyển hóa dưới dạng các nguyên tố và hợp chất đơn giản, vì vậy đây chính là loại phân hữu cơ vô cùng cần thiết cho cây trồng sử dụng. Không những thế các vi khuẩn này lại tiếp tục phát triển trong đất và một lần nữa góp phần vào việc phân giải các hợp chất lân lân khó tan trong đất, cố định đạm cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng (Mitchel and Edward, 1997). Hệ tiêu hóa trùn quế tập trung nhiều các thành phần hữu cơ, khoáng chất và các vi khuẩn có lợi vì vậy phân của chúng luôn có các chất giàu dinh dưỡng. Nhiều nghiên cứu cho thấy phân trùn quế cho lượng phosphate nhiều gấp 4 lần bề mặt đất nhờ trùn quế có chứa hệ vi sinh vật phân giải lân khó tan thành dạng dễ tan cho cây hấp thu (Rebeca Lines-Kelly, 2004). 2.1.6. Đặc điểm và tác dụng của phân trùn quế Đặc điểm phân trùn Phân trùn được xem như là quá trinh sinh học tạo ra sản phẩm là vermicompost không ảnh hưởng xấu đến môi trường (Suthar and Singh, 2008). Các vật liệu đưa qua hệ thống tiêu hóa của trùn quế với nhiều vi sinh vật cộng sinh sẽ thực hiện quá trình chuyển đổi và kết thúc, tạo ra sinh khối phân trùn giàu chất dinh dưỡng như thiamin (12,9mg/kg), niacin (567mg/kg), biotin (1,53mg/kg) ngoài ra còn có những vi sinh vật cộng sinh có lợi trong hệ tiêu hóa của trùn như vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân, cellulose, sinh IAA cũng theo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạt động ở màng dinh dưỡng trong một thời gian daì. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng mà có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường trong tự nhiên (Nguyễn Văn Bảy, 2004). Chuyên ngành Vi sinh Vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT Thành phần phân trùn: Phân trùn là loài hữu cơ giàu NPK (nitơ 2-3%. kali 1,852,25% và phospho 1,55-2,25%), ngoài ra còn một số phân đa lượng khác (Atiyeh et,al., 2000). Phân trùn còn chứa các enzyme như amylase, lipase, cellulase, phosphatase và các acid amin mà các phân hữu cơ khác không có. Khi được thải ra môi trường ngoài chúng chứa các chất dinh dưỡng, các vi khuẩn có lợi như vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân chúng tiếp tục phá vỡ các thành phần khó hấp thu trong đất để giải phóng chất dinh dưỡng và làm cho nó có sẵn cho các rễ cây dễ hấp thu, kích thích tố tăng trưởng thực vật (Edwards, 2004). Phân trùn chứa đựng một hỗn hợp vi sinh có hoạt tính cao của trùn quế cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng như đạm, lân, kali, canxi, magic và có khả năng cải tạo đất rất tốt. Sự hữu dụng nhất là các chất này có thể được cây hấp thu ngay không như những phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây trồng hấp thu (Nakamura, 1996). Các nghiên cứu của Agawal cũng cho thấy rằng hàm lượng dinh dưỡng N,P, K trong phân trùn tăng 3- 4 lần so với phân thông thường không được xử lý bằng trùn quế. Bảng 1 - Thành phần của các loại phân chuồng Thành phần H2O N P2O5 K2O CaO MgO Heo 82,0 0,80 0,41 0,26 0,09 0,10 Trâu bò 83,1 0,29 0,17 1,00 0,35 0,13 Ngựa 75,7 0,44 0,35 0,35 0,15 0,12 Gà 56,0 1,63 0,54 0,85 2,4 0,74 Vịt 56,0 1,00 1,40 0,62 1,70 0,35 Loại phân (*Nguồn Đường Hồng Dật, 2002) Chuyên ngành Vi sinh Vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT Bảng 2 - Thành phần phân trùn nguyên chất Thành phần Hàm lượng N 1,5- 2,2% P2O5 1,8- 2,2% K 2O 1,0- 1,5% CaO 4,6- 4,8% MgO 0,3% C 13,1-17,3 Vật chất hữu cơ 65-70% C/N 10-11 ( *Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003) Qua bảng 1 và bảng 2 ta thấy rõ hàm lượng N, P, K trong phân trùn nguyên chất cao hơn so với phân chuồng thông thường trong đó đặc biệt hàm lượng lân dễ tan trong phân trùn rất cao điều này cho thấy có thể một lượng lân khó tan có trong khẩu phần ăn của trùn đã được phân giải sau khi qua hệ thống tiêu hóa cùng với hệ vi khuẩn có lợi. Tác dụng phân trùn quế Phân trùn quế là loại phân hữu cơ sinh học có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại cây trồng, không gây ra tình trạng “sốc” phân, yêu cầu trữ dễ dàng, đặc biệt thích hợp cho các loại hoa kiểng, vườn ươm và là nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau sạch..Ngoài ra, còn là loại phân bón thiên nhiên giàu dinh dưỡng có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng. Không giống như phân chuồng, phân trùn được hấp thu ngay một cách dễ dàng bởi cây trồng. Không chỉ kích thích tăng trưởng cây trồng mà phân trùn còn tăng khả năng duy trì giữ nước trong đất và thậm chí còn có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ... Phân trùn quế chứa một sinh vật có hoạt tính cao như vi khuẩn, nấm mốc, đặc biệt là hệ vi khuẩn cố định đạm tự do (Azotobacter), vi khuẩn phân giải lân, phân giải celluose và chất xúc tác sinh học. Vì thế hoạt động của các vi sinh vật lại tiếp tục phát triển trong đất. Phân trùn quế giàu những chất dinh dưỡng hòa tan trong nước và chứa đựng hơn 50% chất mùn được tìm thấy trong lớp đất mặt. Không như phân động vật, phân trùn được cây trồng sử dụng ngay. Phân trùn cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển cây trồng như đạm, lân, kali, canxi, magic. Nó cũng chứa mangan, đồng, kẽm, Chuyên ngành Vi sinh Vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường ĐHCT coban, borat, sắt. Sự hữu dụng của các chất này được cây hấp thụ ngay không như những phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi hấp thụ. Sẽ không có bất cứ rủi ro hay cháy cây nào xảy ra trong khi sử dụng phân trùn quế. Chất mùn trong phân loại trừ được những độc tố, nấm hại và vi khuẩn có hại trong đất nên nó có thể đẩy lùi những bệnh của cây trồng. Do vậy, phân trùn hạn chế khả năng gây hại cho cây trồng. Mặt khác phân trùn còn có khả năng cố định các kim loại nặng trong chất thải hữu cơ. Điều này ngăn ngừa cây trồng hấp thu nhiều phức hợp khoáng hôn nhu cầu của chúng. Phân trùn quế có pH=7 nên nó hoạt động như một rào cản, giúp cây phát triển trong đất ở độ pH quá cao hay quá thấp. Acid Humid trong phân trùn quế, kích thích sự phát triển của cây trồng, thậm chí ngay cả nồng độ thấp. Trong phân trùn, Acid Humid ở trạng thái mà cây trồng có thể hấp thu dễ dàng nhất. Acid Humid cũng kích thích sự phát triển của vi khuẩn trong đất. Phân trùn tăng khả năng giữ nước của đất vì phân trùn có dạng hình khối, nó là những cụm khoáng chất kết hợp theo cách mà chúng có thể để chống sự xói mòn và sự va chạm cũng như khả năng giứ nước, góp phần làm cho đất tơi xốp và giữ ẩm được lâu. Phân trùn quế làm giảm hàm lượng dạng Acid carbon trong đất và gia tăng nồng độ nitơ trong một trạng thái cây trồng có thể hấp thụ được. Phân trùn cũng chứa IAA (Indol Acetic Acid) có trong phân trùn quế là một trong những chất kích thích hữu hiệu giúp cây trồng phát triển tốt. 2.2 Đại cương về lân 2.2.1 Các dạng lân trong đất. Lân là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng ( N, P, K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất cả các loài sinh vật đặc biệt là thực vật. Lân là thành phần xây dựng nên các hợp chất quan trọng bậc nhất của tế bào như: Phosphoprotein, phospholipit, phosphoeste, trong các vitamin (B1, B6). Đặc biệt phospho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, GTP, FAD, NADP, coA,..đây là những phân tử trao đổi năng lượng, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật ( Hoàng Thị Hà, 1998). Lân rất quan trọng với cây trồng nhưng hiệu suất sử dụng của cây không quá 25% do chúng tích trữ trong đất và tồn tại ở dạng khó tan. Nhiều loại đất có lượng lân tồn trữ rất cao, bình quân tổng số chiếm khoảng 0.05% thành phần đất, tuy nhiên trong đó chỉ Chuyên ngành Vi sinh Vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học