Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ gia cầm ở tỉnh vĩnh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM Ở TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN VĂN CƯỜNG MSSV: 3102805 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM Ở TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN VĂN CƯỜNG MSSV: 3102805 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ts. Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Văn Cường DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 201 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp này. Xin gửi lời chân thành cảm ơn đến các Thầy cô, cán bộ của Viện và các anh chị cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Phòng thí nghiệm Hóa sinh Thực phẩm - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài. Xin cảm ơn ba mẹ, anh chị và tất cả các bạn lớp công nghệ sinh học khóa 36, cùng các em lớp công nghệ sinh học khóa 37 đã động viên, khuyến khích, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 20113 Nguyễn Văn Cường Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Keratin là thành phần cấu tạo chính của lông gia súc, gia cầm. Đây là hợp chất rất khó bị phân giải trong tự nhiên và được thải ra với khối lượng lớn từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm. Sự phân giải các chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết thực trong ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân giải keratin mạnh là rất cần thiết và để góp phần cải thiện môi trường bị ô nhiễm từ nguồn chất thải này. Từ tám mẫu đất, nước và lông thu tại các lò giết mổ gia cầm đã phân lập được 39 dòng vi khuẩn. Trong đó, 20/39 dòng có khuẩn lạc không đều, 19/39 dòng có khuẩn lạc tròn. Các khuẩn lạc các dòng vi khuẩn chủ yếu có màu trắng đục chiếm 58,97%, trắng trong chiếm 25,64%, màu vàng chiếm 12,82% và 2,56% màu hồng nhạt. Kết quả khảo sát cho thấy cả 39 dòng đều có khả năng phân giải lông gia súc, gia cầm và thể hiện hoạt tính keratinase từ 0,5 đến 16,67 U/ml. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng làm giảm khối lượng bột lông gia cầm trong môi trường lỏng từ 20,87 đến 67,23%; và 18,19 đến 26,90% khối lượng bột lông gia súc trong môi trường lỏng sau bảy ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC. Trong đó, hai dòng Kc10 và Kc32 được tuyển chọn đều mang đặc tính Gram âm và có hình dạng tế bào lần lượt là hình que và hình cầu. Từ khóa: Keratin, keratinase, lông gia súc, lông gia cầm, vi khuẩn phân giải Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................... CẢM TẠ......................................................................................................................... TÓM LƯỢC..................................................................................................................i MỤC LỤC....................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... v CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................... vi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 2 2.1. Tổng quan về keratin và chất thải lông gia cầm ................................................ 2 2.1.1. Keratin ................................................................................................................ 2 2.1.2. Chất thải lông gia cầm ......................................................................................... 2 2.2. Tổng quan về enzyme keratinase ....................................................................... 3 2.3. Vi sinh vật phân giải lông gia súc - gia cầm ....................................................... 4 2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin ........... 6 2.4.1. Một số nghiên cứu trong nước ............................................................................. 6 2.4.2. Một số nghiên cứu ngoài nước ............................................................................ 7 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 12 3.1. Phương tiện nghiên cứu ..................................................................................... 12 3.3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 12 3.1.2. Vật liệu ............................................................................................................. 12 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 12 3.1.4. Hóa chất ............................................................................................................ 12 3.1.5. Môi trường ........................................................................................................ 12 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 13 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2.1. Thu và xử lý mẫu .............................................................................................. 13 3.2.2. Phân lập các dòng vi khuẩn ............................................................................... 13 3.2.3. Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn ......................................... 13 3.2.4. Đánh giá khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ............... 16 3.2.5. Đánh giá khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn 17 3.2.6. Quan sát hình dạng của tế bào vi khuẩn ............................................................. 17 3.2.7. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn ............................................................................ 17 3.2.8. Xử lý số liệu ...................................................................................................... 18 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 19 4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn .................................. 19 4.2. Hoạt tính Keratinase của các dòng vi khuẩn.......................................................... 22 4.3. Khả năng phân giải bột lông gia cầm (lông gà, vịt) của các dòng vi khuẩn............ 24 4.4. Khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn ....................................... 26 4.5. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin cao ......................... 29 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 30 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 30 5.2. Đề nghị................................................................................................................. 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 31 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các hình ảnh thí nghiệm Hình 8. Một số thiết bị sử dụng thực hiện đề tài Hình 9. Lông gia cầm nguyên (a) và bột lông đã sây nhuyễn (b) Hình 10. Một số hình ảnh thí nghiệm Phụ lục 2. Số liệu thí nghiệm Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã được phân lập ............................................. 20 Bảng 2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập .................................. 21 Bảng 3. Mật số vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc ở 30 oC (chuẩn bị cho các thí nghiệm) ......... Bảng 4. Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn phân lập được ................................. Bảng 5. Khả năng phân giải bột lông gia cầm (lông gà, vịt) của các dòng vi khuẩn phân lập được .................................................................................................... Bảng 6. Khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn phân lập được ............................................................................................................ Bảng 7. Phân tích thống kê hoạt tính keratinase của 39 dòng vi khuẩn phân lập được trên cơ chất Azo-keratin .................................................................................... Bảng 8. Phân tích thống kê khả năng phân giải bột lông gà của 39 dòng vi khuẩn phân lập được ............................................................................................................ Bảng 9. Phân tích thống kê khả năng phân giải bột lông heo của 39 dòng vi khuẩn phân lập được .................................................................................................... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. α – keratin và β – keratin................................................................................... 2 Hình 2. Vi khuẩn Bacillus subtilis.................................................................................. 5 Hình 3. Vi khuẩn phân lập được phát triển trên môi trường bột lông gia cầm............... 19 Hình 4. Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn ..................................................... 23 Hình 5. Khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ........................... 25 Hình 6. Khả năng phân giải bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn .......... 26 Hình 7. Khả năng phân giải bột lông gia cầm và bột lông gia súc của các dòng vi khuẩn ............................................................................................................ 28 Hình 8. Hoạt tính keratinase và khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ............................................................................................................. 28 Hình 9. Vi khuẩn Gram âm phân lập được ................................................................... 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT B. Bacillus CFU Colony Forming Unit EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FMA Feather meal agar rpm Rotation per minute w/v Weight/volume Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1. 1.1. Đặt vấn đề Dân số thế giới ngày càng gia tăng, để đáp ứng nhu cầu về thực phẩm của con người, ngành chăn nuôi thế giới đã phát triển rất nhanh và đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, bên cạnh việc sản xuất và cung cấp một lượng lớn sản phẩm quan trọng cho nhu cầu của con người, ngành chăn nuôi cũng đã gây nên nhiều hiện tượng tiêu cực về môi trường. Một lượng lớn lông gia súc gia cầm hầu như được thải trực tiếp ra môi trường sau khi giết mổ. Đây là một loại chất thải có hơn 90% là protein, chủ yếu là keratin. Tuy nhiên, trong tự nhiên có một số vi sinh vật có khả năng phân giải lông gia súc gia cầm hiệu quả nhờ hoạt tính keratinase. Vì vậy, việc sử dụng các loài vi sinh vật này để chế biến chất thải lông gia cầm thành những sản phẩm có giá trị cao là một giải pháp ưu thế, có thể ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn để chế biến lông gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc đạt được ba ưu thế quan trọng là không gây hại cho môi trường, nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia cầm để chế biến nguồn chất thải này sẽ tạo ra những sản phẩm có giá trị cao, đồng thời góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý môi trường với giá thành thấp. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ một số lò giết mổ gia cầm ở tỉnh Vĩnh Long. Đánh giá khả năng phân giải lông gia súc gia cầm của các dòng vi khuẩn phân lập được để chọn ra dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh các chất thải chứa keratin. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 CHƯƠNG 2. Trường ĐHCT LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về keratin và chất thải lông gia cầm 2.1.1. Keratin Keratin là protein cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên biểu bì, tóc, móng, lông, sừng… Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được phân thành hai dạng α-helix (ở tóc) và β-sheets (ở lông vũ). Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và β-sheet xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Akhtar và Edwards, 1997). Keratin cũng được phân loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm lượng lưu huỳnh. Keratin cứng được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc, móng guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài. Trong khi đó, keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn (Voet và Voet, 1995). Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ liên kết hydro, tương tác kỵ nước và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền vững của keratin và kháng lại sự phân giải bởi các protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain. Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng phân giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade et al., 1998). Hình 1: α – keratin và β – keratin (Nguồn: Trân Tố và Cù Thị Thúy Nga, 2008) 2.1.2. Chất thải lông gia cầm Các chất thải giàu keratin khó phân giải và ngày càng tích lũy trong tự nhiên, chủ yếu ở dạng lông vũ và tóc, góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môi trường (Gupta và Ramnani, 2006). Tuy nhiên, sự phân giải các chất thải chứa keratin vẫn mang lại Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón. Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông gia cầm, trong đó chủ yếu là βkeratin. Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông gia cầm được thải ra từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm, gây ra vấn đề môi trường đồng thời làm lãng phí nguồn protein (Gousterova et al., 2005). Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh khiết đồng thời được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông gia cầm là nguồn nguyên liệu thay thế tiềm năng cho các thành phần dinh dưỡng đắt tiền trong thức ăn gia súc. Tuy nhiên, việc sản xuất lông gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế. Không những tiêu tốn nhiều năng lượng và không thân thiện với môi trường, quy trình sản xuất này phá hủy một số acid amin, làm cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997). 2.2. Tổng quan về enzyme keratinase Các enzyme phân giải protein là một trong những nhóm enzyme thương mại quan trọng được ứng dụng nhiều trong các quy trình công nghiệp, chế biến thực phẩm hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002). Keratinase thuộc họ protease có khả năng phân giải cơ chất keratin không tan. Keratinase chủ yếu là enzyme ngoại bào, được tạo ra khi có sự hiện diện của cơ chất keratin. Đến nay cơ chế phân giải sinh học keratin vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Theo Gupta và Ramnani (2006), cơ chế phân giải keratin liên quan đến hoạt động phối hợp của hệ thống phân giải protein (proteolytic) và phân giải sunfit (sulfitolytic). Sự phá hủy các cầu nối disulfide được xem là yếu tố quan trọng trong sự phân giải keratin (Böckle và Müller, 1997). Hầu hết các keratinase được mô tả đến nay đều thuộc loại serine protease và chỉ có một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính phân giải keratin. Các metalloprotease này thường được thấy ở các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007). Một số loài nấm và vi khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin cho thấy khả năng tổng hợp keratinase (Riffel và Brandelli, 2006). Keratinases sản xuất bởi Microsporum, Trychophyton và Microsporum Doratomyces đã được mô tả (Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000). Việc sản xuất keratinase từ chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus cũng đã được nghiên cứu (Santos et al., 1996). Keratinase từ vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong các quy Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT trình sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm. Keratin lông không hòa tan có thể được chuyển đổi sau khi bị phân giải bằng keratinase tạo thức ăn gia súc, phân bón, chất keo hay được sử dụng cho sản xuất của các axit amin hiếm như serine, cysteine, và proline (Onifade et al., 1998; Gupta and Ramnani, 2006). Trong tự nhiên, hoạt tính phân giải keratin khá phổ biến trong giới vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ một số keratinase đạt được mục đích sử dụng thương mại. Keratinase tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis đã được quan tâm nghiên cứu do hoạt tính phân giải lông gia cầm hiệu quả. Keratinase từ Bacillus licheniformis PWD1 là keratinase thương mại đầu tiên từ vi khuẩn được phát triển bởi Shih và cộng sự ở BRI (North Carolina) (Manczinger et al., 2003; Thys et al., 2004). 2.3. Vi sinh vật phân giải lông gia súc - gia cầm Một số loài nấm, actinomycetes, và vi khuẩn phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin cho thấy có khả năng tổng hợp keratinase và phân giải lông gia cầm (Riffel và Brandelli, 2006). Khả năng phân giải lông gia cầm nhờ enzyme keratinase từ một số chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus đã được nghiên cứu (Santos et al., 1996). Các dòng vi khuẩn chủ yếu thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả năng phân giải lông gia cầm cũng đã được phân lập từ mẫu đất và lông gia cầm ở các cơ sở chế biến gia cầm (Onifade et al., 1998). Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia cầm đã được phân lập từ mẫu đất và lông gia cầm ở các cơ sở chế biến gia cầm. Các dòng vi khuẩn này chủ yếu thuộc chi Bacillus và Streptomyces (Onifade et al., 1998). Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự phân giải vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào. Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc chi Bacillus rất đa dạng; khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám. Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được mô tả có khả năng phân giải keratin tốt (Balaji et al., 2008; Manczinger et al., 2003). Gen kerA của Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al., 1995). Ngoài Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT ra, các chủng như Bacillus pumilus và Bacillus cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al., 2008; Kumar et al., 2008). Một số dòng Streptomyces chịu nhiệt (thermophylic) được phân lập từ đất có thể phát triển và phân giải keratin ở nhiệt độ trên 50 oC (Mohamedin, 1999). Ngoài ra, một số dòng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) cũng được mô tả cho thấy khả năng phân giải keratin như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999). Khả năng phân giải keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó, Streptomyces pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông gia cầm (Böckle và Müller, 1997) cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để phục vụ sự phân giải keratin. Mặc dù các dòng vi khuẩn phân giải lông gia cầm được phân lập chủ yếu thuộc chi Strepomyces và Bacillus, kết quả của một số nghiên cứu cho thấy các dòng vi khuẩn này đa dạng hơn. Trong số các vi khuẩn Gram dương, một số dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được nhận diện là Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Hình 2: Vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguồn: http://en.citizendium.org/wiki/File:Bacillus_subtilis_Gram.jpg, ngày 09/07/2013) Hoạt tính keratinase còn được biểu hiện ở một số loài vi khuẩn chịu nhiệt như Fervidobacterium pennavorans Chuyên ngành Công nghệ Sinh học (Friedrich 5 và Antranikian, 1996), Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001) và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004). Những dòng vi khuẩn chịu nhiệt hứa hẹn khả năng phân giải các protein không tan trong nước như keratin vì những protein này dễ phân giải hơn ở nhiệt độ cao (Suzuki et al., 2006). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tổng hợp keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005). Các vi khuẩn Gram âm cũng được báo cáo cho thấy có khả năng phân giải protein nhưng tài liệu còn khá hạn chế và hoạt động phân giải lông gia cầm được mô tả chủ yếu ở các loài Chryseobacterium sp. (Riffel và Brandelli, 2002), Vibrio sp. (Sangali và Brandelli, 2000) và Xanthomonas maltophilia (De Toni et al., 2002). Các loài vi khuẩn thuộc chi Chryseobacterium là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, phân bố rộng trong tự nhiên chủ yếu trong môi trường đất và nước. Đây là những vi khuẩn hình que, không di động và tạo ra khuẩn lạc với sắc tố vàng đến cam đặc trưng (Calderón et al., 2011). 2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn phân giải keratin 2.4.1. Một số nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân lập từ đất và lông tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông gia cầm. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất bảy chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có hoạt tính phân giải casein rõ rệt. Trong đó năm chủng xạ khuẩn và hai chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh mẽ. Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam. Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này phát triển là ở 30oC đến 40oC trên môi trường có bổ sung bột lông vũ và khả năng phân giải lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn đã được phân loại định danh bằng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API 50CHB, API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA. Kết quả định danh của bốn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT vũ mạnh nhất cho thấy các dòng này lần lượt tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus megaterium và Chryseobacterium spp. Bùi Thị Minh Diệu et al. (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả đánh giá khả năng phân giải lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối lượng bột lông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37oC. Ngoài ra các dòng vi khuẩn có khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày lắc ủ. Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà hiệu quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%. 2.4.2. Một số nghiên cứu ngoài nước Có rất nhiều dòng vi khuẩn phân giải lông gia cầm được phân lập từ đất và nước thải. Trong đó, Bacillus licheniformis PWD1 (Williams et al., 1990; Lin et al., 1995), Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Kocuria rosea LBP3 (Vidal et al., 2000; Bernal et al., 2006), Bacillus subtilis KS1 (Kim et al., 2001; Suh và Lee, 2001), Bacillus licheniformis K-508 (Rozs et al., 2001; Manczinger et al., 2003), Xanthomonas maltophila POA-1 (De Toni et al., 2002), Chryseobacterium sp. kr6 (Riffel et al., 2003), Bacillus licheniformis RG1 (Ramnani và Gupta, 2004), Microbacterium arborescens kr10 (Thys et al., 2004), Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis ATCC 6633 (Zerdani et al., 2004). Sangli và Brandelli (2000) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn từ rác thải chứa chủ yếu là keratin ở Brazil. Trong số đó thì kr2 là dòng có khả năng phân giải cao nhất khi phát triển trên môi trường chứa 10g/l lông gia cầm (là nguồn năng lượng, cacbon, nitơ duy nhất). Nhiệt độ tối ưu để nuôi vi khuẩn là 30oC và nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là 55 oC, pH = 8. Dòng kr2 được xác định là thuộc họ Vibrionaceae. Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về enzyme keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng của enzyme này. Trong đó, enzyme keratinase chỉ được sinh ra khi có sự hiện diện của cơ chất là keratin như lông, tóc, móng,… Cơ chế phản ứng phân giải keatin phức tạp gồm sự kết hợp giữa phản ứng cắt các cầu nối disulfide và thủy phân protein. Keratinase thuộc loại serine proteinase. Keratine được ứng dụng chế biến thức ăn gia súc, phân bón, làm sạch và giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Đồng thời, Gupta và Ramnani (2006) cũng đã tổng hợp các đặc điểm của các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được phân lập từ các bài nghiên cứu trước đó. Kết quả cho thấy, các dòng vi khuẩn phân giải keratin có dòng Gram âm và có dòng Gram dương. Các dòng vi khuẩn Gram dương đã được phân lập phần lớn thuộc chi Bacillus: Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990), Bacillus subtilis S14 (Macedo et al., 2005), Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, và Bacillus cereus (Kim et al., 2001), hoặc chi Streptomyces như: Streptomyces flavus (Antarctic et al., 2005), Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995), Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999), Streptomyces thermoviolaceus (Chitte et al., 1999) và một vài trường hợp khác là các dòng Fervidobacterium pennavoran (Friedrich và Antranikian, 1996), Microbacterium sp. kr10 (Thys et al., 2004), Terrabacter terrae (Barrientos et al., 2005) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Các dòng Gram âm chủ yếu thuộc các chi Vibrio (Sangali và Brandelli, 2000) và chi Chryseobacterium (Riffel et al., 2003)… Joshi et al. (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. PW-1 có khả năng phân giải lông vũ từ chất thải gia cầm. Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh. Theo kết quả nghiên cứu của Agrahari và Wadhwa (2010), ba dòng vi khuẩn Bacillus megaterium SN1, Bacillus thuringenesis SN2 và Bacillus pumilus SN3 phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi cấy. Adriane et al. (2007) đã ứng dụng dòng vi khuẩn Vibrio sp. (kr2) để phân giải lông gia cầm. Dòng vi khuẩn này đã được phân lập và nhận diện bởi Sangali và Brandelli (2000). Theo kết quả nghiên cứu, khi cho vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn lần lượt 40, 60, và 80g/l lông gia cầm đã sấy khô. Sau năm ngày thu được một lượng protein hòa tan, giá trị cao nhất là 2,5 g/l. Nhiệt độ tối ưu để đạt được lượng protein đó là 30oC và pH khoảng 6 - 8. Dòng vi khuẩn Kr2 có hiệu quả phân giải keratin trong lông gia cầm, bổ sung nguồn protein cho thức ăn gia súc, làm phân hữu cơ, giảm ô nhiễm môi trường. Veslava et al. (2009) đã chọn ra các dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis 511, B. subtilis 11, B. subtilis 717 và B. subtilis 103 phân lập từ nước thải tại khu công nghiệp chế biến gia cầm để khảo sát khả năng phân giải lông gia cầm. Các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường có bổ sung bột lông vũ: NaCl Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT (0,5g/l), KH2PO4 (0,4g/l), K2HPO4 (0,3g/l), bột lông vũ (10g/l) và agar (15g/l). Đối với dòng B. subtilis 103 thì hàm lượng enzyme keratinase tối đa là 152U/ml sau khi nuôi cấy 24 giờ, trong khi các dòng khác là 148 - 292U/ml sau 48 giờ nuôi cấy. Daroit et al. (2009) cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp. P45 biểu hiện khả năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông vũ. Dòng Bacillus sp. P45 có khả năng phân giải 90% lông gà sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng có bổ sung lông gà. Sự hình thành nhóm thiol cũng được ghi nhận trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, cho thấy sự đóng góp của quá trình phá hủy cầu nối disulfide trong sự phân giải keratin lông vũ. Tuy nhiên, dòng vi khuẩn này không có khả năng phân giải keratin tóc, có thể do sự đa dạng về cấu hình của cơ chất này so với keratin lông vũ. Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F71. Vi khuẩn này phân giải hoàn toàn lông gà trong vòng bảy ngày. Nhiệt độ 25 oC 40oC, và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của dòng vi khuẩn này. Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là 468U/ml, cao gấp 9,4 lần so với hoạt tính tạo ra trong môi trường không bổ sung sữa. Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ. Daroit et al. (2010) đã khảo sát hoạt tính enzyme của dòng vi khuẩn Bacillus sp. P45 trên nhiều môi trường cơ chất khác nhau. Dòng vi khuẩn này được Daniel phân lập tại vùng Amazone. Kết quả cho thấy khi bổ sung bột lông (môi trường feather meal agar-FMA) làm nguồn chất duy nhất thì ezyme có hoạt tính cao hơn. Và hoạt tính của enzyme keratinase tăng lên khi bổ sung NH4Cl vào môi trường FMA với khối lượng lần lượt từ 43 - 50g/l và 1,8 - 8,6g/l. Savitha et al. (2010) đã phân lập hai dòng vi khuẩn phân giải keratin từ đất: (KI8101 và KI8102) và nhận diện hai dòng này là Bacillus subtilis và B. licheniformis. Enzyme tinh sạch từ dòng KI8102 có hoạt tính cao (500U/mg), trọng lượng phân tử là 32KDa. Nhiệt độ tối ưu là 50 oC và pH = 7,5 thì dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải chất thải chứa keratin như tóc, móng, lông gia súc. Evelise et al. (2010) đã tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn mới được phân lập từ mẫu đất ở vùng Amazon. Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt trên môi trường FMA (feather meal agar). Các dòng vi khuẩn này được kiểm tra khả năng phân Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT giải lông gia cầm và nhận diện bằng đặc điểm sinh hóa. Ngoài ra, chúng còn được định danh dựa vào trình tự đoạn 16S rRNA. Hầu hết các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, ngoài ra còn có Aeromenas, Serratia và Chryseobacterium. Mazotto et al. (2011) đã phân lập được ba dòng vi khuẩn Bacillus (B. subtilis LFB-FIOCRUZ 1270, B. subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và B. licheniformis LFBFIOCRUZ 1274) từ nguồn chất thải lông gia cầm và tiến hành khảo khả năng tổng hợp enzyme keratinase khi sử dụng bột lông vũ làm cơ chất. Ba dòng vi khuẩn này sản sinh ra các enzyme keratinase và peptidase ngoại bào sau bảy ngày. Lông vũ được xác định là cơ chất tốt nhất cho hoạt động của keratinase và peptidase tạo ra bởi B. subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và đây cũng là dòng vi khuẩn biểu hiện hoạt động enzyme mạnh nhất. Cả ba dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải bột lông vũ (62% đến 75%) và lông vũ (40% đến 95%), tạo ra 3,9 đến 4,4mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung bột lông vũ và tạo ra 1,9 đến 3,3mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung lông vũ. Một số vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae cũng cho thấy khả năng phân giải keratin. Sangali và Brandelli (1999) đã phân lập được các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở chế biến gia cầm ở Brazil. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 30oC và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại. Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ được kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. Trong đó có ba dòng Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương (Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên đa dạng các chất thải chứa keratin như bột lông vũ, lông vũ thô, móng gà, tóc và len. Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein. Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân giải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường. Kết quả nhiên cứu của Riffel et al. (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium sp. dòng kr6 có khả năng phân giải hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng vi khuẩn này có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30oC và pH tối ưu 8,0. Dưới điều Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học