Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lõ giết mổ bõ thuộc tỉnh vĩnh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÕ GIẾT MỔ BÕ THUỘC TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN BÁ PHÖC MSSV: 3102849 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÕ GIẾT MỔ BÕ THUỘC TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN BÁ PHÖC MSSV: 3102849 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) TS. Bùi Thị Minh Diệu SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Trần Bá Phúc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cám ơn chân thành đến: Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi đến khi hoàn thành luận văn. Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường đại học Cần Thơ. Tập thể cán bộ và sinh viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật đã tạo điều kiện về các trang thiết bị cần thiết cho quá trình thực hiện luận văn cũng như chia sẻ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi. Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực hiện Trần Bá Phúc Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Tại Việt Nam có hàng ngàn tấn rác thải từ lông gia súc, gia cầm thải ra môi trường hằng năm mà chưa được xử lý. Keratin là hợp chất rất khó phân giải trong tự nhiên và là thành phần chính của các loại lông này. Sự phân giải các chất thải chứa keratin nhờ vi khuẩn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công-nông nghiệp. Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân giải keratin mạnh góp phần vào sự phát triển nông nghiệp bền vững và cải thiện môi trường bị ô nhiễm là rất cần thiết. Từ năm mẫu đất, ba mẫu nước, năm mẫu lông thu tại các lò giết mổ bò thuộc tỉnh Vĩnh Long đã phân lập được 47 dòng vi khuẩn trên môi trường có bổ sung bột lông heo như nguồn dinh dưỡng chủ yếu. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc tròn. Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô, bìa nguyên, màu trắng đục. 47 dòng phân lập được đều cho hoạt tính keratinase với cơ chất azokeratin. Dòng Kr42 là dòng vi khuẩn có tiềm năng để sản xuất enzyme keratinase với hoạt độ cao nhất 114,3U/ml. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân giải bột lông heo với tỷ lệ từ 12,38% - 37,66% sau một tuần lắc ủ ở 30C, 120 vòng/phút. Trong đó dòng Kr11 và Kr45 cho khả năng phân giải cao nhất 37,66% và 29,41%. Ở cùng điều kiện, khả năng phân giải bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn đạt từ 13,33% - 72,79%, dòng Kr45 cho khả năng phân giải mạnh nhất 72,79%. Dòng Kr45 cho khả năng phân giải tốt trên cả cơ chất bột lông heo và bột lông gia cầm, là dòng có tiềm năng ứng dụng sản xuất phân bón từ chất thải lông. Kết quả quan sát hình dạng, khả năng di động và nhuộm Gram cho thấy cả ba dòng Kr42, Kr45 và Kr11 đều có khả năng di động. Dòng Kr42 có hình que ngắn, dòng Kr11 có hình cầu nhỏ, cả hai đều là Gram âm. Dòng Kr45 có hình que ngắn, Gram dương. Từ khóa: Keratin, lông gia súc, lông gia cầm, azokeratin, vi khuẩn phân giải keratin. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học i Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... TÓM LƢỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................ vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ...........................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài ..................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3 2.1. Sơ lƣợc về keratin ............................................................................................... 3 2.2. Sơ lƣợc về chất thải chứa keratin ...................................................................... 4 2.3. Sơ lƣợc về enzyme keratinase ............................................................................ 5 2.4. Sơ lƣợc về vi khuẩn phân giải keratin .............................................................. 6 2.5. Khảo sát hình thái tế bào vi khuẩn ................................................................... 7 2.6. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân giải keratin ........ 8 2.6.1 Một số nghiên cứu trong nước .............................................................................. 8 2.6.2 Một số nghiên cứu ngoài nước ............................................................................. 9 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP..............................................11 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................................... 11 3.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 11 3.1.2. Vật liệu thí nghiệm .............................................................................................. 11 3.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 12 3.1.4. Địa điểm thí nghiệm............................................................................................ 12 3.1.5. Thời gian thực hiện ............................................................................................. 12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 13 3.2.1. Thu và xử lý mẫu................................................................................................. 13 3.2.2. Phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin ................................................. 13 3.2.3. Kiểm tra hoạt tính của enzyme keratinase bằng cơ chất azokeratin ............. 14 3.2.4. Đánh giá khả năng phân giải cơ chất chứa keratin của các dòng vi khuẩn phân lập được ...................................................................................................... 16 3.2.5. Quan sát hình dạng và nhuộm Gram tế bào vi khuẩn của các dòng sinh enzyme keratinase và phân giải mạnh cơ chất chứa keratin ......................... 19 3.2.6. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................................... 21 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................22 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ lò giết mổ bò..................... 22 4.1.1. Số lượng các dòng vi khuẩn phân lập được ..................................................... 22 4.1.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được ........... 22 4.2. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase bằng cơ chất azokeratin .... 25 4.3. Kết quả đánh giá khả năng phân giải cơ chất chứa keratin của các dòng vi khuẩn ............................................................................................................ 27 4.3.1. Kết quả đánh giá khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn .................................................................................................................... 27 4.3.2. Kết quả đánh giá khả năng phân giải lông gia cầm của các dòng vi khuẩn .................................................................................................................... 29 4.4. Kết quả quan sát hình dạng và nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn sinh enzyme keratinase và phân giải cơ chất chứa keratin mạnh .............. 33 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................34 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 34 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................35 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH ............................................................................................ PHỤ LỤC 2. MẬT SỐ VI KHUẨN ........................................................................... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học iii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ...................................................................... PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ THỐNG KÊ ....................................................................... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học iv Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Môi trường bột lông (bột lông heo, bột lông gia cầm) ....................................12 Bảng 2. Môi trường tăng sinh ........................................................................................12 Bảng 3. Số lượng các dòng vi khuẩn phân lập được .....................................................22 Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập được ...............23 Bảng 5. Đặc điểm của các dòng vi kuẩn Kr11, Kr45 và Kr42 ......................................33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc keratin dưới kính hiển vi ......................................................................3 Hình 2. Quy trình xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống ..................17 Hình 3. Hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn ......................................................24 Hình 4. Khả năng sinh enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn ...............................25 Hình 5. Khả năng phân giải bột lông heo của các dòng vi khuẩn .................................27 Hình 6. Khả năng phân giải bột lông gia cầm của một số dòng vi khuẩn .....................30 Hình 7. Khả năng sinh enzyme keratinase và khả năng phân giải các loại cơ chất chứa keratin của các dòng vi khuẩn. ................................................................ 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT BL Bột lông CFU Colony Forming Unit DC Đối chứng GC Gia cầm GL Giấy lọc IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology kDa Kilo Dalton LSD Least significant difference OD Optical Density rRNA Ribosomal ribonucleic acid STT Số thứ tự TCA Trichloroacetic acid Vk Vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nền nông nghiệp phát triển, ngành chăn nuôi ngày càng chiếm lợi thế khi mà đất canh tác trồng trọt ngày càng trở nên khan hiếm. Vì vậy, việc sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc từ gia súc, gia cầm theo đó cũng gia tăng, các lò giết mổ mọc lên ngày càng nhiều. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chỉ trong tháng 7 năm 2012, sản lượng heo hơi ước đạt 3.179,5 ngàn tấn, sản lượng thịt gia cầm ước đạt 744,7 ngàn tấn, sản lượng thịt trâu, bò ước đạt hơn 389 ngàn tấn. Bên cạnh đó, có khoảng hơn 28 ngàn tấn lông gia súc và hơn 37 ngàn tấn lông gia cầm từ các lò giết mổ cũng được thải ra môi trường mà chưa có biện pháp xử lý hiệu quả. Ngoài những chất thải lỏng dễ phân giải ở môi trường tự nhiên thải ra từ các lò giết mổ còn có những chất thải rắn khó phân giải như lông, móng, … chúng được cấu thành chủ yếu từ protein keratin. Trong keratin lại chứa những acid amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, keratin còn được dùng như một nguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ, gas sinh học. Tuy nhiên, việc sử dụng các biện pháp vật lý hay hóa học để phân giải keratin lại dễ phá hủy những acid amin và cần rất nhiều năng lượng, tạo ra các chất gây ô nhiễm môi trường (Matikevičienė et al., 2009). Vĩnh Long là một trong các tỉnh có tốc độ phát triển cao nhất tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Lượng rác thải, đặc biệt là rác thải từ lông tại các lò giết mổ trên địa bàn tỉnh này hiện chưa có biện pháp xử lý hiệu quả, gây ảnh xấu đến môi trường và sức khỏe người dân trong vùng. Việc ứng dụng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đạt được các ưu thế quan trọng là không gây hại với môi trường, nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm protein, và đạt được hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học. Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ bò thuộc tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện với mục đích bổ sung và làm phong phú thêm cho những nghiên cứu trước đó, đồng thời tạo ra triển vọng ứng dụng vào việc tận dụng và xử lý các phụ phế phẩm của ngành chăn nuôi, giúp hướng tới sự phát triển nông nghiệp bền vững và thân thiện với môi trường. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin cao để xử lý lông gia súc, gia cầm. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về keratin Theo Eggling (2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi, là thành phần chủ yếu tham gia vào cấu trúc biểu bì, tóc, móng, lông, sừng…, hoàn toàn không tan trong nước, kể cả trong dung dịch acid hay kiềm. Khi phân giải cho nhiều cystin (7 – 12%) và acid glutamic (4 – 17%). Dựa vào thành phần và trình tự acid amin, cũng như các đặc tính của sợi đơn polypeptide mà keratin được chia làm hai dạng chủ yếu là dạng α-helix và β-sheets. Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và β-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al., 2004). Ngoài ra, dựa vào hàm lượng lưu huỳnh (cầu nối disulfide) người ta cũng chia keratin thành hai loại là keratin cứng (được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc, móng guốc và móng với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài) và keratin mềm (ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn) (Voet và Voet, 1995). Nhờ có các cầu nối disulfide, liên kết hydro và tương tác kỵ nước mà keratin có cấu trúc khá bền vững, không tan trong nước, không bị phân giải bởi các protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain (Veslava Matikevičienėet et al., 2009). Tuy nhiên, keratin vẫn có thể bị phân giải bởi enzyme keratinase do vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm tạo ra (Onifade et al., 1998). Hình 1. Cấu trúc keratin dƣới kính hiển vi (Nguồn: http: //php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=File: Keratin_filaments.jpg ngày 22/8/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2. Sơ lƣợc về chất thải chứa keratin Lông chứa khoảng 90% protein, trong đó thành phần chính là keratin. Keratin là thành phần cấu tạo chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,… (Onifade et al., 1998). Đối với gia súc như heo thì lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng lượng cơ thể. Đối với gà trưởng thành thì lông chiếm 5 – 7% trọng lượng cơ thể (Lê Thị Thu Huyền, 2012). Tuy nhiên, lông rất khó bị phân giải nên không được xem là nguồn cung cấp protein chủ yếu. Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc này bền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sức chặt chẽ và khó phân giải. Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tự phân là 5 – 7 năm (Lê Thị Thu Huyền, 2012). Các chất thải giàu keratin khó phân giải và ngày càng tích lũy trong tự nhiên, chủ yếu ở dạng lông vũ, lông gia súc và tóc, góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môi trường (Gupta và Ramnani, 2006). Tuy nhiên, sự phân giải các chất thải chứa keratin vẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công - nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón. Thành phần hoá học của keratin thay đổi tuỳ theo nguồn gốc nhưng nó chứa rất nhiều sulfur dưới hình thức acid amin. Khi phân giải keratin tạo ra nhiều acid amin như cystein (15 – 17%), tyrosin, leucin, acid glutamic (4 – 17% ), alanin và lysin,... Những acid amin như acid glutamic, lysin, cystein, alanin và tyrosin là những acid amin cần thiết mà cơ thể không thể tự tổng hợp được. Ước tính hàng năm, trên thế giới thải ra hàng triệu tấn chất thải chứa keratin từ ngành chăn nuôi gia cầm, thuộc da và công nghiệp chế biến thịt và tỷ lệ này tăng khoảng 4,5% mỗi năm (C.A.S.T., 1995 và Freeman et al., 2009). Các phế phẩm của gia súc và gia cầm sau khi bị giết mổ đều thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng như lông heo, lông bò, sừng bò, móng trâu, móng bò, lông gà, vịt,… Việc xử lý các chất này thành thức ăn gia súc bằng các phương pháp hóa, lý tốn khá nhiều năng lượng (nhiệt độ và áp suất cao); đồng thời, làm mất đi các acid amin thiết yếu (Onifade et al., 1998), quá trình phân giải sinh học các chất thải chứa keratin đã được đề xuất như một giải pháp hiệu quả, ít tốn kém (Ignatova et al., 1999 và Xie et al., 2010). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.3. Sơ lƣợc về enzyme keratinase Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein có khả năng xúc tác và thúc đẩy các phản ứng hóa học trong tế bào sống. Mức độ tác động của chúng phụ thuộc rất lớn vào pH, ion, nhiệt độ và sự hiện diện hay vắng mặt của các yếu tố kìm hãm hay yếu tố hoạt hóa. Đất chứa đựng một số vi sinh vật sinh ra enzyme ngoại bào, sự bất động của enzyme ngoại bào được ổn định bởi mạng lưới ba chiều của những phân tử lớn và những enzyme bên trong tế bào vi sinh (Lean, 1982). Keratinase là một trong các enzyme phân giải protein có vai trò quan trọng trong phân giải protein keratin từ lông gia súc, gia cầm, tóc, móng (Mozammel Hoq et al., 2005). Đây là một loại enzyme ngoại bào, chỉ được tạo ra khi có sự hiện diện của cơ chất keratin. Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử (IUBMB), keratinase được ký hiệu là EC 3.4.99 (Owen et al., 1983), có trọng lượng phân tử khoảng vài trăm kDa. Enzyme này có trình tự tương đồng khoảng 97% so với serine protease và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế serine protease (Wang et al., 1995; Taha et al., 1998 và Bressollier et a1., 1999). Chỉ có một vài metalloprotease (là các protease mà trong trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại) cho thấy có hoạt tính phân giải keratin. Các metalloprotease này thường được thấy ở các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007). Keratinase phân giải keratin bằng cách tấn công vào các cầu nối disulfide (Prasad et al., 2010). Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các quy trình công nghiệp, chế biến thực phẩm hay công nghệ thuộc da (Gupta et al., 2002), có khả năng phân giải cơ chất keratin không tan thuộc họ protease. Enzyme keratinase được tạo ra chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm, chúng có khả năng phân giải chất thải chứa keratin và tổng hợp keratinase với hàm lượng cao (Riffel và Brandelli, 2006). Từ vi khuẩn: Theo báo cáo của Zerdani et al., 2004 thì một số dòng Bacillus có khả năng sinh enzyme keratinase, trong đó dòng Bacillus licheniformis (Ramnani et al., 2004; Korkmaz et al., 2004; Manczinger et al., 2003; Williams et al., 1991) được xác định là phổ biến nhất. Một số dòng khác như: Burkholderia, Chryseobacterium, Pseudomonas, Microbacterium (Brandell và Riffel., 2005) Chryseobacterium (Brandelli và Riffel, 2005; Riffel et al., 2003), Streptomyces (Bressollier et al., 1999; Montero-Barrientos et al., 2005) cũng có khả năng sinh keratinase. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Một số dòng nấm cũng có khả năng phân giải keratin như: Chrysosporium, Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis, Monodictys, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Doratomyces (Gradisar et al., 2000). Từ những năm 90 của thế kỷ XX, các kiến thức về keratin và enzyme keratinase đã dần được khám phá. Tuy nhiên, đến nay cơ chế phân giải sinh học keratin vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Noval và Nickerson (1959) đã mô tả sự phân giải keratin bởi enzyme của vi khuẩn. Sự phá hủy các cầu nối disulfide có thể là yếu tố quan trọng trong sự phân giải keratin (Kunert và Stransky, 1988; Kunert, 1992; Böckle và Müller, 1997). 2.4. Sơ lƣợc về vi khuẩn phân giải keratin Năm 1959, Molyneux và cộng sự đã phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin. Một số dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả năng phân giải lông vũ cũng được phân lập từ đất và lông vũ ở các cơ sở sản xuất và chế biến gia cầm. Trong đó các dòng cho khả năng phân giải keratin tốt thuộc Bacillus sp., B. licheniformis và B. subtilis (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008; Manczinger et al., 2003; Suh và Lee, 2001; Zhang et al., 2009). Gen kerA của Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự (Lin et al.,1995). Ngoài ra, các dòng như B. pumilus và B. cereus cũng cho thấy khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al., 2008; Kim et al., 2001; Kumar et al., 2008; Werlang và Brandelli, 2005). Theo nghiên cứu của Chitte et al. (1999) và Mohamedin (1999) cho thấy một số dòng Streptomyces chịu nhiệt (thermophylic) phân lập được từ đất có thể phát triển và phân giải keratin ở nhiệt độ trên 50oC. Ngoài ra, một số dòng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999) cũng cho thấy khả năng phân giải keratin tốt. Khả năng phân giải keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được sản xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Böckle và Müller (1997) cho thấy Streptomyces pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide nhờ khả năng tạo ra enzyme disulfide reductase khi phát triển trên cơ chất lông vũ. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trong số các vi khuẩn Gram dương, các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được nhận diện là Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp. (Thys et al., 2004), và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Một số vi khuẩn Gram âm như các loài Vibrio sp. (Sangali et al., 2000), Chryseobacterium sp. (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp. (De Toni et al., 2002) cũng được cho thấy có khả năng phân giải keratin. Một số loài vi khuẩn chịu nhiệt cũng tạo được enzyme keratinase như Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Thermoanaerobacterkeratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002), và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005). 2.5. Khảo sát hình thái tế bào vi khuẩn Phương pháp nhuộm Gram: Nhuộm Gram là phương pháp dùng để phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm là Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặt tính hóa lý của vách tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều nhà khoa học khác cải tiến. Theo Nguyễn Lân Dũng et al. (2007), phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của vách tế bào vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn.  Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày từ 15 đến 50nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp crystal violet. Sau khi nhuộm với phức hợp crystal violet, mẫu được xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng cách giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp crystal violet bên trong tế bào, vì vậy vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (Biền Văn Minh, 2010). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Vi khuẩn Gram âm thì thành tế bào mỏng hơn (chỉ khoảng 10nm) và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài. Khi xử lý với hỗn hợp khử màu thì hỗn hợp này đóng vai trò là chất hòa tan lipid và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan không thể giữ được phúc hợp crystal violet và tế bào Gram âm bị khử màu, sau đó bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. Vì vậy Gram âm bắt màu đỏ (Biền Văn Minh, 2010). Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát qua tiêu bản sống dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 để xác định hình dạng và màu sắc (đặc tính Gram). 2.6. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn phân giải keratin 2.6.1 Một số nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông gia cầm. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất 7 dòng xạ khuẩn và 15 dòng Bacillus có hoạt tính phân giải casein rõ rệt. Trong đó 5 dòng xạ khuẩn và 2 dòng Bacillus có khả năng giải lông gà mạnh mẽ. Các dòng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… đã được phân lập từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010). Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt ở 30 - 40oC trên môi trường có bổ sung bột lông heo và khả năng phân giải lông vũ đạt từ 75 - 90% sau 3 ngày nuôi cấy. Bộ kit API 50CHB, API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA đã được sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh của các dòng vi khuẩn phân lập được. Nguyễn Thu Hiền et al. (2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ. Đinh Thị Bé Hiền (2011) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 19 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc. Trong đó, dòng vi khuẩn K13, dòng O3 và dòng K8 cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân giải lông gia súc lần lượt là 63,38%, 60,9% và 58,33%. 21 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông vũ đã được phân lập từ lông và đất (Nguyễn Thị Hồng Thẩm, 2011). Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà hiệu quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 98% và dòng K15 tương đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91với độ tương đồng 99%. Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 - 8, nhiệt độ 35C, nồng độ lông là 20g/l. 2.6.2 Một số nghiên cứu ngoài nước Sangali et al. (1999) các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin thuộc họ Vibrionaceae đã được phân lập từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và tạo ra enzyme phân giải keratin của vi khuẩn này là 30C. Riffel et al. (2002) đã thực hiện một nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium sp. dòng kr6 có khả năng phân giải hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của dòng này là 30C và pH tối ưu bằng 8. Dưới điều kiện này, lông vũ cũng được phân giải một cách tối đa. Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+. Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông heo và được kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. Trong đó có ba dòng Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương (Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên nhiều loại chất thải chứa keratin như bột lông heo, lông vũ thô, móng gà, tóc và len. Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein. Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân giải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường. Geun-Tae Park et al. (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F7-1. Vi khuẩn này phân giải hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày. Nhiệt độ 25 - 40oC, và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học