Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc

  • Số trang: 75 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 11 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY MSSV: 3102796 LỚP: CNSH KHÓA 36 Cần Thơ, tháng 05 năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY MSSV: 3102796 LỚP: CNSH KHÓA 36 Cần Thơ, tháng 05 năm 2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. Bùi Thị Minh Diệu Phạm Thái Vy DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các bậc sinh thành, quý thầy cô, các anh chị và các bạn sinh viên. Xin gửi lời cám ơn chân thành đến: Cha mẹ của tôi, những người đã có công nuôi nấng dưỡng dục, dạy bảo, tạo điều kiện vật chất để tôi yên tâm chuyên lo học hành và luôn cho tôi những lời khuyên khi gặp khó khăn trong công việc cũng như trong cuộc sống. Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn. Ts. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi đến khi hoàn thành đề tài luận văn. Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Cần Thơ. Tập thể cán bộ và sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, phòng Hóa sinh thực phẩm đã tạo điều kiện, hỗ trợ về các trang thiết bị cần thiết cho quá trình thực hiện đề tài cũng như chia sẻ kinh nghiệm, động viên giúp tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Cần Thơ, ngày tháng Sinh viên thực hiện Phạm Thái Vy năm 2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Collagen có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, y học, dược phẩm và mỹ phẩm. Trên thực tế, collagen là loại protein quan trọng trong cấu trúc cơ thể động vật như da, xương. Việt nam, với lợi thế là quốc gia có nền nông - ngư nghiệp phát triển, hàng năm thải ra môi trường hàng tấn phụ - phế phẩm (Theo Tổng cục thống kê, tính đến tháng 4 năm 2014 là 86.340 tấn phụ - phế phẩm cá Tra/Basa ) nên việc tận dụng collagen từ cơ thể động vật, đặc biệt là nguồn phế thải trong quá trình sản xuất thủy sản sẽ đem lại giá trị kinh tế. Hiện nay, việc tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học đang được chú trọng đầu tư, nghiên cứu. Một trong những bước nghiên cứu đầu tiên là tìm kiếm nguồn sinh vật sản xuất enzyme collagenase hiệu quả. Hệ vi sinh vật chứa một lượng enzyme collagenase khá phong phú. Do đó, việc chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase là một bước khởi đầu cần thiết. Từ ba mẫu mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên hai loại môi trường gelatin (giai đoạn phân lập) và collagen (giai đoạn sau khi tách ròng). Đa số khuẩn lạc có dạng không đều, độ nổi mô, dạng bìa nguyên, màu trắng đục. Vi khuẩn có thời gian phát triển trung bình, phần lớn là hình cầu. Dựa vào kết quả kích thước vòng phân giải khi cho dịch enzyme thô vi khuẩn tương tác với cơ chất collagen, dưới tác động của thuốc thử TCA 35%, xác định được 19 trong số 41 dòng vi khuẩn phân lập được cho hoạt tính enzyme collagenase. Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp Ninhydrin và được đo qua bốn ngày, dòng CV41 cho hoạt tính cao nhất (2,85 U/ml) ở ngày thứ hai, tiếp theo là dòng CV37 (hoạt tính 2,03 U/ml) ở ngày thứ hai và dòng CV32 (hoạt tính 2 U/ml) ở ngày thứ ba. Cả ba dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 đều thuộc nhóm Gram âm, di động nhưng hình dạng khác nhau; dòng CV32 và CV37 hình cầu, dòng CV41 hình que ngắn. Ba dòng vi khuẩn đều phản ứng dương tính với thử nghiệm amylase và catalase; phản ứng âm tính với thử nghiệm Methyl Red và Voges Proskauer. Thử nghiệm Indol, dòng CV37 cho phản ứng dương tính, dòng CV32 và CV41 cho phản ứng âm tính. Từ khóa: Collagen, enzyme collagen, gelatin, mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT .............................................................................................................. LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... TÓM LƯỢC ........................................................................................................................ i MỤC LỤC .......................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................................... v DANH SÁCH HÌ NH ......................................................................................................... vi TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................................................vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU............................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .......................................................................... 2 2.1. Sơ lƣợc về collagen ............................................................................................... 2 2.1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về collagen. ........................................................................ 2 2.1.2. Cấu trúc của collagen. ..................................................................................... 2 2.1.2.1. Cấu trúc phân tử của collagen ................................................................... 2 2.1.2.2. Thành phần acid amin ............................................................................... 3 2.1.3. Phân loại collagen. ........................................................................................... 5 2.1.4. Ứng dụng của collagen .................................................................................... 5 2.1.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm ................................................................... 6 2.1.4.2. Trong y học và dƣợc phẩm ........................................................................ 7 2.1.4.3. Trong mỹ phẩm ......................................................................................... 7 2.1.5. Sơ lƣợc về gelatin ............................................................................................ 8 2.2. Sơ lƣợc về enzyme collagenase ............................................................................. 9 2.2.1. Định nghĩa enzyme collagenase ...................................................................... 9 2.2.2. Nguồn enzyme collagenase và một số tính chất cơ bản ................................ 10 2.2.2.1. Enzyme collagenase của mô .................................................................... 10 2.2.2.2. Enzyme collagenase của vi sinh vật ........................................................ 11 2.2.3. Một số tính chất của enzyme collagenase ..................................................... 14 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.2.3.1. Kích thƣớc và cấu trúc phân tử ............................................................... 14 2.2.3.2. Độ bền enzyme ........................................................................................ 14 2.2.3.3. Tính đặc hiệu của enzyme ....................................................................... 15 2.2.4. Một số ứng dụng của enzyme collagenase .................................................... 16 2.2.4.1. Trong nghiên cứu tách chiết collagen ..................................................... 16 2.2.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm ................................................................. 17 2.2.4.3. Trong y học, dƣợc phẩm và mỹ phẩm ..................................................... 19 2.2.5. Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới và Việt Nam.......... 21 2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới ......................................... 21 2.2.5.2. Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam ......................................... 22 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23 3.1. Thời gian, địa điểm .............................................................................................. 23 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ....................................................................................... 23 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 23 3.2.2. Thiết bị và hóa chất ....................................................................................... 23 3.2.2.1. Thiết bị..................................................................................................... 23 3.2.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 24 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25 3.3.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trƣờng Czapek cải tiến .................................................................... 25 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.................................................................................. 27 3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn ............................................................................................ 28 3.3.4. Xác định một số đặc tính hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn................................................................................... 30 3.3.4.1. Xác định một số đặc tính hình thái .......................................................... 30 3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa........................................................... 31 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 32 4.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT từ mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc ....................................................... 32 4.1.1. Số lƣợng dòng vi khuẩn phân lập đƣợc .......................................................... 32 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ............................ 32 4.2. Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ................................... 34 4.3. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn .. 37 4.4. Một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh đƣợc tuyển chọn ........................................ 39 4.4.1. Đặc tính hình thái .......................................................................................... 39 4.4.2. Đặc tính sinh hóa ........................................................................................... 40 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 42 5.1. Kết luận................................................................................................................ 42 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 43 PHỤ LỤC ............................................................................................................................. PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH 1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm 2. Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện thí nghiệm PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN PHỤ LỤC 3. ĐỒNG NHẤT MẬT SỐ VI KHUẨN PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ 1. Kết quả thống kê xác định đƣờng kính vòng phân giải 2. Kết quả thống kê xác định hoạt tính enzyme collagenase Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần phần trăm mỗi bộ ba acid amin trong phân tử collagen ..................... 3 Bảng 2. Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể ngƣời ................. 5 Bảng 3. Thành phần phần trăm các acid amin thu đƣợc khi thủy phân 100g gelatin ......... 9 Bảng 4. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô ................................................ 11 Bảng 5. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ vi sinh vật ..................................... 13 Bảng 6. Thành phần hóa chất môi trƣờng Czapek cải tiến................................................ 24 Bảng 7. Thành phần môi trƣờng tăng sinh ........................................................................ 24 Bảng 8. Nồng độ pha loãng ............................................................................................... 26 Bảng 9. Nồng độ pha dung dịch leucine............................................................................ 29 Bảng 10. Thành phần hóa chất dựng đƣờng chuẩn leucine ............................................... 29 Bảng 11. Số lƣợng dòng vi khuẩn theo nguồn gốc phân lập ............................................. 32 Bảng 12. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ............................... 32 Bảng 13. Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn....................................................................................... 38 Bảng 14. Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .......................... 39 Bảng 15. Kết quả thử nghiệm một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn.......................................................................................................... 40 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc phân tử collagen ....................................................................................... 2 Hình 2. Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide .............. 3 Hình 3. Trật tự sắp xếp của các acid amin trong phân tử collagen ..................................... 4 Hình 4. Cấu trúc sợi collagen .............................................................................................. 4 Hình 5. Hanamai Collagen ................................................................................................. 6 Hình 6. Một số mỹ phẩm chứa collagen.............................................................................. 8 Hình 7. Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin................................................................ 9 Hình 8. Pseudomonas sp., C. Histolyticum và Aspergillus oryzae ................................... 13 Hình 9. Bệnh co cứng Dupuytren ...................................................................................... 19 Hình 10. Các bƣớc trong giai đoạn nhuộm Gram. ............................................................ 31 Hình 11. Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn .................................................. 34 Hình 12. Vòng phân giải của các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase.......... 35 Hình 13. Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn ........................................................................................ 36 Hình 14. Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .......................... 40 Hình 15. Kết quả một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn......... 41 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT CFU Colony - Forming Unit ĐC Đối chứng ĐK Đƣờng kính kDa Kilo Dalton KL Khuẩn lạc MR Methyl Red OD Optical Density PTN Phòng thí nghiệm PCR Polymerase Chain Reaction SDS - PAGE Sodium Dedocyl Sulfate - Gel Polyacrylamide STT Số thứ tự TCA Trichloroacetic Acid UV Ultraviolet VK Vi khuẩn VP Voges Proskauer Chuyên ngành Công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Collagen là protein quan trọng và chiếm lượng khá cao trong cấu trúc của cơ thể động vật (khoảng 30% tổng lượng protein trong cơ thể động vật có xương sống là collagen). Đặc biệt, collagen có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, dược phẩm hay mỹ phẩm. Vì vậy, việc khai thác nguồn collagen tự nhiên từ động vật sẽ mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân, trong khi collagen từ cơ thể động vật là loại protein khó phân giải. Enzyme collagenase chính là lựa chọn thích hợp nhất để phân giải collagen, enzyme collagenase là enzyme duy nhất có khả năng phân giải collagen khi cơ chất ở trạng thái tự nhiên. Hiện nay, collagen trên thị trường đa phần được tách chiết theo phương pháp hóa học (sử dụng acid acetic), việc tách chiết collagen bằng enzyme collagenase (phương pháp sinh học) đang trở thành đề tài rất được quan tâm, nghiên cứu. Bởi vì, so với phương pháp hóa học, tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học không những tạo ra sản phẩm an toàn, chất lượng mà còn giảm bớt ô nhiễm môi trường khi hạn chế được lượng lớn hóa chất dùng trong sản xuất. Vấn đề đặt ra là tìm được nguồn enzyme collagenase hiệu quả để ứng dụng vào việc tách chiết collagen; và hệ vi sinh vật có thể xem như một nguồn thích hợp để sản xuất enzyme collagenase. Dựa vào sự đa dạng vốn có của hệ vi sinh vật nên khả năng tạo ra nguồn enzyme collagenase hiệu quả sẽ rất lớn. Nhiều vi sinh vật đã được phát hiện có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase như Clostridium, Bacillus subtilis, Vibrio hay Pseudomonas, phần lớn đều được phân lập từ đất (Kawahara, 1993). Với mắm cá, loại thực phẩm dùng phổ biến trong bữa ăn của người Việt Nam, được chế biến theo phương pháp truyền thống với thành phần chính là cá và muối sẽ là nguồn lý tưởng để phân lập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase hiệu quả. Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc” được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập để tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về collagen 2.1.1. Định nghĩa collagen Collagen được xếp vào nhóm các protein cứng dạng sợi: sợi collagen. Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng protein có trong cơ thể ở các động vật có xương sống (Harper, 1980). Collagen có nhiều trong gân, da, xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các màng liên kết bao quanh cơ. Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (khoảng 90% trong gân, xương và khoảng 20% trong da) có chứa collagen. Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể. 2.1.2. Cấu trúc của collagen 2.1.2.1. Cấu trúc phân tử của collagen Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dài khoảng 300nm, đường kính khoảng 1,5nm. Hình 1. Cấu trúc phân tử sợi collagen (*Nguồn: http://luanvan.co/luan-van/trich-ly-collagen-va-ung-dung-354/ ngày 02/09/2013) Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide cuộn lại với nhau. Mỗi chuỗi cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc. Mỗi chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 100kDa (Seifter và Harper, 1971), tạo nên tổng trọng lượng phân tử collagen khoảng 300kDa (Harper, 1980). Chuỗi  được cấu tạo bởi khoảng 1000 amino acid, các chuỗi  khác nhau ở thành phần amino acid ( 1 ,  2 và  3 ). Sự phân bố của các chuỗi 1 ,  2 và  3 khác nhau trong các phân tử collagen tùy thuộc vào sự khác biệt về gen. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 2. Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide (*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html ngày 29/05/2014) 2.1.2.2. Thành phần acid amin Trong collagen chứa rất ít hoặc không chứa cysteine và tryptophan, giàu thành phần glycine, proline và hydroxyproline, collagen là một trong số ít protein có chứa hydroxylysine. Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các protein khác không có (Harper, 1980). Trong phân tử collagen chứa khoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline. Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau: Bảng 1. Thành phần phần trăm mỗi bộ ba acid amin trong phân tử collagen Bộ ba amino acid Tỷ lệ (%) Gly - X – X 44 Gly - I – X 27 Gly - X – I 20 Gly - I – I 9 (*Nguồn: Lodish et al., 2000) Trong đó, I là acid amin proline hoặc hydroxyproline, X là các acid amin khác. Glycine chiếm 1/3 trong tổng số các acid amin và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 trong xuyên suốt phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 3. Trật tự sắp xếp các acid amin trong phân tử collagen (*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html ngày 29/05/2014) Ngoài ra, trong phân tử collagen còn có những vùng gồm khoảng 9 - 26 acid amin tại các điểm đầu mút amin hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sáp lại với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide. Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của collagen. Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành các collagen fibril (collagen sợi nhỏ). Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp - collagen fiber. Vì thế collagen rất chắc, dai và bền. Hình 4. Cấu trúc sợi collagen a) Cấu trúc khái quát 3 sợi xoắn của collagen b) Phân tử collagen. c) Collagen fibril đường kính từ 10 - 300nm. d) Collagen fibril bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp collagen fiber, đường kính từ 0,5 - 3μm. (*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html ngày 29/05/2014) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.1.3. Phân loại collagen Tính tới thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng được mã hóa bởi 41 loại gen khác nhau, tạo thành 27 loại collagen. Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật (da heo còn trẻ chứa 50%), theo thời gian tỷ lệ này giảm từ 5 - 10%. Collagen loại IV là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào. Các loại collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất ít và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt. Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gen ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách không bình thường. Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được tách chiết. Chúng khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như kích cỡ và bản chất của những phần không xoắn ốc. Bảng 2. Kết cấu chuỗi và sự phân bố của một số loại collagen trong cơ thể ngƣời Loại collagen Nhóm Kết cấu chuỗi Phân bố I Sợi  1[I]  2[I] Da, xương, dây chằng II Sợi  1[II]3 Sụn III Sợi  1[III]3 Da, mạch máu, ruột  1[IV]2  2[IV] IV Mạng lưới  3[IV]  4[IV]  5[IV] Màng tế bào  5[IV]2  6[IV]  1[V]3 V Sợi  1[V]2  2[V] Xương, giác mạc, nhau thai, gân  1[V]  2[V]  3[V] VI Mạng lưới  1[VI]  2[VI]  3[VI]  1[VI]  2[VI]  4[VI] Xương, gân, sụn (*Nguồn: Lodish et al., 2000) 2.1.4. Ứng dụng của collagen Collagen có rất nhiều ứng dụng trong công nghiêp thực phẩm, mỹ phẩm, y học và dược phẩm. Collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân. Collagen thủy phân được gọi là collagen hydrolysate. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen sẽ có những ứng dụng khác nhau. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.1.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm Collagen được dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu để sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. Trong các sản phẩm pho-mát, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate thích hợp nhằm ngăn chặn sự mất nước. Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này. Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường. Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa từ 0,5 - 1% hàm lượng collagen hyrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy. Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, chất tạo độ xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng. Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội collagen hydrolysate chiếm từ 1 5%, giữ hương vị tự nhiên cho thực phẩm, đồng thời cũng là chất kết dính giúp cho việc tạo thành sản phẩm dễ dàng hơn. Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate (chứa từ 0,002 - 0,15%) sử dụng như chất làm trong. Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óng ánh. Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5 - 10 lần thể tích của nó nên được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước. Hình 5. Hanamai Collagen (*Nguồn: www.hangngoainhap.com.vn/33-hanamai-collagen-cua-nhat-collagen-dang-botchiet-xuat-tu-ca.html ngày 02/09/2013) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.1.4.2. Trong y học và dƣợc phẩm Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành các dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho sản xuất các sản phẩm y học. Màng collagen được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy. Collagen được sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, thuốc kháng sinh, insullin, hormone tăng trưởng. Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác thuộc lĩnh vực y khoa, phẫu thuật, chỉnh hình. Collagen còn được dùng trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng. Collagen còn được sử dùng để sản xuất bao con nhộng cứng và mềm, chúng được dùng để bảo vệ thuốc khỏi những nhân tố có hại như ánh sáng hay oxy. Thành phần chính của vỏ bao thuốc là collagen và các tá dược khác như glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu. Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho người bệnh có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng. 2.1.4.3. Trong mỹ phẩm Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da mịn màng, tươi tắn và trẻ trung. Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào. Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể. Collagen có vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị thương tổn. Chính vì vậy collagen được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm. Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da, chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu ôliu, tinh dầu hoa hồng có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại, khói bụi, hóa chất. Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn. Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc, tóc dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bóng mượt. Trong các sản phẩm chăm sóc tóc Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn tóc. Collagen còn được dùng trong điều trị phục hồi, thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thương hay giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu da thừa sau khi giảm béo. Hình 6. Một số mỹ phẩm chứa collagen (*Nguồn: http://www.yourdiscountchemist.com.au/ ngày 29/05/2014) 2.1.5. Sơ lƣợc về gelatin Khi collagen được thủy phân đủ sẽ thu được một loại protein dễ tan trong nước, được gọi là gelatin. Điều này xảy ra do sự biến tính collagen dưới tác động nhẹ của nhiệt tạo ra gelatin mà không bị bẻ gãy các liên kết peptide (Seifter và Harper, 1971). Quá trình này bao gồm việc dãn xoắn cuộn collagen và sắp xếp lại dạng cấu trúc Poly L - proline của các chuỗi peptide. Gelatin có cấu trúc gần giống với collagen, hay phân tử gelatin là một phần trong phân tử collagen. Cấu trúc phân tử gelatin chứa 18 acid amin liên kết với nhau theo một trật tự xác định, tuần hoàn, tạo nên chuỗi polypeptide với khoảng 1000 đơn vị, hình thành nên cấu trúc bậc I. Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly - X - Y (với X chủ yếu là nhóm proline, còn Y là nhóm hydroxyproline). Cứ 3 chuỗi polypeptide xoắn lại theo hình xoắn ốc tạo nên cấu trúc bậc II. Ở cấu trúc bậc III, chuỗi xoắn đó tự xoắn quanh nó, tạo nên cấu trúc phân tử dạng dây thừng, gọi là “proto fibril”. Trong phân tử gelatin có một số nhóm mang điện tích: carboxyl, imiazole, amino, guanidine. Tỷ lệ các nhóm này ảnh hưởng đến pH và pI của gelatin. Ngoài ra, số lượng nhóm không mang điện tích như các nhóm hydroxyl (serine, threonine, hydroxyproline, hydroxylysine, tyrosine) và các nhóm peptide (- CO - NH -) quy định khả năng tạo liên kết hydro, quy định cấu trúc phân tử. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 3. Thành phần phần trăm các acid amin thu đƣợc khi thủy phân 100g gelatin Thành phần Tỷ lệ (%) Thành phần Tỷ lệ (%) Alanine 8 – 11 Lysine* 4–5 Arginine* 8–9 Methionine* 0,7 – 1 Aspartic acid 6–7 Phenylalanine* 2–3 Glutamic acid 11 – 12 Proline 15 – 18 Glycine 26 – 31 Serine 2,9 – 4,2 Histidine* 0,7 – 1 Systeine 0 Hydroxyproline 13 – 15 Threonine* 2,2 – 4,4 Hydroxylysine 0,8 – 1,2 Trytophan* 0 Isoleucine* 1,4 – 2 Tyrosine 0,2 – 1 Leucine* 3 – 3,5 Valine* 2,6 - 3,4 (*Ghi chú: *: Acid amin không thay thế) (*Nguồn: Lodish et al., 2000)) Hình 7. Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin (*Nguồn: http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/9128063/1/ ngày 07/01/2014) 2.2. Sơ lƣợc về enzyme collagenase 2.2.1. Định nghĩa enzyme collagenase Enzyme collagenases là enzym phá vỡ các liên kết peptide trong cấu trúc phân tử collagen dạng Poly - L - proline đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên (Seifter và Harper, 1971), xúc tác quá trình thủy phân collagen. Enzyme collagenase Collagen tự nhiên + H2O peptides và/hoặc những đoạn dài hơn Định nghĩa này bao gồm các enzyme có thể tác động đến vùng xoắn và chỉ cắt chuỗi xoắn ở một liên kết peptide duy nhất cũng như các enzyme có khả năng cắt các liên kết peptide ở các vị trí khác nhau trong vùng xoắn. Theo định nghĩa này, vị trí cắt của các enzyme không được quy định là phải ở trong vùng không có cực hay vùng có Chuyên ngành Công nghệ sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
- Xem thêm -