Tài liệu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic ứng dụng trong bánh mì bột chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID LACTIC ỨNG DỤNG TRONG BÁNH MÌ BỘT CHUA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG BÙI THẢO NGUYÊN MSSV: 3092426 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID LACTIC ỨNG DỤNG TRONG BÁNH MÌ BỘT CHUA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG BÙI THẢO NGUYÊN MSSV: 3092426 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – Năm 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung Bùi Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – Năm 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện Luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn các thầy cô đã quan tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian 4 năm đại học. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Phạm Hồng Quang đã giúp đỡ và chỉ dẫn cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành nội dung bài báo cáo Luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn các bạn sinh viên lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến Khóa 35 đã luôn giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi. Luận văn được thực hiện với nhiều sự chia sẻ quý báu từ các các bạn sinh viên khóa 36 và các học viên cao học tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Chân thành cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập. Cần Thơ, ngày 5 tháng 12 năm 2013 Người thực hiện Bùi Thảo Nguyên Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Đề tài được thực hiện với mục đích phân lập và khảo sát các đặc tính lên men acid lactic của các chủng vi khuẩn acid lactic trong bột chua để sử dụng làm bánh mì. Kết quả thu được 5 chủng vi khuẩn acid lactic phân lập từ mẫu bột chua lên men tự nhiên tại Thành phố Cần Thơ. Trong đó, LAB–4 là chủng có khả năng lên men acid lactic tốt nhất đồng thời cho ra sản phẩm bánh mì bột chua có quá trình nở bột và các đặc tính cảm quan tốt nhất. So sánh cho thấy, trình tự của đoạn gen 16S–rRNA của LAB–4 và Lactobacillus plantarum có tỷ lệ tương đồng lên đến 96%. Lactobacillus plantarum lên men bột chua tốt nhất với mật độ là 109 tb/mL. Mẫu bột chua được ủ trong điều kiện 37°C trong 4 giờ cho kết quả về lượng acid, quá trình nở của bột nhào và đánh giá cảm quan sản phẩm bánh mì bột chua tốt hơn. Quan sát cho thấy, bánh mì bột chua làm ra từ dòng Lactobacillus plantarum có chứa thành phần kháng nấm nên hiện tượng mốc của các mẫu bánh mì bột chua xảy ra sau 9 ngày. Lâu hơn mẫu bánh mì chỉ được làm từ nấm men 3 ngày trong điều kiện được bảo quản ở nhiệt độ thường. Từ khóa: bánh mì bột chua, bột chua, Lactobacillus plantarum, lên men acid lactic, vi khuẩn acid lactic. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến i Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................... iii LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................................... iv TÓM LƯỢC ......................................................................................................................... i MỤC LỤC ...........................................................................................................................ii DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................................... vi TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................................................vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về bánh mì bột chua .................................................................................. 3 2.1.1. Lịch sử của bánh mì bột chua .............................................................................. 3 2.1.2. Quy trình sản xuất bánh mì bột chua ................................................................... 4 2.1.3. Các nguyên liệu để làm bánh mì bột chua ........................................................... 6 2.2. Hệ vi sinh vật trong bột chua ..................................................................................... 8 2.2.1. Các vi sinh vật có mặt trong bột chua ................................................................. 8 2.2.2. Phân loại bột chua .............................................................................................. 10 2.2.3. Sự tương tác giữa các vi sinh vật trong bột chua............................................... 13 2.3. Vai trò của vi khuẩn lên men acid lactic trong bột chua .......................................... 14 2.3.1. Ảnh hưởng đối với hương vị và kết cấu của bánh ............................................. 14 2.3.2. Tăng hàm lượng dinh dưỡng cho bánh mì bột chua .......................................... 15 2.3.3. Tạo chất kháng mốc và bacteriocin cho sản phẩm bánh mì bột chua ............... 16 2.4. Vi khuẩn acid lactic .................................................................................................. 17 2.4.1. Đặc điểm chung ................................................................................................. 17 2.4.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 17 2.4.3. Phân loại vi khuẩn acid lactic ............................................................................ 18 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến ii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT 2.5. Phương pháp định danh............................................................................................ 22 2.5.1. Kỹ thuật ly trích Deoxyribonucleic Acid (DNA) .............................................. 22 2.5.2. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction ................................................................ 22 2.5.3. Kỹ thuật điện di ................................................................................................. 24 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 25 3.1. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................... 25 3.1.1 Thời gian – địa điểm ........................................................................................... 25 3.1.2. Nguyên vật liệu .................................................................................................. 25 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 25 3.1.4. Hóa chất ............................................................................................................. 25 3.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 25 3.2.1. Chuẩn bị mẫu bột chua ...................................................................................... 25 3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn acid lactic từ bột chua lên men tự nhiên ............. 26 3.2.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao ... 27 3.2.4. Định danh chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao ..... 28 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của mật số chủng vi khuẩn acid lactic đến quá trình lên men bột chua .......................................................................................................... 30 3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ủ đến quá trình lên men bột chua ........................................................................................................................ 31 3.2.7. Đánh giá khả năng bảo quản của sản phẩm bánh mì bột chua .......................... 32 3.2.8. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 32 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 33 4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn acid lactic từ bột chua lên men tự nhiên ................... 33 4.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao ......... 35 4.3. Định danh chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao ............ 39 4.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của mật số chủng vi khuẩn acid lactic đến quá trình lên men bột chua ............................................................................................................. 40 4.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến quá trình lên men bột chua ............................................................................................................. 43 4.6. Đánh giá khả năng bảo quản của sản phẩm bánh mì bột chua ................................ 50 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 52 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến iii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT 5.1. Kết luận .................................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 53 PHỤ LỤC .............................................................................................................................. PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH HÌNH PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC 3: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến iv Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Bánh Panettone (a) và bánh Pandoro (b) ...................................................... 3 Hình 2. Phương pháp làm bánh mì từ bột chua lên men tự nhiên ............................. 4 Hình 3. Hình ảnh một số loài vi sinh vật hiện diện trong bột chua ........................... 9 Hình 4. Phân loại bột chua ...................................................................................... 10 Hình 5. Hình ảnh bánh mì bị mốc ........................................................................... 16 Hình 6. Sơ đồ quá trình lên men acid lactic đồng hình ........................................... 19 Hình 7. Sơ đồ quá trình lên men acid lactic dị hình ................................................ 20 Hình 8. Quy trình làm bột chua ............................................................................... 26 Hình 9. Quy trình làm bánh mì bột chua ................................................................. 28 Hình 10. Chu trình nhiệt PCR ................................................................................. 30 Hình 11. Hình ảnh kết quả nhuộm Gram. ............................................................... 33 Hình 12. Hình ảnh kết quả nhuộm bào tử. .............................................................. 34 Hình 13. Hình ảnh kết quả phân giải CaCO3. ......................................................... 34 Hình 14. Hình chụp chính diện và lát cắt ngang của các mẫu bánh mì. ................. 38 Hình 15. Kết quả so sánh trình tự của LAB–4. ....................................................... 39 Hình 16. Hình ảnh bề mặt và lát cắt của các mẫu bánh mì ..................................... 42 Hình 17. Giá trị pH của các mẫu bột chua với thời gian và nhiệt độ ủ khác nhau.. 44 Hình 18. Đồ thị biểu thị sự tương quan của thời gian và nhiệt độ ủ đối với pH của mẫu bột chua............................................................................................................ 45 Hình 19. Biểu đồ TA của các mẫu bột chua ủ ở thời gian và nhiệt độ khác nhau .. 46 Hình 20. Đồ thị tương quan giữa thời gian và nhiệt độ ủ đối với acid tổng của mẫu bột chua ................................................................................................................... 47 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến v Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần vi sinh vật đặc trưng trong từng loại bột chua ....................... 11 Bảng 2. Thành phần ống eppendorf cho phản ứng PCR ......................................... 29 Bảng 3. Các đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic ........................ 35 Bảng 4. pH và TA của các mẫu bột chua làm từ các chủng LAB khác nhau ......... 36 Bảng 5. Kết quả đánh giá bánh mì với mật độ LAB chủng khác nhau ................... 42 Bảng 6. Giá trị pH của các mẫu bột chua với thời gian và nhiệt độ ủ khác nhau ... 44 Bảng 7. TA của các mẫu bột chua được ủ ở thời gian và nhiệt độ khác nhau ........ 46 Bảng 8. Kết quả đánh giá cảm quan của các mẫu bánh mì được làm từ bột chua ủ trong các điều kiện khác nhau ................................................................................. 49 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến vi Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT CFU/g Colony Forming Unit per gram DNA Deoxyribonucleic acid DY Dough Yield EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid LAB Lactic acid bacteria MRS De Man, Rogosa and Sharpe NCBI National Center for Biotechnology Information HE LAB Heterofermentative lactic acid bacteria HO LAB Homofermentative lactic acid bacteria PCR Polymerase Chain Reaction TA Total acidity Taq Thermus aquaticus TE buffer Tris–EDTA buffer Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến vii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bánh mì bột chua là loại bánh mì được lên men đầu tiên đã xuất hiện trên thế giới. Sự phát triển của loại bánh mì này gắn liền với lịch sử phát triển của con người. Ngoài lịch sử lâu đời, các loại bánh mì bột chua cũng chiếm vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và nghệ thuật ẩm thực của nhiều nước. Sự đa dạng của loại bánh mì này cũng thể hiện được khác biệt về văn hóa nông nghiệp các quốc gia. Quá trình lên men của bánh mì bột chua được các vi sinh vật cộng sinh bên trong thực hiện gồm nấm men và vi khuẩn lên men acid lactic. Sự liên kết giúp đỡ lẫn nhau trong quá trình trao đổi chất giữa chúng giúp bánh mì bột chua làm ra có những đặc tính độc đáo, khác hẳn với những loại bánh mì hiện nay chỉ lên men bằng nấm men bánh mì. Vi khuẩn lên men acid lactic có ảnh hưởng lớn hơn đến chất lượng của quá trình lên men bột chua và bánh mì bột chua làm ra. Nhờ khả năng thủy phân protein và tổng hợp các chất tạo mùi vị, chất chống kháng dinh dưỡng, kháng nấm và kháng khuẩn của vi khuẩn lên men acid lactic mà bánh mì bột chua làm ra nổi tiếng về cấu trúc đặc biệt, hương vị độc đáo, tỷ lệ dinh dưỡng cao và thời gian lưu trữ dài. Trong các phương pháp sản xuất, lên men tự nhiên là cách sản xuất bột chua lâu đời nhất đồng thời cũng là cách sản xuất đuợc đánh giá cao nhờ tính đơn giản và thân thiện với môi trường. Từ khi nấm men bánh mì được phát hiện và trở nên phổ biến, bột chua không còn được sử dụng nhiều trong việc làm bánh mì. Trong một thời gian dài, bột chua chỉ được sử dụng như chất điều chỉnh acid thực phẩm. Tuy nhiên, bột chua vẫn giữ được vai trò nhất định nhờ các ưu điểm nổi trội về chất lượng bánh mì và các lợi ích cho sức khỏe. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lên men acid lactic trong bột chua trên thế giới. Tuy nhiên, đến thời điểm này, tại Việt Nam hầu như vẫn chưa có đề tài nghiên cứu nào về vấn đề này. Các nghiên cứu về bánh mì trong nước hiện nay chỉ tập trung nghiên cứu về các loại nấm nem bánh mì. Từ đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic ứng dụng trong bánh mì bột chua” được tiến hành. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 1 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lên men acid lactic từ bột chua lên men tự nhiên tại thành phố Cần Thơ. Từ đó, đề tài cũng khảo sát nhằm tìm ra một số điều kiện lên men tốt cho các chủng đã phân lập được. Nội dung nghiên cứu: − Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn acid lactic từ bột chua lên men tự nhiên. − Tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic tốt giữa các chủng phân lập được. − Khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện về mật độ giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men bột chua với chất lượng của bột chua và bánh mì bột chua làm ra. − Đánh giá khả năng bảo quản của sản phẩm bánh mì bột chua làm ra. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 2 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về bánh mì bột chua 2.1.1. Lịch sử của bánh mì bột chua Bánh mì là một trong những thực phẩm chính trên thế giới. Ổ bánh mì đầu tiên được làm ra vào khoảng thời kỳ đồ đá từ hỗn hợp sệt của bột ngũ cốc và nước. Tuy nhiên, khi người Ai Cập cổ làm ra được bánh mì lên men thì chúng mới được phát triển thật sự. Đầu tiên, họ phát hiện nếu để hỗn hợp bột mì và nước vài ngày tự nhiên trong không khí thì sẽ có hiện tượng sủi bọt và nở to. Hỗn hợp này chính là bột chua. Sau khi nướng lên, bột chua sẽ tạo bánh mì với mùi vị đặc trưng. Dù không hiểu được bản chất của quá trình lên men nhưng nhờ vào quan sát họ đã sáng tạo ra nhiều loại bánh khác nhau (Jacob, 2007). Bột chua lên men tự nhiên được sử dụng làm bánh mì đến tận thời kỳ Trung Cổ. a. b. Hình 1. Bánh Panettone (a) và bánh Pandoro (b) (*Nguồn: Italian food shop http://www.italianfoodshop.eu/, ngày 05/10/2013) Ngoài vai trò trong thực phẩm, các loại bánh lên men từ bột chua còn giữ vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần con người, đặc biệt là trong Thiên chúa giáo. Tại Ý, bánh Panettone và bánh Pandoro đại diện cho lễ Giáng Sinh; bánh Colomba đại diện cho lễ Phục Sinh (Ottogallo et al., 1996). Thêm vào đó, bánh mì bột chua còn đại diện cho khác biệt về kiến thức nông nghiệp, kỹ thuật canh tác và quá trình kế thừa về văn hóa của các vùng miền khác nhau. Khác biệt này thể hiện ở loại bột sử dụng, kỹ thuật và thời gian ủ lên men, loại bột chua làm ra và những nguyên liệu khác được thêm vào (Gobbetti và Gänzle, 2012). Ngoài ra, sự hiện diện của các loại bánh từ bột chua đóng góp không ít với nghệ thuật ẩm thực đặc trưng của nhiều quốc gia. Đây không còn là một loại thực phẩm bình thường mà là một sản phẩm mang tính chất lịch sử và nghệ thuật cao. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 3 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT Dù hiện nay nấm men bánh mì rất phổ biến, bột chua vẫn được tiếp tục sử dụng nhờ các đặc tính nổi bật của bánh mì như hương vị đặc biệt, chất lượng ổn định và thời gian bảo quản dài hơn. Bột chua thương mại được giới thiệu vào khoảng thập niên 70. Một trong những sản phẩm nổi tiếng nhất hiện nay là San Francisco Sour sử dụng để làm bánh mì San Francisco. 2.1.2. Quy trình sản xuất bánh mì bột chua Quá trình làm bánh mì bột chua (Hình 2) được chia thành hai giai đoạn gồm: giai đoạn làm bột chua và giai đoạn sử dụng bột chua làm bánh mì. Bột mì 80% 16% Nước Bột nhào mẹ 4% 3% 13% Muối 84% LÊN MEN LẦN THỨ NHẤT (Vị chua tươi hoặc giai đoạn đầu) NGHỈ LẦN THỨ NHẤT LÊN MEN LẦN THỨ HAI (Vị chua cơ bản hoặc giai đoạn hai) NGHỈ LẦN THỨ HAI BỘT CHUA THÀNH PHẦM (Nấm men tự nhiên) NGHỈ LẦN CUỐI CẮT VÀ TẠO HÌNH NGHỈ NHANH NƯỚNG BÁNH Hình 2. Phương pháp làm bánh mì từ bột chua lên men tự nhiên (* Nguồn: Nirmal, 2007) Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 4 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT Giai đoạn làm bột chua Bột chua là một sản phẩm lên men trung gian từ bột mì và nước. Đây là giai đoạn rất quan trọng vì kỹ thuật chế biến và tồn trữ bột chua có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng bánh mì làm ra. Trong các phương pháp sản xuất, lên men tự nhiên là cách làm phổ biến và thân thiện với môi trường nhất. Trong đó, quá trình lên men của bột chua sẽ được các loại vi sinh vật tự nhiên từ trong nguyên liệu và không khí thực hiện. Sau khi trộn đều các nguyên liệu, hỗn hợp sẽ được lên men tự nhiên. Khi được trộn với nước, một phần gluten và tinh bột trong bột mì bị phân hủy tự nhiên bởi các enzyme trong bột tạo ra đường và amino acid. Sau đó, các vi sinh vật đã rơi vào một cách tự nhiên sẽ bắt đầu sự trao đổi chất. Quá trình phát triển của chúng làm hỗn hợp có mùi chua, tạo vị chua tươi. Tiếp theo, hỗn hợp được bổ sung thêm bột mì và nước để phát triển, tạo được môi trường cân bằng với vị chua cơ bản. Các vi sinh vật có điều kiện phát triển thuận lợi sẽ tạo hệ vi sinh vật cộng sinh, gồm nấm men và vi khuẩn acid lactic (LAB). Để được sử dụng, bột chua phải đạt các tiêu chuẩn: không chứa vi sinh vật gây độc, có lượng tế bào sống tối đa và các vi sinh vật phải hoạt động dưới điều kiện chế biến. Mật độ tế bào trong bột chua đạt khoảng 108 CFU/g (De Vuyst và Neysens, 2005). Giai đoạn sử dụng bột chua làm bánh mì Đầu tiên cần trộn bột chua với bột mì , muối và nước. Tùy vào công thức mà có thể bổ sung nấm men bánh mì và một số nguyên liệu khác như mật ong, đường, trái cây,... Hỗn hợp có được gọi là bột nhào vì chúng sẽ được nhào để tạo độ dẻo đàn hồi cho bột. Nhào bột cũng là một quá trình quan trọng cho hầu hết các loại bánh vì ảnh hưởng đến lượng gluten, tạo kết cấu cho sản phẩm bánh mì. Bột nhào được ủ trong một thời gian nhất định để quá trình lên men diễn ra. Những loại bánh mì bột chua không có bổ sung nấm men sẽ cần một thời gian ủ lâu hơn. Sau khi lên men, bột nhào sẽ nở và phình to ra, tạo nên một hỗn hợp mịn và ẩm. Nướng lên sẽ cho ra bánh mì với lớp vỏ cứng giòn có mùi vàng nâu nhạt, ruột bánh dai và mùi vị thơm ngon. Nhờ các hợp chất được tạo ra trong quá trình lên men bột chua đã làm cho bánh mì bột chua có lớp vỏ giòn và có màu vàng nâu hơn so với bánh mì thường. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 5 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT 2.1.3. Các nguyên liệu để làm bánh mì bột chua Nguyên liệu làm bánh mì bột chua khá đa dạng. Các nguyên liệu cơ bản của một ổ bánh mì bột chua gồm có: bột mì, nước và muối. Tùy thuộc vào từng công thức mà sẽ được bổ sung nhiều loại nguyên liệu khác nhau, có thể là bơ, đường, mật ong, trái cây,…. Bột mì Theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 4359:1996, bột mì là sản phẩm được chế biến từ hạt lúa mì thông thường Triticum aestivum L. hoặc từ hạt lúa mì bông mập Triticum aestivum Host, hoặc hỗn hợp của chúng. Lúa mì sau khi làm sạch tạp chất sẽ được gia ẩm và ủ ẩm trước khi được nghiền và xay mịn. Trong quá trình xay nghiền, vỏ cám và phôi của lúa mì được tách ra, phần nội nhũ sẽ được nghiền nhỏ tới độ mịn thích hợp. Tùy vào loại bột mì thành phẩm mà có thể phối trộn thêm một số chất ở giai đoạn kế tiếp. Kết thúc quá trình, bột mì sẽ được đóng bao thành phẩm. Tùy theo tỷ lệ xay xát và hàm lượng tro mà bột mì được chia thành: bột thượng hạng, bột loại I, bột loại II, bột loại III. Theo công dụng, bột mì cũng được phân chia thành: − Bột mì thường: Chứa nhiều gluten để bánh nở tốt nhưng vẫn giữ được hình dạng sau khi nướng. − Bột mì đa dụng: Có lượng gluten cao, thích hợp để làm hầu hết các loại bánh. − Bột bánh gato hay bánh kem: Chứa ít gluten, tạo độ mềm cho bánh. − Bột bánh ngọt: Có hàm lượng gluten cao hơn bột làm bánh gato nhưng không nhiều bằng bột mì thường hoặc bột mì đa dụng. − Bột bánh bao: Có màu trắng, được xay từ phần lõi của hạt lúa mì. − Bột mì Durum: Chủ yếu để làm các loại mì sợi nên có lượng gluten cao nhất. Theo TCVN 4359:1996, bột mì thương phẩm cần đạt được các yêu cầu về: − Độ tro theo phương pháp Codex Alimentarius. − Độ acid của các acid béo không quá 50 mg KOH cần để trung hòa acid béo tự do trong 100 g bột tính theo chất khô. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 6 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT − Hàm lượng protein (N x 5,7) không thấp hơn 7,0 % tính theo chất khô. − Độ ẩm của sản phẩm không vượt quá 15,5 %. − Về cỡ hạt, cần ít nhất 98% lượng bột lọt qua rây kích thước lỗ 212 mμ (N–70). − Không được phép có kim loại nặng với số lượng gây nguy hiểm cho con người. − Dư lượng chất trừ sinh vật phải tuân thủ giới hạn tối đa cho phép theo qui định. Thành phần dinh dưỡng của 1 cốc bột mì (125 g) gồm có 87% carbohydrate, 2% fat và 11% protein. Bột mì còn chứa các vitamin như vitamin E, vitamin K, thiamin, niacin, vitamin B6, B12, folate,… Đây cũng là một nguồn cung cấp khoáng gồm calcium, ion, magnesium, phosphorus, potassium, sodium, zinc, copper, manganses và selenium (CondéNet, http://nutritiondata.self.com/facts/cereal–grains–and–pasta/5821/2, ngày 05/10/2013). Muối Muối là một gia vị lâu đời và quan trọng nhất. Vị của muối được xem là một trong những vị cơ bản. Đây cũng là chất bảo quản thực phẩm được sử dụng từ lâu. Thành phần chủ yếu trong muối là chất vô cơ có công thức hóa học là NaCl, một phần KCl và các khoáng chất khác. Muối ăn hiện nay chúng ta đạng sử dụng có nhiều dạng khác nhau: muối thô (như muối biển), muối tinh (muối hột) và muối iot. Chúng đều có dạng tinh thể, màu trắng hơi ngả hồng hoặc xám tùy thuộc vào lượng khoáng chất bên trong. Muối thô hiện ít được sử dụng. Muối ăn ngày nay thường sử dụng là muối tinh có thành phần chủ yếu là NaCl nguyên chất (≥ 95%). Hiện nay, muối cũng được bổ sung thêm chất chống ẩm và iot dưới dạng KI để phòng ngừa các bệnh có liên quan đến việc thiếu hụt iot của cơ thể như bệnh bưới cổ, bệnh đần và chứng phù niêm (CondéNet, http://nutritiondata.self.com/facts/spices–and–herbs/216/2, ngày 05/10/2013). Muối ăn chiếm vị trí quan trọng trong việc duy trì sự sống của mọi cơ thể sống nhờ giúp cân bằng độ chứa nước trong cơ thể. Biểu hiện thèm muối có thể phát sinh từ việc thiếu hụt khoáng chất vi lượng cũng như do thiếu NaCl trong cơ thể. Tuy nhiên, nếu sử dụng quá nhiều muối cũng dẫn đến nguy cơ cao mắc các bệnh như cao huyết áp (Salt Institute, http://www.saltinstitute.org/, ngày 05/10/2013). Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 7 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 Trường ĐHCT 2.2. Hệ vi sinh vật trong bột chua 2.2.1. Các vi sinh vật có mặt trong bột chua Hệ vi sinh vật trong bột chua gồm hai thành phần chính là LAB và nấm men. Mật độ tương ứng để tạo độ chua và làm nở bột là khoảng 108 – 109 CFU/g LAB hoạt tính và 106 – 107 CFU/g nấm men (Henryk, 2012). LAB được chia thành hai nhóm chính gồm LAB đồng hình – homofermentative LAB (HO LAB) và LAB dị hình – heterofermentative LAB (HE LAB). Trong thực phẩm lên men acid lactic, HO LAB thường phổ biến hơn. Nhưng trong bột chua, nhóm phổ biến và giữ vai trò quan trọng hơn là HE LAB. Sự khác biệt giữa hai nhóm sẽ được giải thích sau. Các vi sinh vật chịu ảnh hưởng từ nhiều nhân tố bên trong như nhiệt độ lên men và thế oxy hóa khử của hỗn hợp (De Vuyst và Neysens, 2005). Ngoài ra, các yếu tố từ bên ngoài như tỉ lệ dinh dưỡng và các vi sinh vật trong nguyên liệu cũng có ảnh hưởng khá lớn đến chúng. Việc chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố giúp chọn lọc các vi sinh vật bên trong và ngăn cản sự xuất hiện của các vi sinh vật nhiễm từ môi trường chế biến hoặc nguyên liệu. Bột chua là môi trường thích hợp cho sự phát triển tự phát đặc trưng của LAB do có nhiều carbohydrates và pH đầu khá thấp khoảng 5,0 – 6,2. Điều này giải thích được tỉ lệ áp đảo 100:1 giữa LAB và nấm men trong bột chua (Dioksz và Ambroziak, 2008). Việc sử dụng những phương pháp lên men khác nhau đã tạo nên sự đa dạng cho hệ LAB bột chua. Hiện đã tìm thấy khoảng 50 loài LAB khác nhau. Nhìn chung, Lactobacillus có mặt thường xuyên hơn các loài Leuconostoc, Weissella, và Pediococcus. Theo De Vuyst và Neysens (2005), một số LAB bột chua điển hình như Lactobacillus sanfranciscensis, Lb. pontis, Lb. panis, Lb. plantarum, Lb. paralimentarius, Lb. frumenti và Lb. mindensis. Có hơn 20 loài nấm men được tìm thấy trong bột chua. Theo Vernocchi et al. (2004), những loài thường xuất hiện trong hệ vi sinh vật này gồm có Saccharomyces exiguous, Candida humilis và Issatchenkia orientalis (Candida krusei). Saccharomyces cerevisiae chỉ xuất hiện trong một số mẫu bột chua chủ yếu nhờ chúng được sử dụng nhiều trong môi trường làm bánh. Tuy nhiên, vẫn còn tồn tại nhiều loại loài nấm men khác đã được phân lập từ bột chua. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 8 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - Năm 2013 a. Trường ĐHCT b. Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum c. d. Saccharomyces exiguous Candida humilis Hình 3. Hình ảnh một số loài vi sinh vật hiện diện trong bột chua (*Nguồn: a và b: Department of Viticulture and Enology, University of California,http://enologyaccess.org/EA2/index.php, ngày 23/11/2013; c và d: The National Collection of Yeast Cultures, http://www.ncyc.co.uk/, ngày 12/11/2013) Lượng vi sinh vật trong nguyên liệu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến hệ vi sinh bột chua. Theo Rollán et al. (2010), ngũ cốc có chứa 104 – 106 CFU/g vi sinh vật bên trong. Đa số vi khuẩn hiện diện là vi khuẩn ưa ấm, Gram âm hiếu khí (Pseudomonas) và kị khí không bắt buột (Enterobacteriaceae). Ngoài ra, còn có sự tồn tại của một số vi sinh vật không mong muốn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,... Các loại nấm men đã được phát hiện trong bột gồm Candida, Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora, Trichosporon, Saccharomyces và Sporobolomyces. Đặc biệt Saccharomyces cerevisiae không tìm thấy trong các nguyên vật liệu, sự xuất hiện của chúng trong một số mẫu bột là do sự tồn tại của chúng trong không khí tại các tiệm bánh. Ngoài ra, còn tìm thấy được một số loại nấm mốc với mật độ khoảng 3x104 CFU/g, gồm Alternaria, Cladosporium, Drechslera, Fusarium, Helminthosporium, Ulocladium, Aspergillus và Penicillium. Chuyên ngành Công nghệ sinh học Tiên tiến 9 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học