Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao

  • Số trang: 80 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 10 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ CA CAO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. HUỲNH XUÂN PHONG HUỲNH THỊ HOÀNG ANH MSSV: 3113697 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. HUỲNH XUÂN PHONG HUỲNH THỊ HOÀNG ANH XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này, ngoài sự cố gắng của chính bản thân tôi, còn có sự đóng góp rất quan trọng của nhiều người. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến: Cô Ngô Thị Phương Dung và thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang – là cố vấn học tập, người đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học đại học. Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Bùi Hoàng Đăng Long - cán bộ phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm, quý Thầy Cô và anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt đề tài luận văn. Xin được gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả các quý Thầy Cô đã tận tình truyền dạy cho tôi kiến thức hữu ích để phục vụ đề tài. Xin chân thành cảm ơn các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài. Tôi xin kính chúc đến quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe, công tác tốt. Huỳnh Thị Hoàng Anh Chuyên ngành Vi Sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ TÓM TẮT Acid acetic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, acid acetic là acid hữu cơ được sử dụng phổ biến trong điều vị và chế biến thực phẩm. Vi khuẩn acid acetic có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men, trong đó lên men giấm là được sử dụng rộng rãi nhất. Đề tài đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn acid acetic (AAB) từ 14 mẫu là các thành phần khác nhau của ca cao được thu thập ở Cần Thơ và Bến Tre. Phân loại thông qua khả năng oxy hóa acetate cho thấy có 17 chủng thuộc giống Acetobacter và 13 chủng thuộc giống Gluconobacter. Thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường có 0,01% bromocresol green sơ tuyển được 17 chủng AAB (CL1, CL2, CF1, CF2, CV1, C3-1, C3-3, C4-2, C6-1, C6-2, CK2, B2-2, B2-3, B3-2, B4-1, BK1 và BK3) có đường kính vòng sáng từ 20 mm trở lên trong 48 giờ ủ ở 30 oC. Kết quả thử khả năng phát triển ở các nồng độ acid khác nhau cho thấy hai chủng B23 và B3-2 phát triển ở 3% acid aceric; B2-2 phát triển ở 1,5% acid acetic; các chủng CL1, CF2, C4-2, C6-1 và BK1 có thể phát triển ở 1% acid acetic; các chủng còn lại chỉ phát triển ở 0,5% acid acetic. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt trên môi trường YPGD chứa 4% ethanol cho thấy đa số (10 chủng) các chủng phát triển được ở 45oC; một số chủng (CL2, CF2 và CK2) phát triển ở 43oC; các chủng B2-3, B3-2 và B4-1 phát triển ở 41oC; chủng B2-2 chỉ phát triển được ở 39oC. Tuyển chọn được 2 chủng AAB chịu nhiệt có khả năng lên men acid acetic là B2-3 và B3-2 với nồng độ acid acetic đạt được ở ngày lên men thứ 5 lần lượt là 4,44% và 5,08% ở 39oC trong khi các chủng còn lại chỉ lên men ở 30oC. Từ khóa: acid acetic, chịu acid, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acetic. Chuyên ngành Vi Sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... LỜI CẢM TẠ.................................................................................................................. i TÓM TẮT ......................................................................................................................ii MỤC LỤC .....................................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1 Sơ lược về ca cao ..................................................................................................... 3 2.1.1. Cây ca cao...................................................................................................... 3 2.1.2. Các giống ca cao trên thế giới ....................................................................... 4 2.1.3. Công dụng của ca cao ................................................................................... 5 2.1.4. Sơ lược về quy trình lên men ca cao .............................................................. 6 2.1.5. Một số vi sinh vật có trong hạt ca cao lên men ............................................. 8 2.2 Giới thiệu về acid acetic ....................................................................................... 11 2.2.1 Giới thiệu chung .......................................................................................... 11 2.2.2. Phương pháp sản xuất ................................................................................. 11 2.2.3. Ứng dụng...................................................................................................... 12 2.3 Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật ................................................ 14 2.3.1 Bản chất của quá trình lên men ................................................................... 14 2.3.2. Quá trình lên men acid acetic ...................................................................... 15 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .............................................. 15 2.4 Vi khuẩn acid acetic .............................................................................................. 16 2.4.1. Giới thiệu vi khuẩn acid acetic .................................................................... 16 2.4.2. Phân loại ...................................................................................................... 17 2.4.3. Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic ................................................ 19 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................. 21 3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 21 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ 3.1.1. Thời gian và địa điểm .................................................................................. 21 3.1.2. Nguyên liệu .................................................................................................. 21 3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22 3.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic .................................................... 22 3.2.2. Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic ......... 22 3.2.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ......................... 23 3.2.4. Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau ........... 23 3.2.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .............................. 23 3.2.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh.......................................................................................................................24 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25 4.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic .............................................. 25 4.2 Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic .............. 26 4.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic ............................................................... 30 4.4 Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau ................ 33 4.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .................................... 35 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh ............................................................................................................................. 37 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 44 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 44 5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. PL1 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Sản lượng hạt ca cao trên thế giới (nghìn tấn) ...................................................4 Bảng 2. Những đặc tính khác nhau giữa giống Criollo, Forastero và Trinitario ............5 Bảng 3. Sự thay đổi các thành phần hạt Forastero sau quá trình ủ và phơi ....................8 Bảng 4. Nguồn nguyên liệu và địa điểm thu mẫu .........................................................21 Bảng 5. Số lượng các chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ ca cao ...........................26 Bảng 6. Kết quả định danh sơ bộ các chủng AAB ........................................................29 Bảng 7. Đường kính vòng sáng của các chủng AAB ....................................................31 Bảng 8. Đặc điểm của 17 chủng AAB được tuyển chọn ..............................................32 Bảng 9. Kết quả thử nghiệm khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau của 17 chủng AAB ........................................................................................................34 Bảng 10. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của 17 chủng AAB .......................36 Bảng PL1. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 30oC .... PL5 Bảng PL2. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 37oC .... PL9 Bảng PL3. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 38oC .. PL14 Bảng PL4. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 39oC .. PL18 Bảng PL5. Mô tả khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn của các chủng AAB ................ PL22 Bảng PL6. Bảng thống kê số liệu về hàm lượng acid của 8 chủng AAB trong 7 ngày ở 30oC, 37oC, 38oC, 39oC ............................................................................................ PL23 Bảng PL7. Bảng thống kê số liệu về sự phát triển (OD 550nm)của 8 chủng AAB trong 7 ngày ở 30oC, 37oC, 38oC, 39oC ............................................................................. PL24 Chuyên ngành Vi Sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cây và quả ca cao ...............................................................................................3 Hình 2. Cấu trúc hóa học của acid acetic ......................................................................11 Hình 3. Vi khuẩn Acetobacter pasteurianus .................................................................18 Hình 4. Vi khuẩn Acetobacter aceti ..............................................................................18 Hình 5. Vi khuẩn Acetobacter xylinum .........................................................................19 Hình 6. Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường (a), môi trường đối chứng có CaCO3 (b) và không có CaCO3 (c) ............................................................................................25 Hình 7. Một số chủng AAB tạo vòng sáng halo trên môi trường. ................................25 Hình 8. Hình dạng vi khuẩn và hình nhuộm Gram trên kính hiển vi ............................27 ở độ phóng đại 100X của một số chủng AAB ..............................................................27 Hình 9: Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 48 giờ. Màu vàng (a) là Gluconobacter, màu xanh lục (b) là Acetobacter, màu xanh lam (c) là môi trường đối chứng .............................................................................................................................27 Hình 10. Sự biến đổi màu chỉ thị của một số vòng AAB ở 24 giờ (a) ..........................30 và môi tường đối chứng (b) ...........................................................................................30 Hình 11. Thử khả năng phát triển của 6 chủng AAB ở các nồng độ acid acetic khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3,0% .............................................................33 Hình 12. Thử khả năng chịu nhiệt của 6 chủng AAB ở 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC ..........................................................................................................................35 Hình 13. Hàm lượng acid của 8 chủng AAB ở 30oC ....................................................37 Hình 14. Sự phát triển của 8 chủng AAB ở 30oC .........................................................37 Hình 15. Hàm lượng acid của 8 chủng AAB ở 37oC ....................................................38 Hình 16. Sự phát triển của 8 chủng AAB ở 37oC .........................................................39 Hình 17. Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38oC ....................................................40 Hình 18. Sự phát triển của 4 chủng AAB ở 38oC .........................................................41 Hình 19. Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC ....................................................41 Hình 20. Sự phát triển của 4 chủng AAB ở 39oC .........................................................42 Chuyên ngành Vi Sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AAB Vi khuẩn acid acetic v/v Thể tích/Thể tích w/v Khối lượng/Thể tích EEA Etylen glycol monoetyl eter acetate EBA Etylen glycol mono-butyl eter acetate PMA Propylen glycol mono-metyl eter acetate TPA Acid terephthalic PET Polyetylen terephthalate ADH Alcohol dehydrogenase ALDH Aldehyde-dehydrogenase NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate YPGD môi trường gồm Yeast extract, Pepton, Glycerol, D-glucose PL Phụ lục Chuyên ngành Vi Sinh vật học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,… nên nhu cầu sử dụng ngày càng tăng, đặc biệt là acid acetic. Acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như: giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconate (Matsushita, 2009),… Ở nước ta việc sản xuất acid acetic chủ yếu chỉ bằng phương pháp truyền thống với quy mô nhỏ phục vụ cho công nghiệp thực phẩm. Với quy mô này thì không thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng acid acetic ngày càng tăng ở nước ta trong các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp chế biến mủ cao su. Lên men giấm (vinegar) hay lên men acid acetic đã được biết đến từ nhiều thế kỷ trước bằng quá trình lên men tự nhiên từ dung dịch có chứa ethanol. Các vi khuẩn lên men giấm đầu tiên được phát hiện là Acetobacter aceti (Beijerinck năm 1898) và Gluconobacter suboxydans (Kluyver và de Leeuw năm 1924) (Saeki et al., 1997). Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn. Do thành phần chủ yếu của giấm là acid acetic nên có khả năng diệt khuẩn cao, ngoài ra còn chứa một số acid hữu cơ khác như acid lactic, acid malic, acid citric,… nên có thể phòng trị hiệu quả một số bệnh như viêm gan, xơ gan, các bệnh về đường hô hấp, đường ruột, giúp tiêu hóa tốt,… Giấm không chỉ giúp làm món ăn thêm ngon mà còn giữ thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm được giữ nguyên vẹn, ngoài ra, giấm còn có tác dụng tăng tính đàn hồi, làm chậm quá trình lão hóa, Mới đây, các nhà khoa học Venezuela đã phát hiện thấy acid acetic có khả năng chống lại vi trùng lao và các vi khẩn kháng thuốc khác (baomoi.com, 02/03/2014). Giấm còn được dùng để sản xuất chất màu, chất thơm, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo,… (Lương Đức Phẩm, 1998). Có nhiều loại giấm được sản xuất trên thế giới tùy thuộc vào loại nguyên liệu, công nghệ và mục đích sử dụng. Acid acetic được sản xuất theo cả hai phương pháp: phương pháp sinh học (chiếm khoảng 10% sản lượng thế giới) và phương pháp tổng hợp (chiếm khoảng 75%). Ngày nay, việc sản xuất acid acetic bằng phương pháp sinh học thì đang được chú trọng. Chủ yếu là bằng phương pháp lên men. Các sản phẩm lên men acid acetic Chuyên ngành Vi Sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ này nhờ vào một nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid Bacteria, AAB). Trong những năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu làm xã hội có một số thách thức nghiêm trọng trong việc lên men với quy mô công nghiệp vì những hệ thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều năng lượng để giữ ở nhiệt độ tối ưu. Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều sự quan tâm vì nó mang lại lợi nhuận rất lớn cho xã hội. Qua đó có thể tiến tới quy trình sản xuất giấm và các sản phẩm lên men từ AAB ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất, an toàn cho sức khỏe đồng thời giảm giá thành cho người tiêu dùng. Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng AAB cũng góp phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học, đặc biệt là nguồn vi sinh vật. Từ đó có thể định danh sơ bộ các chủng AAB có đặt tính tốt và tiến tới việc sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất. Ở Việt Nam, do điều kiện khí hậu phù hợp cho việc trồng ca cao xen canh với các loại cây khác, nên diện tích ca cao ngày mở rộng. Quá trình lên men ca cao có nhiệt độ lên men lên đến 45-50oC, là nguồn nguyên liệu có thể phân lập các chủng AAB có khả năng chịu nhiệt cao. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao có khả năng lên men acetic. Nội dung thực hiện: - Phân lập vi khuẩn acid acetic từ ca cao. - Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn acid acetic. - Thử khả năng chịu nhiệt và chịu acid của các chủng vi khuẩn acid acetic. - Thử hoạt tính lên men của acid acetic ở nhiệt độ cao. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về ca cao 2.1.1. Cây ca cao Hình 1. Cây và quả ca cao (*Nguồn: Hermann A. Juren Pohlan và Valentin Díaz Pérez,2011) Cây ca cao (Theobroma cacao) có nguồn gốc từ rừng rậm ở vùng Amazon (Nam Mỹ), chúng thường phát triển ở nơi có bóng râm và độ ẩm cao nhưng các giống ca cao hoang dại cũng thấy xuất hiện từ Mexico đến Peru. Ca cao được trồng trong một thời gian dài bởi người Mayas và người Aztec, sau đó chúng được đưa đến Châu Âu (Wood et al., 2001). Năm 1753, ca cao được phân loại và đặt tên bởi nhà thực vật học người Thụy Điển là Carolus Linnaeus với tên khoa học là Theobroma cacao, thuộc họ Sterculiaceae. Theo tiếng La tinh, từ “Theobroma” có nghĩa là “ thực phẩm của thần linh”. Ca cao chỉ phát triển giới hạn ở một số vùng địa lý giới hạn, ở khoảng vĩ độ 20 về cực Bắc và Nam tính từ đường xích đạo. Đặc biệt là Tây Phi (chiếm khoảng 72% tổng sản lượng ca cao trên thế giới), trong đó chủ yếu là ở các nước: Cote d’Ivoire, Ghana và Nigeria. Tiếp theo là khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm khoảng 15%). Cuối cùng là khu vực Trung và Nam Mỹ (chiếm khoảng 13%) (Phạm Hồng Đức Phước, 2006). Tổng sản lượng ca cao hàng năm đạt gần 3,5 triệu tấn (ICCO, 2007). Cây ca cao có ưu thế vượt trội là có thể trồng xen với nhiều loại cây như dừa, hồ điều, cà phê, chuối, đồng thời có khả năng chịu hạn và chống xói mòn cao nên rất thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên của Việt Nam. Do đó, từ những năm 1974, người Pháp đã cử chuyên gia sang trồng Chuyên ngành Vi Sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ thử nghiệm. Hiện nay, do việc trồng xen canh cây ca cao với các loại cây khác đem lại hiệu quả kinh tế cao nên diện tích trồng ca cao phát triển rất nhanh. Theo báo cáo của Ban Điều phối Phát triển ca cao Việt Nam (VCC), tính đến tháng 6/2011 tổng diện tích ca cao cả nước đạt khoảng 20.589 ha, tăng 4.404 ha so với năm 2010. Hiện tại, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam đã đề ra mục tiêu đến năm 2015 diện tích ca cao cả nước sẽ đạt 60.000 ha ca cao và đến năm 2020 sẽ đạt 80.000 ha. Sản lượng ca cao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015 và 108.000 tấn vào năm 2020. Bảng 1. Sản lượng hạt ca cao trên thế giới (nghìn tấn) 2011/12 2012/13 (ước lượng) 2013/14 (dự đoán) Châu Phi 2919 2820 2942 Cameroon 207 225 210 Côte d'Ivoire 1486 1449 1550 Ghana 879 835 870 Nigeria 235 225 220 Các nước Châu Phi khác 113 86 92 Châu Mỹ 655 626 666 Brazil 220 185 200 Ecuador 198 192 210 Các nước Châu Mỹ khác 237 249 256 Châu Á và Châu Đại Dương 511 496 496 Indonesia 440 420 410 Papua New Guinea 39 36 110 Nước khác 33 40 46 4.085 3.942 4.104 Quốc gia Tổng sản lượng thế giới (*Nguồn: ICCO Quarterly Bulletin of Cocoa Statistics, Vol. XL, No. 1, Cocoa year 2013/14) 2.1.2. Các giống ca cao trên thế giới Hiện nay, ca cao được chia ra làm 3 nhóm lớn: Criollo, Forastero và Trinitario. Các đặc điểm chính của 3 nhóm được chia ở Bảng 2. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ Bảng 2. Những đặc tính khác nhau giữa giống Criollo, Forastero và Trinitario Các đặc điểm chính Dạng quả Vỏ quả Cấu trúc Màu sắc Hoa Hạt Số hạt/quả Tiết diện hạt Màu diệp tử Criollo Forastero Trinitario Quả dài Quả tròn, Hình bầu dục Quả dài Mềm Đỏ (cũng có quả màu xanh) Cứng Xanh (chín thì vàng) Nhụy hồng nhạt Nhụy màu tím 20-30 Gần tròn Trắng ngà hoặc tím rất nhạt >30 Dẹp Tím, tím đậm >30 Dẹp Thay đổi, đôi khi có hạt màu trắng Kém Kém Mạnh Tốt Trung bình Trung bình Thấp Cao Trung bình 1,5 93,5 5,0 Đặc điểm nông học Khả năng sinh trưởng Khả năng kháng sâu bệnh Chất béo % tổng sản lượng Hầu hết cứng Thay đổi (*Nguồn: Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tài Sum, 1996; Hà Thanh Toàn et al., 2008) 2.1.3. Công dụng của ca cao a. Hạt ca cao Bộ phận chính được sử dụng của cây ca cao là hạt (bean). Hạt ca cao sau khi rang được xay thành bột nhão ca cao. Khi ép bột nhão ta tách được bơ và bánh dầu ca cao. Xay nhuyễn bánh dầu ca cao cho ra bột ca cao (Phạm Hồng Đức Phước, 2006). Bột nhão, bơ và bột ca cao là nguyên liệu chính cho công nghiệp bánh kẹo thực phẩm. Chocolate là sự pha trộn giữa bột nhão, bơ, đường và các nguyên liệu khác tùy theo công thức riêng của mỗi nhà sản xuất (Phạm Hồng Đức Phước, 2006). b. Các bộ phận khác của ca cao Chuyên ngành Vi Sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ Vỏ quả ca cao chứa 3-4% kali trên trọng lượng chất khô, là nguồn phân bón giàu kali. Ngoài ra, vỏ quả ca cao còn được phơi khô, xay thành bột trộn vào thức ăn hoặc vo viên. Lớp cơm nhầy bao quanh hạt ca cao (cocoa pulp) có thể dùng làm nước sinh tố (cocoa juice), mứt đông (cocoa jam), giấm (vinegar), hoặc cô đặc làm nước cốt trái cây (liquor of cocoa juice) (Schwan et al., 2004). Lá ca cao còn là nguồn thức ăn tốt cho dê, bò và thỏ. Các hạt ca cao có cơ quan gọi là thai tòa (lõi quả). Khi tách hạt ca cao để lên men, thai tòa được loại bỏ là nguồn thức cho cá và heo. Dịch thu từ quá trình lên men được dùng để chế biến rượu ca cao. Ngoài ra dịch cũng có thể sử dụng như nguyên liệu thay thế thạch dừa trong kỹ thuật sản xuất thạch dừa (Phạm Hồng Đức Phước, 2006). 2.1.4. Sơ lược về quy trình lên men ca cao a. Thu hoạch Cây ca cao trồng qua năm thứ 3 thì bắt đầu cho quả. Thời gian đậu quả cho đến khi quả chín mất khoảng 2-3 tháng. Khi chín thì vỏ ca cao đổi màu. Các quả có màu xanh lục khi chín đổi sang màu vàng tươi. Các quả có màu ửng đỏ khi chín có màu cam sậm. Các quả có màu tím lợt khi chín có màu tím đậm. Lúc thu hoạch chỉ nên hái những quả có dấu hiệu chín, không nên hái những quả chưa chín vì các loại này có hàm lượng trong cơm thấp, khi ủ khó lên men nên phẩm chất kém và năng suất hạt thấp. Tuy nhiên, không nên để quả quá lâu trên cây vì hạt sẽ nảy mầm ngay trong quả, làm phẩm chất hạt giảm sút. Có thể hái quả bằng cách dùng dao bén cắt phần cuống. Sau đó bóc vỏ ca cao để lấy hạt. Người ta lấy dao bổ quả ca cao theo chiều dọc và dùng tay để lấy hạt. Không nên dùng dao để lấy hạt vì rất dễ làm dập hạt, làm giảm giá trị của sản phẩm. b. Lên men (ủ) ca cao Quá trình lên men (ủ) có ảnh hưởng lớn đến chất lượng hạt ca cao cũng như những sản phẩm làm từ ca cao. Đây là khâu quan trọng nhất trong quá trình sơ chế ca cao. Quá trình lên men có thể tiến hành bằng nhiều phương pháp như ủ thúng (cần xé), ủ đống và đậy bằng lá chuối và ủ thùng (CARD 013/VIE05, 2008). Chuyên ngành Vi Sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ Quá trình ủ phải được thực hiện ngay trong 24 giờ. Trước khi đem ủ phải phân loại hạt theo kích thước để hạt dễ lên men hơn. Quá trình ủ nhằm mục đích loại bỏ hết phần cơm (pulp) bao bọc xung quanh hạt ca cao và làm chết mầm hạt (radicle) (Schwan et al., 2004) hay diệt chất phôi nha để hạt không còn nảy mầm được nữa (Nguyễn Minh Thủy, 2000). Quá trình lên men cũng góp phần làm giảm vị đắng (bitterness), chát (astringency) và tạo các tiền chất của hương ca cao (flavour precursor) do khởi đầu cho những thay đổi sinh hóa học trong nội mô phôi nhủ (Sandra et al., 2007). Sự lên men của hạt thường xảy ra theo hai quá trình: - Quá trình thứ nhất bao gồm sự phân giải yếm khí các chất nhầy chứa đường, bột của cùi bao bọc xung quanh hạt. - Quá trình thứ hai là sự lên men bên trong bao gồm các loại phản ứng phức tạp, các tử diệp co rút lại từ áo hạt và biến đổi màu sắc. Trong quá trình ủ cần lưu ý, đối với giống Forastero và Trinitario thường lên men trong khoảng 3-7 ngày, còn đối với giống Criollo chỉ cần ủ 2-3 ngày. c. Phơi nắng hoặc sấy khô  Phơi nắng, phơi tự nhiên Sau quá trình lên men, phơi sấy cũng là bước quan trọng trong chế biến ca cao. Quá trình này, cùng với quá trình ủ nhằm mục đích khử nước, làm gia tăng các phản ứng giữa các thành phần trong hạt và sự thủy phân enzyme (Nguyễn Minh Thủy, 2000). Phương pháp đơn giản nhất là trải hạt ca cao ra thành những lớp mỏng, phơi trực tiếp trên sàn bê tông hoặc gỗ. Thời gian phơi dưới nắng mặt trời khoảng 2-3 ngày, 30 phút đảo đều một lần. Các thành phần của hạt ca cao có sự thay đổi đáng kể sau quá trình ủ và phơi, được thể hiện ở Bảng 3. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ Bảng 3. Sự thay đổi các thành phần hạt Forastero sau quá trình ủ và phơi Thành phần Hạt trước khi ủ (%) Hạt sau khi ủ (%) Nước 32-36 5- 7 Đạm toàn phần 5-7 11-13 Lipid 31-33 46- 48 Đường khử 0,3-0,5 0,1- 0,2 Sucrose 1,8-2,1 0.0 Tinh bột 9-10 7- 9 Sợi thô 10-12 19- 21 Acid acetic 0,0 0,8- 1,0 (*Nguồn: Nguyễn Văn Uyển và Tài Sum, 1996)  Sấy khô Thực hiện quá trình sấy khi điều kiện phơi không thích hợp như ít nắng, mưa kéo dài hay không có sân phơi. Thời gian sấy khoảng 8 giờ ở nhiệt độ 50oC. Cứ một giờ đảo đều một lần. Hạt đạt yêu cầu khô là khi hạt có độ ẩm từ 8% trở xuống. 2.1.5. Một số vi sinh vật có trong hạt ca cao lên men Chất nhầy bao quanh hạt ca cao là môi trường giàu dinh dưỡng cho vi sinh vật. Chất nhầy chiếm khoảng 82-87% nước, 10-15% đường, 2-3% pentose, 1-3% acid citric và 1-1,5% pectin. Ngoài ra còn có protein, amino acid, vitamin (nhiều nhất là vitamin C) và chất khoáng. Ở các vùng khác nhau như Ivory Coast, Nigeria, Malaysia có sự khác biệt về hàm lượng nước, citrite, hemicellulose, lignin, peptin trong thịt quả ca cao (Schwan, 2004). Trong quá trình lên men, các loài vi sinh vật sẽ làm tăng nhiệt độ khối lên men, làm giảm pH của phôi nhũ từ 6,5 xuống còn 4,5; lượng acid acetic có thể đạt 2% và lượng acid lactic tăng từ 0,01 đến 0,22%. Một số vi sinh vật trong lên men hạt ca cao: nấm men, vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn acid acetic, nấm mốc và một số vi sinh vật khác. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014  Trường Đại Học Cần Thơ Nấm men Nấm men là vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men rượu. Trong nấm men có hệ enzyme amylase và enzyme nội bào. Nấm men phát triển tốt nhất ở 15-25oC, trong môi trường acid (pH 3,5-4,5). Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men cần phải thông khí vào môi trường để kích thích nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối. Đến giai đoạn lên men chính, cần tạo điều kiện kỵ khí cho sự hình thành rượu. Vai trò chính của nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao: phân hủy đường, acid citric; sản xuất ethanol, acid hữu cơ, các chất bay hơi, các mùi, enzyme và tạo năng lượng. Đã có 12 loại nấm men được xác định trong quá trình lên men hạt ca cao: Saccheromyces Rhodotorula, cerevisiae, Candida, Kluyveromces, Pichia, Shizo Hansenula, Kloeckera, saccharomyces, Tinillopsis, Saccharomycopsis, Debaryomyces, Hansenniospora. Trong đó chủ yếu là Saccheromyces cerevisia và Kluyveromces.  Vi khuẩn acid lactic Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu (hoặc hình oval) và hình que. Đường kính của các loại cầu khuẩn từ 0,5-1,5 µm. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 µm. Phân loại theo hình dáng tế bào thì cầu khuẩn xếp vào các giống Streptococcus và Leuconostoc, trực khuẩn thuộc giống Lactobacillus. Có hai dạng lên men lactic: đồng hình (điển hình) và dị hình (không điển hình). Vi khuẩn lactic lên men đồng hình nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49-51oC. Vi khuẩn lactic lên men dị hình nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37-38oC. Vi khuẩn lactic hiện diện ngay khi bắt đầu lên men mặc dù nấm men chiếm ưu thế. Hoạt động của nấm men bị ức chế bởi nồng độ cồn cao, pH gia tăng và hiếu khí mạnh. Khi điều kiện phù hợp, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế nhưng chỉ trong thời gian ngắn. Chúng biến đổi đường và một số acid hữu cơ (citric và malic) thành acid lactic và tùy thuộc vào loài Lactobacillus sẽ tạo thành acid acetic, ethanol và CO2. Vai trò của vi khuẩn acid lactic là: sản xuất acid lactic, acid citric cũng như các hợp chất khác và tạo năng lượng,…. Nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau được tìm thấy trong hạt ca cao lên men như: Lactobacillus, Betabacterium, Streptobacterium, Streptococcus,…. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014  Trường Đại Học Cần Thơ Vi khuẩn acid acetic Vi khuẩn acid acetic là các trực khuẩn, không sinh bào tử, gram dương và rất hiếu khí, có thể chuyển động hoặc không. Chúng có tính chịu acid cao, một số vẫn phát triển ở pH 3,2. Nhiệt độ tối thích đối với sự sinh trưởng của các vi khuẩn acid acetic nằm trong khoảng 20-35oC. Các loại vi khuẩn lên men acid acetic xuất hiện rất sớm và bền bỉ đến khi kết thúc quá trình lên men, phát triển sau nấm men và có vai trò trong quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic và quá trình oxy hóa acid acetic thành CO2 và nước, gia tăng nhiệt độ khối hạt lên men. Các loài vi khuẩn acid acetic thường thấy trong ca cao lên men: Acetobacterraner, A. ascendens, A. suboxydans, A. xylinodes, A. orleanense, Gluconobacter oxydans,….  Nấm mốc Nấm mốc ca cao có rất nhiều loại, thường gặp là Aspergillus, cụ thể như: Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus penicilium, Aspergillus fumagatus, Aspergillus tamari,…  Vi sinh vật khác hiện diện trong quá trình lên men Độ acid của khối hạt ca cao nguyên liệu, nhiệt độ lên men và quá trình thủy phân của protein trong phôi nhũ thể hiện cho quá trình chuyển hóa của các vi sinh vật trong quá trình lên men. Để kết thúc sự lên men, số lượng của các bào tử vi khuẩn gia tăng, đặc biệt là Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Streptococcus thermophilus,…. Các chủng vi khuẩn Bacillus được xem là các ảnh hưởng lớn đến sự hình thành các chất hữu cơ bao gồm 2,3-butanediol, pyrazine, acid acetic và acid lactic trong quá trình lên men. Chính điều này gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng của hạt ca cao sau lên men. Trong hạt ca cao lên men, người ta còn phát hiện nhiều loài nấm sợi như: Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus,… Chuyên ngành Vi Sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại Học Cần Thơ 2.2 Giới thiệu về acid acetic 2.2.1 Giới thiệu chung Acid acetic (còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ (acid carboxylic), công thức hóa học là CH3COOH, khối lượng phân tử 60 g/mol. Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic, có tính acid mạnh hơn acid carbonic. Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform; không tan trong CS2. Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và permanganate. Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại. Nó có thể hòa tan không chỉ trong các hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà còn có khả năng hòa tan trong các hợp chất không phân cực, các nguyên tố như lưu huỳnh và iod. Acid acetic có thể ăn mòn các kim loại như sắt, mangan và kẽm sinh ra khí hydro và các muối kim loại tương ứng gọi là các muối acetate. Hình 2. Cấu trúc hóa học của acid acetic (*Nguồn: Ben Mills,2009) 2.2.2. Phương pháp sản xuất Thế kỷ thứ 8, Jabir Ibn Hayyan (Geber) là người đầu tiên cô đặc acid acetic từ giấm bằng cách chưng cất. Thế kỷ thứ 16, nhà giả kim thuật Đức, Andreá Libavius đã mô tả cách chưng cất acid acetic dạng tinh thể được bằng cách chưng cất khô các acetate kim loại nhất định(loại phổ biến nhất là đồng (II) acetate (Cu(CH3COO)2) và ông đã so sánh acid acetic tạo ra bằng phương pháp này với từ giấm. Sự có mặt của nước trong giấm đã làm ảnh hưởng đến tính chất của acid acetic mà các nhà hóa học trong vài thế kỷ đã cho rằng acid acetic dạng tinh thể và acid acetic trong giấm là hai chất khác nhau. Năm 1917 nhà hóa học người Pháp Pierre Adet đã chứng minh rằng chúng là một. Chuyên ngành Vi Sinh vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -