Phân lập và tuyển chọn nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose

  • Số trang: 76 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 40 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phạm Thị Huyền Nhung PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61 HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. VŨ NGUYÊN THÀNH Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2 1.1. Lignocellulose....................................................................................................... 2 1.1.1. Cellulose ............................................................................................................ 4 1.1.2. Hemicellulose .................................................................................................... 7 1.1.3. Lignin ................................................................................................................ 9 1.2. Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) ................................................................. 12 1.2.1. Glycoside hydrolase ........................................................................................ 12 1.2.2. Họ GH 61......................................................................................................... 15 1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc ........................................................................... 16 1.3.1. Định nghĩa ....................................................................................................... 16 1.3.2. Hình thái cấu trúc ........................................................................................... 17 1.3.3. Sinh sản của nấm mốc .................................................................................... 18 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24 2.1. Đối tƣợng ............................................................................................................ 24 2.2. Hóa chất, trang thiết bị máy móc ...................................................................... 24 2.2.1. Hóa chất........................................................................................................... 24 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị máy móc:................................................................. 25 2.3. Thành phần môi trƣờng dùng trong nghiên cứu ............................................. 25 2.3.1. Môi trường Czapeck bột giấy ........................................................................... 25 2.3.2. Môi trường PDA .............................................................................................. 26 2.3.3. Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme ........................................................... 26 2.3.4. Môi trường YM ................................................................................................ 27 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 27 2.4.1. Phương pháp phân lập .................................................................................... 27 2.4.2. Làm sạch giống ................................................................................................ 28 2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào: ............................................................. 28 2.4.4. Tách chiết enzyme............................................................................................ 28 2.4.5. Xác định hoạt tính cellulase (IU) bằng DNS ................................................... 29 2.4.6. Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS ..................................... 30 2.4.7. Định lượng protein theo phương pháp Lowry ................................................. 32 2.4.8. Điện di protein ................................................................................................. 33 2.4.9. Phương pháp finger printing ........................................................................... 35 2.4.10. Phương pháp phân tích D – gluconic acid .................................................... 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 40 3.1. Kết quả phân lập ............................................................................................... 40 3.2. Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase, xylanase bằng phƣơng pháp DNS ........ 41 3.3. Phân tích hoạt tính enzyme cellulase và xylanase trên 3 loại cơ chất carbon khác nhau .................................................................................................................. 44 3.4. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry ................................................ 46 3.5. Phân tích thành phần protein của hệ enzyme .................................................. 47 3.6. Xác định sự có mặt của enzyme GH61 bằng phân tích D – gluconic acid ...... 52 3.7. Phân nhóm dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào và kỹ thuật fingerprinting .. 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 60 MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, các ngành công – nông – lâm nghiệp … cũng phát triển một cách mạnh mẽ. Bên cạnh sự phát triển đó thì lượng chất thải từ các ngành này thải ra môi trường cũng ngày một nhiều, làm ô nhiễm môi trường sống không chỉ của các sinh vật mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới con người. Ngoài những chất thải nhân tạo khó bị phân hủy thì cũng có một số chất thải có nguồn gốc từ sinh vật cũng rất khó bị phân hủy trong điều kiện thường hay bởi các sinh vật thông thường như chintin, lignocellulose, pectin… Trong đó lingocellulose là chủ yếu. Sự tồn đọng của lignocellulose trong môi trường không những gây ô nhiễm môi trường mà còn làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Do đó việc phân giải lignocellulose có vai trò rất quan trọng không chỉ đối với môi trường mà còn đối với các sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3]. Tuy nhiên, do lignocellulose là một chất rất khó bị phân giải trong điều kiện thường, và chỉ có một số ít sinh vật có khả năng phân hủy chúng. Bên cạnh đó, quá trình này đòi hỏi sự tham gia của rất nhiều enzyme khác nhau đặc biệt là các enzyme trong họ Glycoside Hydrolase. Nhằm mục đích tăng năng suất quá trình thủy phân lignocellulose thành các đường đơn, đường đôi từ các phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người và vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), chúng tôi đã thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.1). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và hàm lượng của các polymer này trong thực vật là khác nhau giữa các loài. Ngoài ra, nó còn tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện môi trường. Thành phần của lignocellulose được trình bày ở bảng 1.1 [10]. Hình 1.1: Thành phần lignocellulose 2 Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.4 30 18.9 ban đầu Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [8] 3 Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [10]. 1.1.1. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C6H10O5)n, là một polysaccharide gồm một chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D – glucose nối với nhau bởi liên kết 1,4 β - glucoside [6] [8] . Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiều loại tảo và lớp nấm trứng (Oomycetes). Một số loài vi khuẩn chế tiết cellulose để tạo thành màng sinh học. Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Khoảng 33% khối lượng khô của thực vật là cellulose (sợi bông là 90%, gỗ là 40 -50% và cây gai dầu khô là khoảng 75%) [9] [23] [24]. Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấu trúc cuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và một cấu tạo giống hình que khá cứng, cellulose có cấu trúc mạch thẳng. Sự khác biệt này là do các đơn phân trong cellulose nối với nhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate khác lại là liên kết 1,4 α – glycoside. Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn, bền hơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường [2] [14]. 4 Cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liên kết với nhau bằng liên kết hydro. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường được tìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác, trong khi cellulose vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơn nhiều [23]. Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong vùng kết kinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏng lẻo nên dễ bị tấn công. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình [4]. Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) [4] 5 - Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng và định hướng theo chiều dài sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A, xếp xen kẽ với vùng vô định hình - Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều dài sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glucoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, ba phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 1800 cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β – glucoside) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. Nhiều tính chất của cellulose phụ thuộc vào độ dài chuỗi hoặc mức độ trùng hợp, số lượng các đơn phân glucose tạo nên phân tử polymer. Cellulose từ bột gỗ có độ dài chuỗi điển hình giữa 300 và 1700 đơn phân, bông và sợi thực vật khác cũng như cellulose vi khuẩn có độ dài chuỗi khác nhau, từ 800 đến 10.000 đơn phân [5]. Các phân tử với chiều dài chuỗi rất nhỏ là kết quả từ sự phân hủy cellulose, được gọi là cellodextrin, trái ngược với chuỗi cellulose dài, cellodextrin thường hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ. Một số động vật, đặc biệt là động vật nhai lại và mối, có thể tiêu hóa cellulose với sự giúp đỡ của vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột. Con người có thể tiêu hóa cellulose trong chừng mực nào đó [13], tuy nhiên nó chủ yếu là hoạt động như một chất hỗ trợ tiêu hóa và thường được gọi là "chất xơ". 6 Cellulose dùng trong công nghiệp ngày nay chủ yếu được lấy từ bột giấy và bông. Chúng chủ yếu được sử dụng để sản xuất bìa và giấy, trong một phạm vi nhỏ hơn nó được chuyển thành sản phẩm dẫn xuất như giấy bóng kính và tơ nhân tạo. Chuyển đổi cellulose từ cây trồng nhiên liệu vào nhiên liệu sinh học như ethanol cellulosic đang được nghiên cứu như là một nguồn nhiên liệu thay thế. 1.1.2. Hemicellulose Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25-30% tổng trọng lượng khô gỗ. Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose [12]. Nó thường được tìm thấy trong liên kết với cellulose trong thành tế bào thứ cấp của thực vật, nhưng chúng cũng có mặt trong thành tế bào sơ cấp [19]. Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymer bao gồm các đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, và các nhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic và D – glucuronic. Các phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β – glycoside. Sự khác biệt chính với cellulose là hemicellulose có phân nhánh với chuỗi bên ngắn gồm các loại đường khác nhau; do đó, chúng dễ bị thủy phân hơn so với cellulose [12]. Thành phần chính của hemicellulose trong gỗ cứng là glucuronoxylan và trong gỗ mềm là Glucomannan. Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật thân thảo gồm mạch chính là 1,4 β – D – xylan với nhóm thế 1,2 α – 4 – O – methyl – D – giucuronic acid (hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose (Hình 1.3). Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗ chúng có arabinofuranose liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α (Hình 1.4) [20]. 7 Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) Hình 1.4: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần (theo Dekker 1985) Các glucomannoxylan (thường được gọi là glucomannan và galactomannan) được cấu thành từ 1,4 β – D – glucose và β – D – mannose dư lượng trong mạch thẳng (Hình 1.5). Glucomannan trong gỗ cứng chứa liên kết 1,4 β giữa glucose và mannose hình thành chuỗi nhánh nhỏ. Tỷ lệ mannose: glucose là khoảng 1.5 : 1 hoặc 2 : 1 trong hầu hết các cây gỗ cứng. Glucomannan trong gỗ mềm đôi khi có các nhánh phụ galactose liên kết với mannose mạch chính bằng 1,6 α (Hình 1.6). Các liên kết 1,6 α của galactose là rất nhạy cảm với acid và kiềm và có thể phân cắt trong môi trường kiềm (Timell 1965). Các xylan trong gỗ mềm và hầu hết thực vật thân thảo đều có một phân tử L – arabinofuranosyl gắn vào thông qua liên kết với một số vị trí O – 3 của mạch chính (Wilkie 1979). Khoảng 60% đến 70% xylose của xylan trong gỗ cứng 8 được acetyl hóa bằng liên kết ester ở vị trí 2 hoặc 3. Xylan trong thực vật thân cỏ và galactomannan trong gỗ mềm cũng được acetyl hóa, mặc dù mức độ thấp hơn (Lindberg et al, 1973 a, b). [20] Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần (theo Dekker 1985) 1.1.3. Lignin Lignin hoặc lignen là một hợp chất hóa học phức tạp phổ biến nhất trong gỗ, và là một phần không tách rời của thành tế bào thứ cấp ở thực vật [15] và một số loài tảo [16]. Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm 1819 bởi de Candolle và có nguồn gốc từ tiếng Latin: lignum, [8] có nghĩa là gỗ. Đây là một trong những polymer hữu cơ phong phú nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose, nó chiếm 30% carbon hữu cơ phi hóa thạch, [22] và từ 1/4 tới 1/3 khối lượng khô của gỗ [25]. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi 9 không những phụ thuộc vào loài cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý. Ví dụ, trong cây lá kim chứa khoảng 20 – 30%, cây lá rộng 20 – 25%, trong khi cỏ là 5 – 9% [20]. Lignin được tìm thấy ở tế bào thực vật bậc cao (hạt kín và hạt trần), Dương xỉ và cây Thạch tùng. Đặc biệt lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyên hóa để vận chuyển chất lỏng. Lignin không được tìm thấy ở rêu, địa y và tảo – là các loại thực vật không có quản bào [25]. Lignin là hợp chất raxemic với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kị nước. Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ [16]. Nghiên cứu xác định độ trùng hợp của lignin, người ta thấy có sự phân đoạn trong quá trình tách chiết và phân tử có chứa nhiều loại tiền chất xuất hiện lặp đi lặp lại một cách ngẫu nhiên trong đó chủ yếu là tại các mắt xích và nhiều nhất là dẫn xuất của phenylpropan [15]. Thành phần của lignin gồm 62 – 65 % carbon, 5 – 6% hydro, nhiều nhóm metoxyl (- OCH3) và hydroxyl (-OH) tự do. Lignin được tổng hợp bởi sự polymer hóa các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy theo số lượng nhóm methoxyl trên vòng thơm; gồm: coniferyl alcohol (guaiacyl propanol), coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl propanol), và sinapyl alcohol (syringyl propanol) được miêu tả bằng công thức hóa học sau [16]. 10 Hinh 1.7: 3 loại tiền chất để tổng hợp lignin Coniferyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ mềm, trong khi đó guaiacyl và syringyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ cứng [22]. Lignin gỗ mềm (hạt trần) bao gồm cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl, một ít từ β – coumaryl, không có sinapyl. Lignin gỗ cứng (hạt kín) chứa số lượng cân bằng coniferyl và sinapyl (46%) và một lượng nhỏ (8%) coniferyl β – hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ rượu coumaryl). Lignin cỏ là hợp chất của coniferyl, sinapyl và β – hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 – 10%), chủ yếu là ester và nhóm hydroxyl tận cùng của rượu β – coumaryl [22]. 11 Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin 1.2. Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) 1.2.1. Glycoside hydrolase Glycoside hydrolase (còn gọi là glycosidase hoặc glycosyl hydrolase) xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết glycoside để tạo thành các phân tử đường nhỏ hơn. Chúng là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, có vai trò như phân giải sinh khối sinh vật (cellulose và hemicellulose), phòng chống vi khuẩn (ví dụ, lysozyme), trong 12 cơ chế sinh bệnh (ví dụ, neuraminidase trong virus) và chức năng khác trong tế bào (ví dụ, mannosidase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp liên kết N- glycoprotein). Cùng với glycosyltransferase, glycosidase tạo thành bộ đôi xúc tác cho sự tổng hợp và phá vỡ liên kết glycoside [24]. Glycoside hydrolase được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống. Ở sinh vật nhân sơ, chúng được tìm thấy ở cả enzym nội bào lẫn enzyme ngoại bào, chúng chủ yếu tham gia vào việc hấp thu dinh dưỡng. Một trong những enzyme quan trọng của glycoside hydrolase ở vi khuẩn là enzyme β – galactosidase (lacZ), tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen của operon lac ở E. coli. Sinh vật bậc cao, glycoside hydrolase được tìm thấy trong lưới nội chất và bộ máy Golgi nơi chúng được gắn thêm liên kết N-glycoprotein, và trong lysosome. Sự thiếu hụt glycoside hydrolase trong lysosome có thể dẫn đến một loạt các rối loạn dự trữ từ đó có thể ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc gây tử vong cho sinh vật. Các glycoside hydrolase được tìm thấy trong đường ruột và trong nước bọt có thể phân giải các carbohydrate phức tạp như lactose, tinh bột, sucrose và trehalose. Trong ruột, chúng được tìm thấy như enzyme bám glycosylphosphatidyl trên tế bào nội mô. Enzyme lactase cần thiết cho sự phân giải lactose sữa. Enzyme O – GlcNAcase liên quan đến việc loại bỏ các nhóm Nacetylglucoamine từ serine và threonine thừa trong tế bào chất và nhân tế bào. Glycoside hydrolase còn tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và phân giải glycogen trong cơ thể [18]. Glycoside hydrolase được phân thành nhóm EC 3.2.1 là enzyme xúc tác thủy phân của O- hoặc S-glycoside. Glycoside hydrolase cũng có thể được phân loại, theo 13 cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng thủy phân, do đó chúng có thể được phân loại thành enzym giữ nguyên hoặc đảo nghịch (hình 1.9 a). Chúng cũng có thể được phân loại như exo hoặc endo, phụ thuộc vào hoạt động của chúng tại vị trí đầu hoặc giữa của chuỗi oligo / polysaccharide. Hoặc chúng cũng có thể được phân loại dựa trên các phương pháp phân tích trình tự hoặc cấu trúc [23]. a. b. Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase a)Theo cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng b)Theo exo/endo 14 1.2.2. Họ GH 61 Trong số các họ glycoside hydrolase xúc tác thủy phân cellulose và hemicellulose, thì vai trò chức năng của họ 61 (GH61) vẫn còn nhiều điều chưa được làm sáng tỏ cho đến gần đây. Đặc tính của GH61 protein được mô tả đầu tiên vào năm 1992. Ban đầu họ glycoside hydrolase 61 được phân loại dựa vào việc đo lường hoạt động của endo-1,4-β-D-glucanase của một số thành viên trong họ mặc dù hoạt động của enzyme này là rất yếu. Khác với các enzyme GH khác, enzyme họ GH61 không có khả năng thủy phân liên kết glycoside hoặc rất yếu [17], vai trò chính của nó là oxy hóa cellulose tạo ra các đầu hở, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase bám vào hoạt động [7]. Hình 1.10. Hoạt động của enzyme GH61 Mặc dù mô hình cơ chế hoạt động cuối cùng của các enzyme họ GH61 vẫn chưa được tìm thấy, song một số tính năng phổ biến của chúng có thể được tổng quát như sau [7]: 15  GH61 là Metallo-enzyme tức là enzyme cần một ion kim loại hóa trị hai để hoạt động, và đồng thời là ion kim loại điều phối hoạt động của trung tâm phản ứng.  Quá trình oxy hóa liên kết glycosidic là hoạt động chính của chúng, tất cả GH61s đều cần một chất đồng yếu tố ở dạng khử, hoạt động như chất cho điện tử từ bên ngoài: gallate, ascorbate, và CDH enzyme (thường được kiểm soát và biểu hiện cùng với GH61s) để tăng cường hoạt động của GH61s. Mặc dù quá trình oxy hóa có thể diễn ra tại các vị trí carbon khác nhau trong cấu trúc vòng glucose (C1, C4 hoặc C6), tuy nhiên oxy hóa C1 (aldonic) cellodextrines là phổ biến nhất. Hình 1.11. Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose 1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc [1] 1.3.1. Định nghĩa 16 Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp lục, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào được cấu tạo chủ yếu là chitin, có hoặc không có cellulose. Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu… Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên động vật, thực vật, và trên con người. Một số chúng là tác nhân gây bệnh, làm hư hại lương thực, thực phẩm và các đồ dùng, thiết bị. Tuy nhiên cũng có nhiều loài có lợi cho con người nhờ khả năng tổng hợp acid hữu cơ, chất kháng sinh, vitamin… hay kích thích tố giúp tăng trưởng ở thực vật… 1.3.2. Hình thái cấu trúc Nấm mốc có dạng sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, cấu tạo đơn bào hoặc đa bào. Sợi nấm có vách ngăn (đa bào) như nấm bậc cao (Ascomycytes, Basicdiomycetes) hay không có vách ngăn (đơn bào) như nấm bậc thấp (Oomyctes, Zygomycetes) hoặc hình ống có nhiều nhân gọi là sợi cộng bào. Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.12). Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. 17
- Xem thêm -