Phân lập và tuyển chọn một số dõng nấm có khả năng sản xuất chitosan

  • Số trang: 56 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 27 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CHITOSAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI HUỲNH HỮU KHIÊM MSSV: 3103340 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CHITOSAN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI HUỲNH HỮU KHIÊM MSSV: 3103340 LỚP: CNSHTT K36 Cần Thơ, Tháng 11/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Trần Thị Xuân Mai Huỳnh Hữu Khiêm DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ ĐỀ CƢƠNG ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học thuộc trƣờng Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm, động viên từ phía gia đình cũng nhƣ hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức tận tình của các thầy cô cùng với sự giúp đỡ, hỗ trợ của bạn bè trong Viện nói chung và bạn bè cùng lớp nói riêng. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Ba mẹ, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cô Trần Thị Xuân Mai, cán bộ hƣớng dẫn đồng thời là cố vấn học tập, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cũng nhƣ quan tâm, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện luận văn và tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện các thí nghiệm. Cô Nguyễn Thị Liên, cô Nguyễn Thị Pha và thầy Võ Văn Song Toàn đã tạo điều kiện thuận lợi và sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện luận văn. Các thầy cô đã giảng dạy và truyền đạt một cách tận tình cho em những kiến thức chuyên môn cùng những kỹ năng quý báu trong quãng thời gian học tập tại trƣờng Đại học Cần Thơ. Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên cùng làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, mọi ngƣời đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Xin gửi đến tập thể lớp Công nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 36 lời cảm ơn chân tình vì đã luôn bên cạnh, đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ các hoạt động khác trong suốt những tháng ngày học cùng nhau trên giảng đƣờng đại học. Xin kính chúc quý thầy cô cùng toàn thể các bạn sinh viên thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học lời chúc sức khỏe, may mắn và thành công. Cần Thơ, ngày tháng Huỳnh Hữu Khiêm năm 2014 Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan” đã được thực hiện với mục tiêu phân lập được một số dòng mốc có thể dùng để sản xuất trực tiếp chitosan. Trong quá trình nghiên cứu, 5 dòng nấm mốc đã được phân lập từ các mẫu đất thu thập từ những vùng ven biển thuộc các tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng và Bạc Liêu. Qua phương pháp nhận diện chitosan bằng phương pháp hóa học đã cho thấy 5 dòng nấm mốc trên cùng với 2 dòng Aspergillus niger và Rhizopus oryzae đều có khả năng sản xuất chitosan. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy lượng chitosan trích được từ R. oryzae là nhiều nhất (71,7mg/g sinh khối sấy khô). Chitosan ly trích từ nấm đã được sử dụng để kiểm tra khả năng kháng khuẩn và kháng nấm. Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn cho thấy dung dịch chitosan được trích từ dòng nấm R. oryzae có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli khi được sử dụng với nồng độ 500mg/L và ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn lây nhiễm trong các mô nuôi cấy in vitro. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm đã cho thấy chitosan trích từ R. oryzae có thể giảm bớt sự phát triển của nấm Collectotrichum gloeosporioides và giảm bớt sự lây nhiễm các loài nấm mốc khác trong các mô nuôi cấy in vitro. Từ khóa: chitosan, dung môi, kháng khuẩn, kháng nấm, khối lƣợng. Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................... LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................... TÓM LƢỢC ................................................................................................................................ i MỤC LỤC .................................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG................................................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................................. vi CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................................................................viii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu ............................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................................... 2 2.1. Chitin ................................................................................................................................ 2 2.1.1. Sơ lƣợc về chitin ...........................................................................................2 2.1.2. Cấu trúc của chitin ........................................................................................2 2.1.3. Tính tan của chitin .........................................................................................3 2.1.4. Dẫn xuất của chitin........................................................................................3 2.1.5. Ứng dụng của chitin ......................................................................................4 2.1.6. Sản xuất chitin trong công nghiệp .................................................................5 2.2. Chitosan ............................................................................................................................ 5 2.2.1. Sơ lƣợc về chitosan .......................................................................................5 2.2.2. Cấu trúc của chitosan ....................................................................................6 2.2.3. Tính tan của chitosan ....................................................................................6 2.2.4. Ứng dụng của chitosan ..................................................................................7 2.2.4.1. Ứng dụng về mặt dƣợc liệu ........................................................................7 2.2.4.2. Ứng dụng về dƣợc lý ..................................................................................7 2.2.4.3. Ứng dụng trong nông nghiệp .....................................................................7 2.2.4.4. Ứng dụng trong nuôi cấy mô .....................................................................8 2.2.4.5. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm....................................................8 2.2.5. Sản xuất chitosan trong công nghiệp ............................................................9 2.3. Chitosan có nguồn gốc từ nấm ......................................................................................... 9 2.3.1. Những nghiên cứu về chitosan có nguồn gốc từ nấm ...................................9 2.3.2. Triển vọng trong công nghiệp .....................................................................10 2.3.3. Ƣu điểm của việc tận dụng nấm làm nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan10 Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT 2.4. Aspergillus niger ............................................................................................................ 10 2.4.1. Sơ lƣợc về Aspergillus niger (A. niger) ......................................................10 2.4.2. Sinh thái học ................................................................................................ 11 2.4.3. Phân loại học ............................................................................................... 11 2.4.4. Ứng dụng trong công nghiệp.......................................................................12 2.5. Rhizopus oryzae .............................................................................................................. 12 2.5.1. Sơ lƣợc ........................................................................................................12 2.5.2. Ứng dụng trong thƣơng mại ........................................................................13 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 14 3.1. Thời gian và địa điểm ..................................................................................................... 14 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................................. 14 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................14 3.2.2. Dụng cụ .......................................................................................................14 3.2.3. Hóa chất.......................................................................................................14 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................ 15 3.3.1. Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc .....................................15 3.3.2. Quy trình trích chitosan của các dòng nấm .................................................17 3.3.3. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học .........................................18 3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn ..................................................................19 3.3.5. Chuẩn bị dung dịch chitosan .......................................................................19 3.3.6. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan.............................................19 3.3.6.1. Khảo sát trên môi trƣờng đặc ...................................................................19 3.3.6.2. Khảo sát trên môi trƣờng lỏng .................................................................20 3.3.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan ...............................................20 3.3.8. Xử lý số liệu ................................................................................................ 21 3.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................................. 21 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc .............21 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm .....21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan ....................22 3.4.3.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dung dịch chitosan trích đƣợc từ các dòng nấm trong môi trƣờng đặc ..............................................................................22 3.4.3.2. Khảo sát nồng độ tối thiểu có khả năng kháng khuẩn của chitosan ........23 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan ........................24 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 25 4.1. Kết quả phân lập và khảo sát đặc điểm các dòng nấm mốc ........................................... 25 4.1.1. Kết quả quá trình phân lập ..........................................................................25 4.1.2. Khảo sát đặc điểm của các dòng nấm mốc đã phân lập .............................. 25 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT 4.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng sản xuất chitosan của các dòng nấm ................. 27 4.3. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli của chitosan ................................ 29 4.4. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của chitosan ............... 32 4.5. Ứng dụng chitosan trong nuôi cấy mô............................................................................ 34 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 36 5.1. Kết luận .......................................................................................................................... 36 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 37 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 40 Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Những ứng dụng của chitosan, chitin và dẫn xuất của chúng trong công nghiệp thực phẩm ........................................................................................................................9 Bảng 2. Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc ...........21 Bảng 3. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng sản xuất chitosan giữa các dòng nấm ....22 Bảng 4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trong dung môi acid acetic 5% trên môi trƣờng đặc ...............................................................................23 Bảng 5. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng lỏng ................................................................................................................................ 24 Bảng 6. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan .........................24 Bảng 7. Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái của các dòng nấm mốc ..........................26 Bảng 8. Trung bình sinh khối và trung bình chitosan trích đƣợc giữa 3 lần lặp lại của các dòng nấm .................................................................................................................28 Bảng 9. Lƣợng chitosan/1g sinh khối nấm thu đƣợc từ các dòng nấm .........................29 Bảng 10. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng lỏng ....................................................................................................................31 Bảng 11. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch chitosan với dung môi acid acetic 1% ................................................................................................................32 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc 1 monomer của phân tử chitin (N-acetyl-β-D-glucosamine) ...............3 Hình 2. Cấu trúc mạch chitosan ......................................................................................6 Hình 3. Khuẩn ty và túi bào tử của nấm Aspergillus niger ...........................................11 Hình 4. Khuẩn ty và túi bào tử của nấm Rhizopus oryzae ............................................13 Hình 5. Sơ đồ quy trình ly trích chitosan từ nấm mốc ..................................................18 Hình 6. Nhận diện chitosan bằng phƣơng pháp hóa học ...............................................18 Hình 7. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan trên môi trƣờng đặc ........20 Hình 8. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của chitosan ...........................................21 Hình 9. Vòng sáng xuất hiện quanh 1 khuẩn lạc của dòng nấm ST3 (phải) và TV1 (trái) sau 5 ngày nuôi cấy trong môi trƣờng chitin ........................................................25 Hình 10. Khuẩn ty và túi bào tử của dòng nấm ST3 (phải) và ST2.2 (trái) quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần .................................................................................26 Hình 11. Chitosan trích đƣợc từ dòng nấm R. oryzae đƣợc nhận diện bằng phƣơng pháp hóa học ..................................................................................................................27 Hình 12. Hàm lƣợng chitosan trích đƣợc/1g sinh khối của các dòng nấm ...................29 Hình 13. Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chitosan trích đƣợc từ 2 dòng nấm R. oryzae và ST2.2 ................................................................................30 Hình 14. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trích từ R. oryzae ở các nồng độ khác nhau thông qua chỉ số OD610nm ......................................................................................31 Hình 15. Vòng kháng khuẩn xuất hiện quanh các mẫu giấy đƣợc tẩm dung dịch chitosan 1% trong dung môi acid acetic 1% .................................................................32 Hình 16. Nấm C. gloeosporioides phát triển tốt trên môi trƣờng PDA không có chitosan ..........................................................................................................................33 Hình 17. Khả năng kháng nấm của chitosan 1% trích từ nấm với các thể tích 100µL (phải) và 150µL (trái) ....................................................................................................33 Hình 18. Các mẫu đinh lăng nuôi cấy mô bị nhiễm khuẩn (A) và nấm mốc (B) ..........34 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT Hình 19. Chồi đinh lăng giảm bớt nhiễm nấm mốc (A) và không còn nhiễm khuẩn (B) trên môi trƣờng nuôi cấy có chứa chitosan 400mg/L. Hình C: Mẫu đinh lăng bị nhiễm nấm mốc trở lại trên môi trƣờng không có bổ sung chitosan ........................................35 Chuyên ngành Công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT LB-agar LB PDA PDB Luria-Bertani Agar Luria-Bertani Broth Potato Dextrose Agar Potato Dextrose Broth Chuyên ngành Công nghệ sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Chitin là một loại polymer sinh học rất dồi dào trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy nhiều nhất trong vỏ giáp xác nhƣ tôm, cua. Trong công nghiệp, đó cũng là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất ra chitin. Sau khi bị khử gốc acetyl trong cấu tạo bởi NaOH ở nhiệt độ cao, chitin sẽ trở thành chitosan. Chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhƣ nông nghiệp, công nghiệp và y học. Tuy nhiên, việc sử dụng vỏ giáp xác làm nguyên liệu sản xuất chitosan bằng phƣơng pháp hóa học trong công nghiệp có một số bất lợi nhƣ nguồn cung cấp vỏ giáp xác không ổn định, ô nhiễm môi trƣờng, tiêu tốn nhiều năng lƣợng và chất lƣợng thành phẩm không cao. Gần đây, một số nghiên cứu đã thành công trong việc trích chitosan từ nấm mốc, đặc biệt là những loài nấm sử dụng chitin nhƣ nguồn carbon chính trong quá trình dinh dƣỡng. Việc trích chitosan từ nấm mốc có những thuận lợi nhƣ nấm mốc sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng dinh dƣỡng phổ biến, quy trình trích đơn giản. Chitosan có nguồn gốc từ nấm có nhiều ứng dụng nhƣ làm chất diệt khuẩn, làm chất hấp thụ trong sắc ký, chất kích thích sinh trƣởng trên thực vật, hút giữ các ion kim loại nặng. Trong đó, khả năng diệt khuẩn đang đƣợc chú ý hàng đầu. Những nghiên cứu về chitosan có nguồn gốc từ nấm đã đƣợc nghiên cứu trên thế giới. Tuy nhiên, lĩnh vực nghiên cứu này vẫn còn khá mới mẻ ở Việt Nam. Do đó đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm có khả năng sản xuất chitosan” đã đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài này là phân lập và tuyển chọn đƣợc một số dòng nấm mốc có khả năng sản xuất chitosan. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Chitin 2.1.1. Sơ lƣợc về chitin Chitin là polymer quan trọng và phổ biến thứ nhì trên thế giới (sau cellulose) (Rinaudo, 2006). Chitin, hay còn gọi là poly (β-(1-4)-N-acetyl-D-glucosamine) (GlcNAc), đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1884. Chitin là polymer sinh học đƣợc tổng hợp bởi nhiều loài sinh vật sống. Hằng năm, có một lƣợng lớn chitin đƣợc tổng hợp nên. Chitin tồn tại trong tự nhiên dƣới dạng vi sợi kết tinh đƣợc sắp xếp theo một trật tự nhất định và những vi sợi này tạo thành các cơ quan cấu trúc trong bộ xƣơng ngoài của các loài chân khớp hoặc trong vách tế bào của nấm. Một số thực vật bậc thấp và một số loài động vật khác cũng có khả năng tổng hợp chitin để sử dụng trong các cơ quan có chức năng gia cố và chịu đựng sức bền. Mặc dù chitin rất đa dạng về nguồn gốc nhƣng hiện nay chất này chỉ đƣợc khai thác chủ yếu từ vỏ tôm và cua – hai loài giáp xác sống ở biển. Trong công nghiệp, chitin thu đƣợc từ hai loài giáp xác trên bằng cách dùng acid để hòa tan calcium carbonate, sau đó chiết tách kiềm để hòa tan protein. Thêm vào đó quy trình trên thƣờng đi kèm một bƣớc làm phai màu nhằm thu đƣợc sản phẩm không màu. Những quy trình xử lý này phải chuyên biệt và đặc trƣng theo từng nguồn chitin riêng biệt. Chitin thu đƣợc trong các quá trình chiết tách cần phải đƣợc phân loại chất lƣợng dựa vào các chỉ tiêu nhƣ độ tinh khiết và màu sắc bởi lƣợng protein còn sót lại cũng nhƣ các chất khác có thể ảnh hƣởng đến kết quả cũng nhƣ sản phẩm của các quy trình có sử dụng chitin, đặc biệt là các dƣợc liệu sinh học. Deacetyl hóa một phần chitin trong môi trƣờng kiềm có thể tạo ra đƣợc chitosan. Chitosan là dẫn xuất quan trọng nhất của chitin về mặt ứng dụng. 2.1.2. Cấu trúc của chitin Tùy thuộc vào nguồn gốc, chitin thƣờng có hai dạng tha hình: α và β. Hai dạng trên có thể phân biệt bởi phƣơng pháp hồng ngoại và quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cùng với nhiễu xạ tia X. Một dạng tha hình khác là γ cũng từng đƣợc đề cập đến nhƣng qua quá trình phân tích cho thấy rằng đây chỉ là một biến thể của dạng α. Trong hai loại trên thì α-chitin có nguồn gốc phong phú hơn. Loại này có thể đƣợc tìm thấy ở Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT nấm, các loài nhuyễn thể, trong gân và vỏ của tôm hùm và cua, trong vỏ tôm cũng nhƣ trong lớp cutin của côn trùng. Nó cũng có thể đƣợc tìm thấy ở hoặc tạo ra bởi nhiều loại sinh vật biển khác. Ngoài ra, α-chitin còn có thể tổng hợp nhân tạo bằng cách tái kết tinh từ dạng dung dịch, sinh tổng hợp in vitro, hoặc polymer hóa bằng enzyme. Β-chitin thƣờng hiếm hơn và đƣợc tìm thấy ở dạng liên kết với các protein trong mai mực cũng nhƣ trong một số loài sâu có khoang và ống cơ thể. Cho đến nay vẫn chƣa thể thu đƣợc β-chitin bằng các phƣơng pháp chiết tách hoặc bằng cách tổng hợp sinh học trong phòng thí nghiệm. Hình 1. Cấu trúc 1 monomer của phân tử chitin (N-acetyl-β-D-glucosamine) (Rinaudo, 2006) 2.1.3. Tính tan của chitin Chitin trong tự nhiên thƣờng bị deacetyl hóa một phần, ít hay nhiều tùy thuộc vào nguồn gốc. Tuy nhiên, cả hai dạng α và β đều không tan trong tất cả các dung môi thông thƣờng mặc dù có xảy ra nhiều biến đổi tự nhiên trong quá trình kết tinh. Tính không tan là một vấn đề lớn gây khó khăn trong các quy trình có sử dụng chitin cũng nhƣ trong việc ứng dụng chitin. Một cơ chế quan trọng đã đƣợc đề cập trƣớc đó là sự chuyển đổi dạng rắn của β-chitin sang α-chitin bằng cách xử lý bởi acid HCl đậm đặc và sau đó rửa lại với nƣớc. Thêm vào đó β-chitin thì hoạt động hơn dạng α, một đặc điểm quan trọng liên quan đến sự biến đổi do enzyme và do tác nhân hóa học của chitin. 2.1.4. Dẫn xuất của chitin Dẫn xuất quan trọng nhất của chitin là chitosan. Chitosan đƣợc tạo ra bằng cách deacetyl hóa một phần chitin dạng rắn trong môi trƣờng kiềm hay bằng cách thủy phân chitin bởi enzyme chitin deacetylase. Bởi hình thái bán tinh thể của chitin, chitosan thu đƣợc có sự phân bố hỗn tạp các nhóm acetyl dọc theo chuỗi cấu trúc. Thêm vào đó, có Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT một điều đã đƣợc chứng minh là trong quá trình deacetyl hóa, β-chitin phản ứng mạnh hơn α-chitin. Ngoài ra chitin cũng có một số dẫn xuất khác đã đƣợc tìm ra, chẳng hạn nhƣ fluorinated-chitin, N và O-sulfated chitin, (diethylamino)ethyl-chitin, phosphoryl chitin, mercaptochitin và chitin carbamates. Sự biến đổi của chitin còn bị ảnh hƣởng bởi các dẫn xuất tan trong nƣớc của chúng. Chitin có thể đƣợc sử dụng trong hỗn hợp với những polymer tự nhiên hoặc tổng hợp khác. Chitin có thể liên kết đan xen với các polymer khác bởi các tác nhân dùng cho cellulose nhƣ epichlorhydrin, glutaraldehyde, v.v,... hoặc đƣợc ghép vào dƣới sự hiện diện của muối ceric hoặc sau quá trình thay đổi chọn lọc. Chitin bị phân cắt một phần bởi acid và thu đƣợc những chuỗi oligochitin. Những oligomer này có những hoạt tính đã đƣợc công nhận, chẳng hạn nhƣ: chống ung thƣ, kháng khuẩn và kháng nấm, tạo ra chitinase và điều hòa sự phát triển của thực vật. Chúng đƣợc dùng để kiểm tra hoạt tính của lysozyme và đƣợc ghép vào protein và lipid để tạo ra những chất tƣơng tự glycoprotein và glycolipid. 2.1.5. Ứng dụng của chitin Chitin có nhiều ƣu điểm nhƣ ít độc và trơ trong ruột của động vật có vú, ngoài ra còn có thể bị phân giải sinh học trong tự nhiên bởi enzyme chitinase đƣợc tạo ra ở những sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm và thực vật và cả trong hệ tiêu hóa của động vật. Ngoài ra chitinase cũng góp phần quan trọng vào cơ chế tự vệ của vật chủ trƣớc sự tấn công của vi khuẩn. Chitin đƣợc dùng để chuẩn bị cột sắc ký ái lực nhằm phân tách các lectin (một loại đạm thực vật) và xác định cấu trúc của chúng. Chitin và 6-Ocarboxymethyl-chitin đƣợc dùng để hoạt hóa các đại thực bào ở màng bụng, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ ở chuột và kích thích sự miễn dịch không đặc trƣng trong cơ thể vật chủ để chống lại sự lây nhiễm của E.coli. Ngoài ra chitin cũng làm tăng tốc độ chữa lành vết thƣơng. Chitin đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc cố định enzyme và tế bào. Sự cố định enzyme đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn nhƣ tinh lọc nƣớc trái cây và chế biến sữa khi α và β-amylsase đƣợc ghép vào chitin. Bên cạnh đó, chitin còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác chẳng hạn nhƣ chế tạo các thiết bị cảm biến sinh học. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT Những vật liệu có nguồn gốc từ chitin còn đƣợc dùng để xử lý các chất gây ô nhiễm do các hoạt động công nghiệp thải ra và hấp thu các phức hệ chứa Ag 2SO4 và các actinit. Chitin cũng có thể đƣợc dùng để tạo ra các lớp phim và các loại sợi. Sợi chitin không gây dị ứng, không mùi, kháng khuẩn và có độ ẩm thấp. Sự phát triển các loại phim và sợi chitin nhằm ứng dụng trong sản xuất thuốc và các ứng dụng y học khác nhƣ vật liệu băng bó vết thƣơng và sự phóng thích thuốc đƣợc điều khiển. Chitin còn đƣợc dùng làm tá dƣợc, chất mang thuốc dƣới dạng phim, gel và bột. Một ứng dụng khác trong y học của chitin đó là chitin dùng để tạo nên dạng phức hợp hydroxyapatite-chitin-chitosan có tác dụng trong việc lấp đầy chỗ khuyết trên răng. 2.1.6. Sản xuất chitin trong công nghiệp Trong công nghiệp, chitin đƣợc sản xuất bằng cách thực hiện quy trình chiết xuất từ vỏ tôm và cua – những phụ phẩm của nền công nghiệp chế biển hải sản. Vỏ tôm, cua chứa 14 – 27% chitin cùng với những thành phần khác nhƣ protein, canxi và một lƣợng nhỏ sắc tố. Qua từng các công đoạn của quy trình, canxi đƣợc loại bỏ bằng acid HCl, các protein đƣợc loại bỏ bằng NaOH và phần còn lại thƣờng đƣợc tẩy với KMnO4 hoặc H2O2 (Wu et al., 2005). 2.2. Chitosan 2.2.1. Sơ lƣợc về chitosan Khi tỷ lệ deacetyl hóa của chitin đạt mức 50%, chúng có thể tan trong môi trƣờng acid lỏng và đƣợc gọi là chitosan. Sự hòa tan xảy ra bởi sự thêm proton của nhóm chức –NH2 và vị trí C-2 của những phân tử D-glucosamine, nhờ đó các phân tử đƣờng đa đƣợc chuyển hóa thành những chất điện phân trong môi trƣờng acid. Chitosan là chất giả polymer mang điện tích dƣơng duy nhất và vì thế nó có nhiều ứng dụng đáng quan tâm. Với đặc tính tan trong nƣớc, chitosan đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng khác nhau nhƣ dung dịch, gel, phim và sợi. Bƣớc đầu tiên trong quá trình đặc điểm hóa chitosan là tinh sạch mẫu: chitosan đƣợc hòa tan trong lƣợng dƣ acid và lọc qua giấy lọc có lỗ lọc có đƣờng kính thấp nhất là 0,45μm. Điều chỉnh pH của dung dịch về mức 7,5 bằng cách thêm NaOH hoặc NH4OH gây ra sự kết cụm do sự mất proton và tính không tan của polymer ở pH trung tính (Rinaudo, 2006). Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT Hình 2. Cấu trúc mạch chitosan (http://en.wikipedia.org/wiki/Chitosan) 2.2.2. Cấu trúc của chitosan Theo Rinaudo (2006), ở dạng rắn, chitosan là một polymer bán tinh thể. Những tinh thể đơn lẻ của chitosan thu đƣợc bằng cách dùng chitin có khối lƣợng phân tử thấp đã đƣợc deacetyl hóa hoàn toàn. Nói một cách đơn giản, sau khi loại bỏ gốc acetyl, chitin sẽ trở thành chitosan. 2.2.3. Tính tan của chitosan Theo Rinaudo (2006), một polymer có mức độ deacetyl hóa cao đã đƣợc dùng để nghiên cứu cách đặc điểm hóa. Những đặc tính của một dung dịch chitosan không chỉ phụ thuộc vào mức độ acetyl hóa mà còn vào sự phân bố của những nhóm acetyl trên mạch chính và khối lƣợng phân tử. Sự deacetyl hóa thƣờng đƣợc thực hiện ở trạng thái rắn và tạo ra một cấu trúc không đều tùy thuộc vào đặc điểm của polymer ban đầu (chitin) trƣớc khi deacetyl hóa. Quá trình khảo sát vai trò của sự nhận proton đối với tính tan của chitosan khi có mặt acid acetic và acid HCl cho thấy rằng mức độ ion hóa phụ thuộc vào pH và pKa. Chitosan tan ở pH nhỏ hơn 6. Tính tan của chitosan thƣờng đƣợc kiểm tra trong acid acetic bằng cách hòa tan nó trong acid acetic 1% hoặc 0,1M. Lƣợng acid acetic cần dùng phụ thuộc vào chất lƣợng của loại chitosan cần hòa tan. Ngoài ra, HCl 1M cũng đƣợc dùng để hòa tan chitosan trong một số thí nghiệm. Tính tan là một thông số rất khó để điều khiển. Nó phụ thuộc vào mức độ acetyl hóa, nồng độ ion, độ pH, tính chất của acid dùng để cho proton, và sự phân bố của các nhóm acetyl dọc theo mạch chitosan cũng nhƣ là các điều kiện tách và sấy khô của chúng. Một nghiên cứu mới đây đã thu đƣợc một dạng chitosan tan trong nƣớc ở pH trung tính dƣới sự hiện diện của glycerol-2-phosphate. Những dung dịch chitosan bền đã đƣợc thu lấy ở pH 7 – 7,1 ở nhiệt độ phòng và dung dịch này chuyển thành dạng gel Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT ở 40oC. Sự chuyển đổi giữa dạng gel và dạng dung dịch của chitosan có thể xảy ra thuận nghịch và nhiệt độ hóa gel phụ thuộc một phần vào điều kiện thí nghiệm. 2.2.4. Ứng dụng của chitosan Theo Rinaudo (2006), chitosan có những ứng dụng cơ bản sau: 2.2.4.1. Ứng dụng về mặt dƣợc liệu Một số ứng dụng cơ bản của chitosan trong lĩnh vực dƣợc liệu là: - Làm chất pha loãng trong quá trình nén thuốc. - Chất mang thuốc trong những vi hệ thống. - Màng điều khiển sự phóng thích thuốc. - Sản xuất gel nƣớc, một tác nhân làm tăng độ nhớt trong dung dịch. - Nhân tố làm ẩm, và tăng cƣờng sự hòa tan của các chất thuốc khó tan. - Chất phân hủy. - Polymer bám dính sinh học. - Phát tán thuốc đến những vị trí đặc biệt (nhƣ dạ dày hoặc ruột). - Làm tăng sự hấp thu (các loại thuốc ngửi hoặc thuốc uống). - Là polymer có khả năng bị phân hủy sinh học (mô cấy, những hạt có kích thƣớc hiển vi, v.v,....). - Chất vận chuyển trong sự phát tán vaccine hoặc trong liệu pháp gene. 2.2.4.2. Ứng dụng về dƣợc lý Chitosan có những ứng dụng về mặt dƣợc lý nhƣ sau: - Làm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus. - Là tác nhân chống ung thƣ, chống oxi hóa. - Chất chống đông. - Chất chữa lành vết thƣơng và thuốc cầm máu. - Chất chống kích thích. - Chất kháng viêm. - Điều chỉnh chức năng thận. 2.2.4.3. Ứng dụng trong nông nghiệp Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn Đại học khóa 2010-2015 Trường ĐHCT Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan đƣợc dùng để xử lý hạt giống hoặc làm lớp phủ bên ngoài hạt. Hạt giống của những cây nhƣ bông, bắp, khoai tây, đậu nành, củ cải đƣờng, cà chua, lúa mì và nhiều loại cây khác sau khi xử lý bằng chitosan có thể đƣợc kích thích khả năng miễn dịch tự nhiên và biểu hiện ra trên rễ, giúp tiêu diệt những loài giun ký sinh mà không gây hại đến thiên địch. Nghiên cứu của Ali et al. (2012), đã chỉ ra rằng ở nồng độ tối thiểu 1,5% (w/v), chitosan có thể ngăn ngừa sự phát triển của nấm Collectotrichum gloeosporioides trên trái đu đủ bằng cách ngâm trái đu đủ vào dung dịch chitosan trong 5 giây. Chitosan còn đƣợc dùng để tăng cƣờng sự phát triển của cây trồng. Chitosan giúp tăng cƣờng quang hợp, kích thích cây trồng phát triển, kích thích sự hấp thu dinh dƣỡng, tăng khả năng nảy mầm và mọc chồi cũng nhƣ sức sống của cây. Ngoài ra chitosan còn dùng làm thành phần thuốc trừ sâu sinh học có khả năng giúp cây trồng tăng cƣờng khả năng phòng thủ và miễn dịch tự nhiên của chúng để có thể tự vệ trƣớc côn trùng, mầm bệnh, v.v,.. khi đƣợc phun xuống đất hoặc phun trực tiếp lên lá. Chitosan có thể giúp kiểm soát đƣợc nhiều bệnh trên nông sản trƣớc và sau khi thu hoạch. Chúng có thể kích thích một chuỗi các phản ứng bảo vệ tƣơng quan với các hoạt động enzyme. 2.2.4.4. Ứng dụng trong nuôi cấy mô Nghiên cứu của Zakaria et al. (2009) cho thấy rằng chitosan có khả năng giúp tăng kích thƣớc cành, kích thƣớc rễ, số lƣợng lá và chiều dài cây khoai tây con khi đƣợc nuôi cấy in vitro. Hơn thế nữa, những cây khoai tây con đƣợc nuôi cấy in vitro trong môi trƣờng có bổ sung chitosan sau khi đƣợc mang ra trồng ở nhà kính có thể tăng khối lƣợng cũng nhƣ số lƣợng củ. 2.2.4.5. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Chuyên ngành Công nghệ sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
- Xem thêm -