Tài liệu Phân lập và tuyển chọn một số dòng aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN THANH TRÖC MSHV: 62030803 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC Cần Thơ, năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN THANH TRÖC MSHV: 62030803 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC Chu n ng nh: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN V N MƢỜI TS NGUYỄN V N THÀNH Cần Thơ, năm 2013 Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Trần Thanh Trúc với sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chƣa từng đƣợc công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trƣớc đây. Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Tác giả luận văn PGS. TS. NGUYỄN V N MƢỜI TRẦN THANH TRÖC TS. NGUYỄN V N THÀNH Chuyên ngành Vi sinh v t h i i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 LỜI CẢM ƠN Hơn cả sự biết ơn, tôi cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi đƣợc thực hiện luận án tiến sĩ dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành. Lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gởi đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời – giáo viên hƣớng dẫn chính. Thật sự vinh dự và tự hào khi tôi đƣợc là học trò của Thầy. Thầy chính là ngƣời truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy ở tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ. Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp em có đƣợc định hƣớng đúng đắn trong công việc. Tôi cũng xin gởi lời tri ân đến TS. Nguyễn Văn Thành – Thầy luôn đóng góp cho tôi rất nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian cùng tôi nghiên cứu những vấn đề mới phát sinh để có kết quả thu nhận tốt nhất. Tôi đặc biệt biết ơn sự giúp đỡ và hỗ trợ và cả động viên của TS. Trần Nhân Dũng – Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã giúp tôi có thể hoàn tất tốt nội dung nghiên cứu. Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự đồng hành, hỗ trợ của các em học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, sinh viên đại học từ các khóa 28 đến khóa 35. Các em không quản ngại khó khăn, thời gian để cùng với tôi thực hiện các nghiên cứu và hơn thế nữa, các em còn luôn tiếp sức và hỗ trợ tôi trong nhiều lĩnh vực và trong cuộc sống,... đến tận thời điểm này. Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Cần Thơ, Phòng Tổ chức Cán bộ, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Đào tạo, Khoa Sau đại học và các phòng ban chức năng khác của Trƣờng; đặc biệt là Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu. Xin cám ơn Thầy Cô ở Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Cần Thơ – nơi tôi đang công tác đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu này. Tôi cũng xin đƣợc gởi lời cám ơn đến GS. TS. Lƣu Duẫn, PGS. TS. Đống Thị Anh Đào và nhiều bạn bè gần xa đã luôn động viên và giúp tôi có thêm nỗ lực phấn đấu, hoàn thành nghiên cứu. Xin cám ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng chấm Luận án Tiến sĩ cấp cơ sở đã có nhiều góp ý và đƣa ra nhiều lời khuyên bổ ích, giúp tôi hoàn thiện luận án tốt hơn. Đặc biệt, xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến hai phản biện độc lập với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn tất tốt hơn nữa các nội dung nghiên cứu của luận án. Chuyên ngành Vi sinh v t h ii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Cám ơn các Thầy Cô giáo cũ đã không ngừng động viên, khuyến khích, các bạn bè gần xa đã luôn khích lệ tôi trong suốt tiến trình học tập. Cuối cùng, tôi xin đƣợc gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đƣờng cam go để hoàn thành đƣợc luận án nghiên cứu này. Đặc biệt, xin dành tặng ba mẹ các thành quả mà hôm nay con đã đạt đƣợc. Chân thành cám ơn. Cần Thơ, ngày tháng 03 năm 2013 Nghiên cứu sinh thực hiện Trần Thanh Trúc Chuyên ngành Vi sinh v t h iii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 TÓM LƢỢC Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao” đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có liên quan, từ tháng 11.2008 đến tháng 9.2012. Đề tài đƣợc thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp và ứng dụng enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ sự lên men bề mặt trên môi trƣờng rắn, sử dụng dòng Aspergillus niger (A. niger) đặc hiệu đƣợc phân lập và tuyển chọn trong điều kiện thực tế tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 60 dòng có đặc tính giống Aspergillus niger từ vỏ các loại quả giàu pectin phổ biến ở khu vực đồng b ng sông Cửu Long nhƣ vỏ cam, bƣởi, chanh, hạnh, táo và sung, sử dụng các môi trƣờng nƣớc trích khoai tây (Potato Dextrose Agar, PDA), Czapek Dox Agar (CZ) và Malt Extract Agar (MEA). Việc tuyển chọn các dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp pectinase đƣợc thực hiện b ng cách đo đƣờng kính vòng phân giải pectin cho thấy, tất cả 60 dòng đều có khả năng phân giải pectin, trong đó 14 dòng nấm đã phân lập có đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn 20 mm. Kết quả sàng lọc các dòng nấm có khả năng sinh tổng hợp PME từ 14 dòng đặc hiệu với pectinase đã tuyển chọn đƣợc 4 dòng có hoạt tính PME thu đƣợc cao và ổn định, ký hiệu T1, N1, So2 và R1 phân lập từ vỏ táo ta, vỏ quả chanh núm, vỏ cam soàn và bƣởi Năm Roi. Sự kết hợp của 2 dòng R1 và So2 với tỷ lệ 1:1 đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rắn sinh tổng hợp PME có hiệu quả cao nhất. Kỹ thuật giải trình tự gene 28S rRNA cũng đƣợc áp dụng để nhận diện bốn (4) dòng T1, N1, So2 và R1, kết quả cho thấy, 4 dòng này đều thuộc A. niger với mức độ đồng hình 99 ÷ 100%. Điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp PME từ tổ hợp A. niger So2 và R1 đã đƣợc xác định dựa trên việc khảo sát một số yếu tố đơn lẻ (thành phần cơ chất, dinh dƣỡng, tác động của dung dịch đệm và thời gian ủ) kết hợp với việc tối ƣu hóa một số yếu tố chính (pH ban đầu, độ ẩm môi trƣờng lên men, tỷ lệ bào tử nấm mốc sử dụng và nhiệt độ lên men) theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm. Điều kiện ly trích, thu nhận enzyme sau lên men (pH của dung dịch đệm, tỷ lệ dung môi và cơ chất, nhiệt độ và thời gian ly trích tƣơng ứng) cũng đƣợc xác định. Kết quả đã cho thấy hiệu quả của việc tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta khô và vỏ bƣởi Năm Roi tƣơi làm cơ chất lên men chính (với tỷ lệ bã táo ta và vỏ bƣởi là 1:1 w/w) cho việc thu nhận PME. Quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh đến độ ẩm 57,4% b ng dung dịch đệm citrate pH 4,0, có bổ sung 0,1% urea, 0,5% MgCl2 và 0,15% CaCl2, tỷ lệ huyền phù bào tử nấm ở mật số 105 cfu/mL sử dụng là 16,5% v/w (mL/g). Sau 96 giờ ủ Chuyên ngành Vi sinh v t h iv i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 ở nhiệt độ 35,5°C, PME thô đƣợc ly trích ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 50 phút b ng dung dịch đệm citrate pH 3,6, sử dụng tỷ lệ dung dịch đệm và cơ chất là 2:1 v/w (mL/g). Ƣớc tính hoạt tính PME đạt đƣợc ở điều kiện lên men và ly trích tốt nhất là 79,1 U/g cơ chất. PME thô thu đƣợc sau khi tinh sạch sơ bộ b ng kết tủa với ethanol ở tỷ lệ 3:1 (v/v), thể hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mgprotein, hiệu suất thu hồi 91,48% và độ tinh sạch tăng gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với ethanol, tiến hành lọc màng ở khoảng phân đoạn 50 kDa thu đƣợc PME có hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mgprotein, độ tinh sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với mẫu enzyme thô. PME từ A. niger có khối lƣợng phân tử khoảng 43 kDa, h ng số Km của PME đạt đƣợc là 0,6014 mg/mL. Hoạt tính của PME thu nhận từ A. niger thể hiện cao nhất ở 38 ÷ 40°C và pH môi trƣờng 5,0. Cả hai muối CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của PME từ A. niger. Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của PME tuân theo phƣơng trình bậc 1 chuyển đổi một phần với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70°C. Việc nghiên cứu thử nghiệm trên một vài sản phẩm thực phẩm có cấu trúc không ổn định cũng đã khẳng định hiệu quả tích cực của chế phẩm PME kỹ thuật từ nấm mốc trong việc cải thiện độ cứng chắc của sản phẩm sau chế biến, điển hình là khóm lạnh đông và dƣa leo muối chua. Từ khóa: Aspergillus niger, cải thiện cấu trúc, cơ chất giàu pectin, hoạt tính cao, lên men bề mặt cơ chất rắn, pectin methylesterase, phân lập, tuyển chọn. Chuyên ngành Vi sinh v t h v i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 SUMMARY The thesis “Isolation and screening of Aspergillus niger biosynthesize high activity pectin methylesterase” was performed in the laboratory of Food Technology Department, College of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University and other laboratories, from 11.2008 to 9.2012. The thesis was conducted to investigate the biosynthesis process and application of pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) in solid state fermentation (SSF) of isolated and selected Aspergillus niger from the practical conditions of Vietnam. Sixty species which have morphologically similar Aspergillus niger were isolated from the peels of rich pectin fruits which have been found to be widely in Mekong delta, such as orange, pomelo, citrus, apple and fig peels on Potato Dextrose Agar (PDA), Czapek Dox Agar (CZ) and Malt Extract Agar (MEA). To indicate the pectinase activity of the organisms, diameters of clear zone around colonies on pectin - agar medium were measured. The result showed that all of sixty isolates have the ability of pectinolytic activities, in which 14 out of the 60 isolates were able to produce a higher pectinase activity, based on the average clear zone diameters were larger than 20 mm. Further screening of PME production of the 14 selected isolates, the maximum PME production was obtained by 4 isolates (T1, N1, So2 and R1) which were isolated from the peels of Ziziphus mauritiana (“tao ta”), Citrus lemon (“chanh num”), Citrus sinensis L. (“cam soan”) and Citrus maxima (“Nam Roi” pomelo), respectively. The combination of two isolates of R1 and So2 with the proportion of 1:1, was conducted to investigate the suitable conditions for PME biosynthesis by solid state fermentation. In addition, the identification by sequencing of 28S rRNA gene, revealed that 4 selected isolates T1, N1, So2 and R1 had 99 ÷ 100% identity to Aspergillus niger. The optimal conditions of pectin methylesterase biosynthesis from A. niger So2 and R1 in solid-state fermentation were evaluated, based on the individual factors (substrate characteristics, nutrients, buffer solutions and incubation time) which influenced to PME production were investigated. After that, the Response surface methodology (RSM) based on four-variable central composite design (CCD) can be used to model the correlation of the fermentation conditions such as inducer concentration, initial pH, incubation temperature and moisture content of medium to PME activity. Moreover, some extraction parameters consist of type of solvent, pH, ratio of solvent and fermented solids were studied. In addition, the best combination of extraction temperature, contact time was also determined. Especially, the use of rich pectin of agricultural material in Mekong Delta (mixture of apple pomace and pomelo peels at the ratio of 1:1 w/w) as a fermentation medium was taken into consideration for the PME production of A. niger in this investigation. With the Chuyên ngành Vi sinh v t h vi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 addition of 0.1% urea combined with 0.5% MgCl2 and 0.15% CaCl2 into media, the highest PME obtained after 96 hours incubation at a temperature of 35.5°C, pH 4.0 (adjusted by citrate buffer), fermentation temperature and moisture content adjusted to 57.4% and 16.5% v/w of inducer concentration (105 cfu/mL). In addition, citrate buffer (pH 3.6) at 35°C and 50 min provided the best recovery in order to obtain highest value of PME. The ratio 2:1 (v/w) of solvent and substrate was determined as an optimal condition for concentrated enzyme extracts. Maximum production of PME (about 79.1 U/g of substrate) was recorded under optimum conditions of SSF and extraction. Ethanol was the appropriate precipitant for PME purification with the optimal ratio of cold ethanol and crude enzyme 3: 1 (v/v). In this case, specific activity of PME was 10.02 U/mgprotein, the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield obtained 91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity of PME reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89 fold in comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme was found to be 43 kDa and Km was 0.6014 g/L. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl or CaCl2. In addition, the optimum temperature and pH of A. niger PME were 38 ÷ 40°C and 5.0, respectively. Isothermal inactivation of partial purified A. niger PME could be described by a fractional – conversion model and the inactivation rate constants increase with increasing temperatures from 50 to 70°C. The obtained technical PME enzyme also proved the positive effects to improving of the texture of frozen pineapples and fermented cucumbers. Key words: Aspergillus niger, isolation, high activity, pectin methylesterase, rich pectin substrate, screening, solid state fermentation, texture improvement. Chuyên ngành Vi sinh v t h vii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... ii TÓM LƢỢC ........................................................................................................................ iv SUMMARY ......................................................................................................................... vi MỤC LỤC ......................................................................................................................... viii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................ xiii DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................... xv TỪ VI T TẮT................................................................................................................... xix THUẬT NGỮ ..................................................................................................................... xx MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề t i ......................................................................................... 1 2. Mục ti u v nội dung nghi n cứu .......................................................................... 2 3. Đối tƣợng v phạm vi nghi n cứu ......................................................................... 3 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án ..................... 3 5. Cách tiếp cận v giả thu ết khoa học .................................................................... 4 6. Kết cấu của luận án ................................................................................................ 5 Chƣơng 1 1.1 T NG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 6 Tổng quan về enz me pectin meth lesterase ...................................................... 6 1.1.1 Tổng quan ............................................................................................................ 6 1.1.2 Tính chất sinh lý của PME .................................................................................. 6 1.1.3 Kiểu phản ứng của PME ...................................................................................... 7 1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học của enzyme PME ...................................... 8 1.2 Tầm quan trọng của việc sử dụng PME trong thực tiễn ................................. 10 1.2.1 Các ứng dụng cơ bản ......................................................................................... 10 1.2.2 Tổng quan về công nghệ chế biến rau quả và sự biến đổi đặc tính cấu trúc của rau quả trong quá trình chế biến .......................................................................................... 12 1.2.3 Vai trò của pectin và PME đối với sự cải thiện đặc tính cấu trúc của thực phẩm nguồn gốc thực vật ............................................................................................................... 13 1.3 Vai trò của việc thu nhận PME từ nấm mốc Aspergillus niger đặc hiệu........ 19 Chuyên ngành Vi sinh v t h viii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 1.3.1 Tầm quan trọng của việc thu nhận PME từ nấm mốc A. niger ......................... 19 1.3.2 Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp enzyme PME ........................................................................................................................ 20 1.3.3 Nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập và tuyển chọn A. niger sinh tổng hợp PME hoạt tính cao................................................................................................................ 21 1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger ................................................................. 22 1.4.1 Giới thiệu chung ................................................................................................ 22 1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger ...................................................... 23 1.4.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản ................................................................................... 23 1.4.4 Chuyên luận phân loại Aspergillus niger .......................................................... 24 1.4.5 Định danh Aspergillus niger theo phƣơng pháp truyền thống .......................... 24 1.4.6 Định danh nhóm loài Aspergillus b ng phƣơng pháp sinh học phân tử ............ 25 1.5 Phƣơng pháp tu ển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp PME .................................................................................................................... 26 1.5.1 Lý thuyết chung ................................................................................................. 26 1.5.2 Tuyển chọn dòng Aspergillus niger sinh tổng hợp PME theo phƣơng pháp sàng lọc tự nhiên .......................................................................................................................... 27 1.6 Ảnh hƣởng của th nh phần môi trƣờng đến quá trình sinh tổng hợp PME . 27 1.6.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh tổng hợp PME ...................... 27 1.6.2 Ảnh hƣởng của thành phần đa lƣợng................................................................. 29 1.6.3 Ảnh hƣởng của nguồn khoáng dinh dƣỡng ....................................................... 30 1.7 Tác động của phƣơng thức v điều kiện l n men đến hiệu quả sinh tổng hợp PME ............................................................................................................................... 30 1.7.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ...................................................................... 30 1.7.2 Độ ẩm môi trƣờng ............................................................................................. 30 1.7.3 Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng............................................................... 31 1.7.4 Ảnh hƣởng của thời gian ủ ................................................................................ 32 1.7.5 Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp PME ................. 33 1.8 Các ếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả thu nhận PME từ canh trƣờng bề mặt 34 1.9 Các biện pháp tinh sạch PME kỹ thuật ............................................................ 35 1.9.1 Tầm quan trọng của chế phẩm enzyme kỹ thuật trong công nghệ thực phẩm .. 36 1.9.2 Tinh sạch sơ bộ PME b ng phƣơng pháp kết tủa .............................................. 37 Chuyên ngành Vi sinh v t h ix i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme kỹ thuật ......................... 38 1.9.3 Qu 1.10 hoạch thực nghiệm xác định điều kiện l n men thích hợp bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .............................................................................. 38 Tình hình nghi n cứu trong v ngo i nƣớc về lĩnh vực phân lập, tu ển 1.11 chọn v sinh tổng hợp PME .............................................................................................. 39 Chƣơng 2 2.1 PHƢƠNG TIỆN & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 45 Phƣơng tiện nghi n cứu ...................................................................................... 45 2.1.1 Địa điểm, thời gian ............................................................................................ 45 2.1.2 Thiết bị, hoá chất ............................................................................................... 45 2.2 Phƣơng pháp nghi n cứu .................................................................................... 47 2.2.1 Chuẩn bị mẫu ..................................................................................................... 47 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc ...................................................................... 48 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................ 50 2.3 Nội dung nghi n cứu ........................................................................................... 52 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ............................................................................... 52 2.3.2 Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp PME ...................................................................................................... 54 Nội dung 2: Xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men rắn sinh tổng 2.3.3 hợp PME ........................................................................................................................... 60 2.3.4 Nội dung 3: Tinh sạch sơ bộ và xác định đặc điểm của PME từ A. niger ......... 71 2.3.5 Nội dung 4: Ứng dụng chế phẩm PME từ A. niger trong cải thiện đặc tính cấu trúc rau quả .......................................................................................................................... 77 Chƣơng 3 3.1 K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 81 Phân lập v xác định đặc điểm hình thái các dòng nấm có đặc tính giống A. niger từ vỏ các loại quả gi u pectin .................................................................................. 81 3.1.1 Kết quả phân lập các dòng nấm đen thuộc nhóm Aspergillus từ vỏ các loại quả giàu pectin ........................................................................................................................... 81 3.1.2 Định loại các dòng vừa phân lập dựa trên đặc điểm đại thể của khuẩn lạc ....... 83 3.1.3 Đặc điểm của bào tử đính và bộ máy mang bào tử của các dòng nấm mốc phân lập ........................................................................................................................... 85 3.2 3.2.1 Tu ển chọn dòng nấm mốc đặc hiệu đối với PME ........................................... 88 Đánh giá khả năng sinh pectinase của các dòng nấm đã đƣợc phân lập ........... 88 Chuyên ngành Vi sinh v t h x i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 3.2.2 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao ..... 92 3.2.3 Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME.... 94 3.2.4 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng So2 và R1 đặc hiệu theo các tỷ lệ khác nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao .......................................................... 96 3.3 Bƣớc đầu định danh một số dòng A. niger đã phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử ......................................................................................................................... 98 3.4 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh tổng hợp PME từ 2 dòng A. niger R1 và So2 ................................................................................................. 100 3.4.1 Xác định thành phần cơ bản của cơ chất lên men ........................................... 100 3.4.2 Đánh giá tác động của thành phần cơ chất đến hoạt tính PME thu nhận từ quá trình lên men SSF của hai dòng nấm mốc A. niger R1 và So2 ........................................... 102 3.4.3 Vai trò của việc bổ sung khoáng đến khả năng tổng hợp PME từ A. niger .... 104 3.4.4 Tác động của nguồn nitrogen bổ sung đến hiệu quả thu nhận PME từ quá trình lên men SSF dòng A. niger So2 và R1 ................................................................................ 107 3.5 Tác động của một số điều kiện l n men đến hiệu quả thu nhận PME từ A. niger trong quá trình nuôi cấ SSF ........................................................................... 109 3.5.1 Ảnh hƣởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH ban đầu của môi trƣờng lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp PME ......................................... 109 3.5.2 Sự thay đổi hoạt tính PME và thành phần cơ chất của môi trƣờng nuôi cấy theo thời gian ủ ......................................................................................................................... 111 3.5.3 Sự tƣơng tác giữa pH, độ ẩm ban đầu của môi trƣờng, tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và nhiệt độ ủ đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A. niger ...................................... 113 3.6 Ảnh hƣởng của điều kiện l trích đến hiệu quả thu nhận PME sau quá trình lên men SSF ...................................................................................................................... 120 3.6.1 PME 3.6.2 Ảnh hƣởng của việc thay đổi giá trị pH dung dịch đệm đến hiệu quả ly trích ......................................................................................................................... 120 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch ly trích và canh trƣờng bề mặt sau khi lên men đến hiệu quả ly trích PME từ nấm mốc A. niger ............................................................... 122 3.6.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả ly trích PME ................... 124 3.6.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản đến độ ổn định của dịch trích PME thô .... 126 3.7 Tinh sạch v xác định đặc điểm của PME đƣợc sinh tổng hợp từ tổ hợp A. niger So2 và R1 ............................................................................................................ 129 Chuyên ngành Vi sinh v t h xi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 3.7.1 Ảnh hƣởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa PME từ A. niger ......................................................................................................................... 129 3.7.2 Tinh sạch sơ bộ PME từ A. niger b ng phƣơng pháp lọc màng ...................... 135 3.7.3 Một số đặc điểm cơ bản của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger ... 137 Khả năng ứng dụng của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger So2 3.8 và R1 đến khả năng cải thiện cấu trúc rau quả ............................................................. 146 3.8.1 Đối với sản phẩm khóm lạnh đông .................................................................. 146 3.8.2 Tác động của PME đến sự cải thiện cấu trúc dƣa leo muối chua .................... 151 K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 155 1. Kết luận ................................................................................................................ 155 2. Đề nghị ................................................................................................................. 156 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 157 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................... 177 PHỤ LỤC 1 MÔI TRƢỜNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NHẬN DIỆN NẤM MỐC, CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ....................................................................................... xxi PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ K T QUẢ KHẢO SÁT ............................................................. xli PHỤ LỤC 3 K T QUẢ THỐNG KÊ ............................................................................lxiii PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH ............................................................................ cxv Chuyên ngành Vi sinh v t h xii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1: Thành phần pectin và mức độ ester hóa của pectin ở một số loại trái cây .......... 21 Bảng 1.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào nấm mốc Aspergillus sp. ...................................................................................................... 28 Bảng 2.1: Các chỉ tiêu, phƣơng pháp phân tích và đo đạc ................................................... 49 Bảng 2.2: Công thức tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch PME ...................................... 50 Bảng 2.3: Giá trị mã hóa và giá trị thực của các nhân tố tƣơng tác đến hiệu quả sinh tổng hợp PME (U/g) .................................................................................................................... 66 Bảng 2.4: Các nghiệm thức khảo sát theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng, áp dụng thiết kế trung tâm phức hợp .............................................................................................................. 67 Bảng 3.1: Số dòng nấm mốc đƣợc phân lập từ vỏ các loại quả giàu pectin ....................... 82 Bảng 3.2: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme pectinase ............................. 89 Bảng 3.3: Kết quả thống kê sự khác biệt đƣờng kính vòng phân giải pectin (D) của các dòng nấm mốc thuộc nhóm đặc hiệu cao với pectinase....................................................... 90 Bảng 3.4: Sự thay đổi đƣờng kính vòng phân giải pectin và hoạt tính PME sinh tổng hợp từ các dòng nấm mốc đặc hiệu với pectinase ........................................................................... 93 Bảng 3.5: Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng nấm mốc đến hiệu quả thu nhận enzyme PME ..................................................................................................................................... 95 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng R1 và So2 đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao................................................................................................................ 97 Bảng 3.7: Thành phần hóa học cơ bản của các nguồn cơ chất lên men ............................ 101 Bảng 3.8: Sự thay đổi hoạt tính PME ở các tỷ lệ kết hợp khác nhau của bã táo ta và vỏ quả cam/bƣởi ............................................................................................................................ 102 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung vào môi trƣờng lên men đến sự thay đổi hoạt tính của PME từ A. niger ............................................................................. 105 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A. niger .................................................................... 107 Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng và nguồn nitrogen bổ sung đến hoạt tính PME từ quá trình sinh tổng hợp A. niger ........................................................................................ 108 Bảng 3.12: Sự thay đổi hàm lƣợng pectin, DE, độ ẩm của canh trƣờng sau khi lên men và pH của dịch trích enzyme sau thời gian nuôi cấy .............................................................. 112 Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của các nhân tố mã hóa đối với phƣơng trình hồi quy ................. 114 Bảng 3.14: Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch đệm citrate và canh trƣờng sau lên men đến hiệu quả thu nhận PME ...................................................................................................... 122 Bảng 3.15: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với (NH4)2SO4 .............. 130 Chuyên ngành Vi sinh v t h xiii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Bảng 3.16: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với NaCl ....................... 131 Bảng 3.17: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với ethanol .................... 132 Bảng 3.18: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với aceton...................... 133 Bảng 3.19: So sánh hiệu quả tinh sạch PME b ng các tác nhân khác nhau ...................... 134 Bảng 3.20: Hiệu quả tinh sạch PME từ A. niger sau quá trình lọc màng .......................... 135 Bảng 3.21: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt PME sinh tổng hợp từ A. niger............................................................................................................................... 141 Bảng 3.22: Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính PME từ A. niger ....................... 142 Bảng 3.23: Ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính PME từ A. niger ...................... 143 Bảng 3.24: Độ cứng tƣơng đối trung bình của khóm do tác động của tiền xử lý với PME nấm mốc và CaCl2 theo các phƣơng thức khác nhau ........................................................ 148 Bảng 3.25: Ảnh hƣởng của hoạt tính PME nấm mốc bổ sung đến sự thay đổi độ cứng tƣơng đối và độ DE của khóm đông lạnh .......................................................................... 150 Bảng 3.26: Ảnh hƣởng của thời gian tiền xử lý nhiệt (ở 50C) đến sự thay đổi độ ester hóa pectin và đặc tính cấu trúc dƣa leo..................................................................................... 152 Bảng PL1.1: Phân biệt một số giống Aspergillus và Penicillium ..................................... xxiv Bảng PL1.2: Cách pha dung dịch đệm citrate .................................................................. xxix Bảng PL1.3: Cách pha dung dịch đệm acetate ................................................................ xxix Bảng PL1.4: Cách pha dung dịch đệm citrate-phosphate .................................................. xxx Bảng PL1.5: Bảng tra nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa bổ sung trong tiến trình kết tủa enzyme và protein ............................................................................................................. xxxi Bảng PL1.6: Chuẩn bị dung dịch đệm CTAB (CTAB buffer) ....................................... xxxiv Bảng PL1.7: Bảng tra lƣợng đƣờng nghịch chuyển ....................................................... xxxix Bảng PL2.1: Hình thái khuẩn lạc của 60 dòng Aspergillus niger đã phân lập trên môi trƣờng MEA và môi trƣờng CZ ........................................................................................... xli Bảng PL2.2: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trƣờng CZ ............ xlv Bảng PL2.3: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trƣờng MEA .......xlvii Bảng PL2.4: Đƣờng kính vòng phân giải pectin (D) của các dòng A. niger ..................... xlix Bảng PL2.5: Hiệu quả thu nhận PME theo khối lƣợng cơ chất ly trích khác nhau ............. lix Chuyên ngành Vi sinh v t h xiv i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME........................................................................... 6 Hình 1.2: Tác dụng của PME trong quá trình làm trong nƣớc quả...................................... 11 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử pectin ........................................................................................ 14 Hình 1.4: Sơ đồ mô tả các cấp độ cấu trúc của thực phẩm nguồn gốc thực vật .................. 15 Hình 1.5: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao ............................................. 15 Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn các chuyển hóa của pectin dƣới tác động của enzyme thủy phân ảnh hƣởng đến cấu trúc tế bào ............................................................................................. 16 Hình 1.7: Hình thái Aspergillus sp....................................................................................... 23 Hình 1.8: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở sinh vật nhân thật .............................. 25 Hình 1.9: Các phƣơng pháp thu chế phẩm enzyme ............................................................. 36 Hình 2.1: Nguyên liệu khóm và cách chuẩn bị mẫu thí nghiệm .......................................... 47 Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................. 53 Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn nấm mốc .................................. 54 Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5 – Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME ........................................................................................................ 59 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 8 - Ảnh hƣởng của việc kết hợp bã táo và vỏ quả cam/bƣởi đến quá trình sinh tổng hợp PME ở điều kiện lên men SSF ............................................................ 62 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 9a - Ảnh hƣởng của từng thành phần khoáng ................ 63 bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính của PME đƣợc tổng hợp bởi A. niger .................................. 63 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 13 - Ảnh hƣởng tƣơng tác của các điều kiện lên men đến hiệu quả thu nhận PME ........................................................................................................ 68 Hình 2.8: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung dịch muối (NH4)2SO4/NaCl ................................ 73 Hình 2.9: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung môi hữu cơ .......................................................... 74 Hình 3.1: Mặt trên của mẫu phân lập M3 ............................................................................ 82 Hình 3.2: Mặt dƣới của mẫu phân lập M3 .......................................................................... 82 Hình 3.3: Hình dạng mặt trên của khuẩn lạc ...................................................................... 83 Hình 3.4: Hình dạng mặt dƣới của khuẩn lạc ..................................................................... 83 Hình 3.5: Đặc điểm khuẩn lạc của dòng S2 và G1 khi đƣợc cấy 3 điểm trên môi trƣờng CZ ............................................................................................................................................. 84 Hình 3.6: Dòng A. niger đối chứng (Klich, 2002) ............................................................... 85 Hình 3.7: Dòng nấm mốc H2 trên môi trƣờng MEA ........................................................... 85 Hình 3.8: Sợi nấm có vách ngăn của dòng So2 ở vật kính 4X ............................................. 86 Hình 3.9: Hình ảnh dòng So2 ở vật kính 4X và 10X ........................................................... 86 Chuyên ngành Vi sinh v t h xv i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Hình 3.10: Hình ảnh bào tử dƣới kính hiển vi của dòng A. niger........................................ 86 Hình 3.11: Thể bình còn non (phát triển 1 tầng) dòng So2 .................................................. 87 Hình 3.12: Hai vòng thể bình và bào tử của dòng So2......................................................... 87 Hình 3.13: Mặt trên vòng phân giải pectin của dòng nấm So2 ........................................... 91 Hình 3.14: Mặt dƣới vòng phân giải pectin của dòng nấm So2 ........................................... 91 Hình 3.15: Mẫu đối chứng nƣớc .......................................................................................... 91 Hình 3.16: Mẫu đối chứng A. niger V .................................................................................. 91 Hình 3.17: Vòng phân giải pectin trên môi trƣờng pectin - agarose sau 24 giờ ủ ở 37°C và nhận diện với thuốc thử CTAB 1% ..................................................................................... 93 Hình 3.18: Ảnh hƣởng của sự kết hợp các dòng nấm mốc khác nhau đến sự thay đổi vòng phân giải pectin trên môi trƣờng pectin - agarose ............................................................... 95 Hình 3.19: Phổ điện di của sản phẩm PCR của các mẫu nấm đƣợc khuếch đại .................. 98 Hình 3.20: Biểu đồ biểu diễn trình tự của một đoạn RNA gene của 4 mẫu nấm .............. 100 Hình 3.21: Tỷ lệ tƣơng đồng về gene của dòng nấm So2 và dòng A. niger NBL, BR 28s ribosomal RNA gene hay An03c0110 ............................................................................... 100 Hình 3.22: Đồ thị so sánh ảnh hƣởng của các loại khoáng bổ sung tối ƣu đối với hiệu quả gia tăng hoạt tính PME từ A. niger .................................................................................... 106 Hình 3.23: Ảnh hƣởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH môi trƣờng lên men đến hoạt tính PME từ quá trình sinh tổng hợp A. niger ........................... 110 Hình 3.24: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME thu nhận từ A. niger .............. 111 Hình 3.25: Đồ thị tƣơng quan giữa hoạt tính PME xác định thực nghiệm và tính toán theo phƣơng trình hồi quy ......................................................................................................... 115 Hình 3.26: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của từng cặp nhân tố đến hiệu quả thu nhận PME ........................................................................................................................................... 116 Hình 3.27: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và pH môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận ........................................................ 117 Hình 3.28: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng quan của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm bổ sung và nhiệt độ ủ đến hoạt tính PME thu nhận .......................................................... 117 Hình 3.29: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và độ ẩm môi trƣờng ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận ................................................... 117 Hình 3.30: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của nhiệt độ ủ và pH ban đầu của môi trƣờng đến hoạt tính PME thu nhận .......................................................................... 117 Hình 3.31: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác của pH và độ ẩm ban đầu của môi trƣờng lên men đến hoạt tính PME thu nhận .................................................................... 118 Hình 3.32: Đồ thị đƣờng đồng điểm biểu diễn tƣơng tác giữa nhiệt độ ủ và độ ẩm ban đầu của môi trƣờng lên men đến hoạt tính PME thu nhận ...................................................... 118 Chuyên ngành Vi sinh v t h xvi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Hình 3.33: Ảnh hƣởng của pH dung dịch ly trích đến hoạt tính PME .............................. 121 Hình 3.34: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian ly trích đến hoạt tính PME ................... 125 Hình 3.35: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao) theo thời gian bảo quản ...................... 127 ở nhiệt độ lạnh (4°C).......................................................................................................... 127 Hình 3.36: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao) theo thời gian bảo quản ...................... 127 ở nhiệt độ lạnh đông (-18°C) ............................................................................................. 127 Hình 3.37: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu PME từ A. niger ..................... 136 Hình 3.38: Ảnh hƣởng của nồng độ pectin đến hoạt tính PME từ A. niger....................... 137 Hình 3.39: Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đƣờng đồng điểm biểu thị sự tƣơng quan giữa pH và nhiệt độ đến hoạt tính PME từ A. niger .................................................................. 139 Hình 3.40: Phƣơng trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của PME từ A. niger ........................... 140 Hình 3.41: Quy trình tổng hợp chế phẩm PME kỹ thuật từ A. niger ................................. 145 Hình 3.42: Sự thay đổi độ ester hóa của pectin trong khóm do tác động của tiền xử lý với PME nấm mốc và CaCl2 theo các phƣơng thức khác nhau ............................................... 146 Hình 3.43: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ cứng tƣơng đối (H/Ho) của dƣa leo muối chua theo các tỷ lệ PME và CaCl2 bổ sung trong dịch chần ở 50C, 30 phút ............................ 153 Hình PL1.1: Hình thái đại thể và vi thể A. niger ............................................................... xxv Hình PL1.2: Bào tử của A. awamori (trái) và A. foetidus (phải) ...................................... xxvi Hình PL1.3: Khuẩn lạc 7 ngày của dòng nấm mốc trên môi trƣờng định loại đặc trƣng: A. foetidus (h, CZ), A. niger (i, MEA) và A. awamori (j, CZ) ............................................ xxvii Hình PL2.1: Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm đến hoạt động của PME nấm mốc ............. lx Hình PL2.2: So sánh hiệu quả cải thiện độ cứng của khóm do tác động của quá trình tiền xử lý với PME ngoại bào có nguồn gốc khác nhau ............................................................lxii Hình PL3.1: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của dòng nấm mốc đến khả năng thu nhận PME thông qua đƣờng kính vòng phân giải pectin.......................................... lxviii Hình PL3.2: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn sự thay đổi hoạt tính PME của các dòng nấm mốc khác nhau .................................................................................................................... lxx Hình PL3.3: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng kết hợp 4 dòng nấm mốc đặc hiệu đến khả năng thu nhận PME thông qua đƣờng kính vòng phân giải pectin .....................lxxii Hình PL3.4: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của sự kết hợp 4 dòng nấm mốc đặc hiệu đến hoạt tính PME ............................................................................................. lxxiv Hình PL3.5: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp R1 và So2 đến hiệu quả thu nhận PME dựa trên đƣờng kính vòng phân giải pectin................................ lxxv Hình PL3.6: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp R1 và So2 đến hoạt tính PME .................................................................................................................. lxxvi Hình PL4.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... cxv Chuyên ngành Vi sinh v t h xvii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh rường ĐH Cần hơ 2008 - 2012 Hình PL4.2: Một số hình ảnh chuẩn bị cơ chất và lên men SSF sinh tổng hợp PME ...... cxvi Hình PL4.3: Các mẫu dƣa leo muối chua ......................................................................... cxvi Hình PL4.4: Một số công đoạn tiền xử lý và cải thiện đặc tính cấu trúc khóm đông lạnh ......................................................................................................................................... cxvii Chuyên ngành Vi sinh v t h xviii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h