Tài liệu Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây ngải cứu (kl06024)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 NINH THỊ NHƢ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. DƢƠNG MINH LAM HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dƣơng Minh Lam đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ. Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi. Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Tác giả Ninh Thị Như Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của các tác giả khác. Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Tác giả Ninh Thị Như Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................ 1 2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2 4. Ý nghĩa ............................................................................................................... 2 5. Điểm mới của đề tài ........................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn ............................................................................ 3 1.1.1. Vị tr 112 ạ khuẩn trong sinh giới ............................................................. 3 h n oại ạ khuẩn...................................................................................... 3 1.1.2.1. Lƣợc sử phân loại xạ khuẩn ...................................................................... 3 1.1.2.2. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn ........................................ 5 1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn..................................................................... 9 1 2 1 Đặ điểm hình thái c a xạ khuẩn................................................................ 9 1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn ...................................................................................... 10 1.2.3 Đặ điểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn.................................................. 10 1.2.4. Sinh sản c a xạ khuẩn ............................................................................... 12 1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn ......................................................................... 12 1.3.1. Khái niệm chất kháng sinh ........................................................................ 12 1 3 2 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh ........................................................ 12 1.3.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn ............................................... 14 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ....................... 15 1.3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy ......................................................... 15 1.3.4.2. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên men .................................... 16 1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về kháng sinh ................ 17 1.5. Cây ngải cứu.................................................................................................. 18 CHƢƠNG 2. V T LIỆU V HƢƠNG H NGHI N CỨU ....................... 20 2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật............................................................................. 20 2.1.1. Vi sinh vật .................................................................................................. 20 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 20 2.2. Môi trƣờng .................................................................................................... 21 2 2 1 Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn ........................... 21 2 2 2 Môi trường thử hoạt tính kháng sinh ........................................................ 21 2.3. hƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 21 231 hương pháp ấy mẫu ............................................................................... 21 2.3.2. Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn .................................................................. 22 233 hương pháp qu n sát hình thái ạ khuẩn ............................................... 23 234 hương pháp á định hoạt tính kháng sinh ............................................ 23 235 hương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học ............................ 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N ....................................................... 26 3.1. Phân lập xạ khuẩn trên vùng rễ cây Ngải cứu .............................................. 26 3.2. Xác định khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn ........................................ 30 3.3. Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã phân lập ........ 32 3.3.1. Nghiên cứu đặ điểm khuẩn lạc các ch ng xạ khuẩn đã ph n ập........... 32 3.3.2. Nghiên cứu hình dạng cuống sinh bào tử c a các ch ng xạ khuẩn NR34 và ND2 đã ph n ập .................................................................................. 35 3.3.3. Nghiên cứu sắc tố tan c a ch ng xạ khuẩn đã ph n ập .......................... 36 KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 42 CÁC TỪ VIẾT TẮT m-ADP : meso-Diaminopimelic Acid CFU : Colony Forming Unit CKS : Chất kháng sinh DNA : Deoxyribonucleic Acid HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh ISP : International Streptomyces Project VSV : Vi sinh vật VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định VK : Vi khuẩn RNA : Ribonucleic Acid rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid PG : Peptido Glycan G+ : Gram dƣơng G- : Gram âm DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu ........ 27 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu ............................... 30 Bảng 3.3. Kết quả thống kê hoạt tính kháng sinh các chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây Ngải cứu ........................................................... 31 Bảng 3.4. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu .............. 33 Bảng 3.5. Sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ...................................... 34 Bảng 3.6. Đặc điểm sắc tố tan của chủng xạ khuẩn nghiên cứu ..................... 37 Hình 1.1.a. Ngải cứu .......................................................................................... 19 Hình 1.1.b. Vùng rễ Ngải cứu ............................................................................ 19 Hình 3.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn......................................................................... 28 Hình 3.2. Một số chủng xạ khuẩn phân lập .................................................... 29 Hình 3.3. Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu ...................................................................................... 31 Hình 3.4. Nuôi cấy 2 chủng NR34 và ND2 ................................................... 35 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng ND2, NR34 ..................... 36 Hình 3.6. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc .................... 39 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho ngƣời, từ lâu đã là mơ ƣớc của nhân loại. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra Penicillin - một CKS có nguồn gốc từ nấm Penicillium. Nhƣng phải hơn 10 năm sau, vào năm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công đƣợc Penicillin. Kể từ đó, enicillin mới chính thức đƣợc dùng để chữa bệnh cho ngƣời, động vật và sử dụng trong nhiều ngành khác. Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS có cấu trúc tƣơng tự nhau. Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần đƣợc quan tâm nhiều hơn. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm nhƣ Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptospor ngium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học nhƣ gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất trong tự nhiên. Dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho ngƣời, động vật. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, từ xu hƣớng nghiên cứu trên thế giới hiện nay và cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng phong phú của vùng rễ cây Ngải cứu tại Xuân Hòa, Vĩnh húc, tôi thực hiện đề tài: “ h n ập và tuyển chọn một số ch ng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây Ngải cứu” Ninh Thị Như Quỳnh 1 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập và thuần chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất, mẫu rễ cây Ngải cứu khu vực Xuân Hòa, Vĩnh húc. 3.2. Kiểm tra HTKS của các chủng xạ khuẩn đã phân lập, lựa chọn ra các chủng có HTKS cao. 3.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sắc tố tan các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc. 4. Ý nghĩa 4.1. Ý nghĩa lí luận Góp phần đem lại cho con ngƣời những hiểu biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Đề tài cho phép hiểu rõ hơn về vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng đất, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, ứng dụng các chủng xạ khuẩn này vào trong đời sống (trong y tế, chăn nuôi). Từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao này có thể tạo ra các chế phẩm thuốc kháng sinh phục vụ cho chữa bệnh, y tế… 5. Điểm mới của đề tài Tuyển chọn đƣợc 2 chủng ND2 và NR34 cho hoạt tính kháng sinh cao hơn các chủng còn lại để tiếp tục nghiên cứu. Ninh Thị Như Quỳnh 2 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn 1.1.1. Vị tr ạ khuẩn trong sinh giới Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật Gram+ lớn trong giới Bacteria. Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn đƣợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và nhóm xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu. Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nhƣ họ Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài nhƣ họ Streptomycetaceae [7]. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã đƣợc công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và đƣợc xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Bộ xạ khuẩn gồm Permatophilaceae, 10 họ: Actinomycetaceae, Frankiaceae, Actinoplanaceae, Micromonosporaceae, Thermonosporaceae, Micobacteriaceae, Mycobacteriaceae, Norcarddiceae, Streptomycetaceae. Trong đó Streptomycetaceae là họ xạ khuẩn có hệ sợi phát triển mạnh và đƣợc nghiên cứu khá kỹ. ạ ạ khuẩn 1 1 2 1 Lược sử phân loại xạ khuẩn Trƣớc thế kỉ XIX, xạ khuẩn đƣợc xếp vào giới nấm (Fungi). Về sau các nghiên cứu cho thấy chủng có nhân nguyên thủy, kích thƣớc bề ngang nhỏ nhƣ vi khuẩn nên ngƣời ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria). Fosters là ngƣời đầu tiên phân lập một số xạ khuẩn có tuyến mắt của ngƣời và đƣợc Jonh miêu tả năm 1874. Đến năm 1977, Harze mô tả đầu tiên một loại Ninh Thị Như Quỳnh 3 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, đƣợc phân lập từ bệnh nấm sao của trâu bò và đặt tên là Actinomyces bovis. Năm 1914, Krainski lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân loại các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomycetes. ng coi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là mấu chốt cơ bản trong nguyên tắc phân loại. Waksman và Curtis (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cá thể và đƣa ra một số loài mới có ý nghĩa. Năm 1926, Millard và Burr tìm ra 17 loài trong đó có 7 loài còn tồn tại đến bây giờ. Jensen (1930 - 1931) tìm ra 2 loài mới, đến năm 1934 Dutche tìm ra 3 loài mới [12]. Baldacci và cộng sự đã nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1930 - 1953 đã công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian khác. Waksman và Henrici (1953) đã đƣa ra một hệ thống phân loại và đến năm 1961 đã đƣợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đƣợc xếp vào nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Hệ thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng bào tử, chuỗi bào tử... Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới. Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn đƣợc phân thành 6 họ gồm 26 chi. Năm 1957, Gause và cộng sự đã phân bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này đƣợc chỉnh lý và tái bản năm 1983. Trong những năm gần đây, hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày càng nhiều nhƣ hệ thống phân loại của rihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Để thống nhất cách mô tả, IS đã nêu lên các phƣơng pháp và môi trƣờng mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966). Ninh Thị Như Quỳnh 4 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2.2. Một số phương pháp trong ph n oại xạ khuẩn Dựa vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật, số lƣợng xạ khuẩn đƣợc mô tả ngày càng nhiều và chính xác trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học... Để phân loại nhanh chóng và chính xác các xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp phân loại số (Numberical taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh ( hylogeny taxonomy). Tuy nhiên, vì nhiều lý do và trong thực nghiệm, ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử. Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhƣng có thể gộp thành hai hệ thống phân loại chính sau: Hệ thống phân loại dựa chủ yếu vào đặc điểm hình thái để phân loại nhóm lớn nhƣ họ, giống. Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa để phân loại [13]. Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sinh lý nhƣ màu sắc hệ sợi... để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài. Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause... các tác giả đều thống nhất lấy đặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài.  Đặ điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ngƣời ta chia xạ khuẩn làm 4 nhóm chính: Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành HSKS, HSCC. Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hƣớng vuông góc với nhau tạo thành cấu trúc tƣơng tự nang bào tử. Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi. Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ T, V và thƣờng không có hệ sợi. Ninh Thị Như Quỳnh 5 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Theo tài liệu của IS đƣợc nêu bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969 và 1972) và trong cuốn “Bergey’s M nu đƣợc xuất bản lần thứ 8, ngƣời ta chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu: Kiểu S: Type “Spira - chuỗi bào tử xoắn. Kiểu SRA: Type “Spira- Rectinaculum- Apertum - chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn. Kiểu SRF: Type “Spirina - Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng. Kiểu RA: Type “Rectinaculum - Apertum - chuỗi bào tử có móc có khóa. Kiểu RA - RF: Type “Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis - chuỗi bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn. Kiểu RF: Type “Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử thẳng đến lƣợn sóng. Trƣớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đƣợc coi là dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, xạ khuẩn là vi sinh vật rất dễ biến dị tự nhiên dẫn đến sự khác nhau về kiểu hình của cùng một loài hay giống nhau về kiểu hình giữa các loài khác nhau. Vì vậy, ngày nay trong phân loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nhƣ đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.  Đặ điểm hóa phân loại hƣơng pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định lƣợng các thành phần hóa học trong tế bào vi sinh vật để phân loại, chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: Type thành tế bào: dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần dây nối peptide, đƣờng trong thành tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế bào. Type Peptidoglucan (PG) Acid mycolic Acid béo Ninh Thị Như Quỳnh 6 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Menaquinon Type photpholipid Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Theo hƣớng phân loại hóa sinh, ngƣời ta chia thành tế bào thành 4 dạng sau: Type I: thành tế bào có L - ADP và glixin Type II: thành tế bào có m - ADP và gilixin Type III: thành tế bào có m - ADP Type IV: thành tế bào có m - AD , đƣờng arabinose, galactose Trong type peptidoglucan ngƣời ta chia xạ khuẩn thành: Type Type phụ A (3-4) A1 Liên kết peptide trực tiếp. A2 Chuỗi peptit bên. A3 Glycerol hoặc các acid monocacboxylic A4 Acid dicacboxylic B1 Acid đƣợc diamine hóa B2 Các acid amin đƣợc diamine hóa B (2-4) Cầu liên kết  Phân loại số hƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật trong một số lớn các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau theo từng đôi một, hiện nay có một số công thức tính hệ số giống nhau. Trong đó công thức của Sokal và Mitchener (SSM) và công thức của Jaccard (SJ) đƣợc sử dụng nhiều nhất. Ninh Thị Như Quỳnh 7 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Công thức của Sokal và Michener (SSM) SSM (AB)= (Ns + + Ns-)* 100/ (Ns + + Ns- + Nd) Trong đó: SSM (AB) : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%). Ns + :Số các tính trạng giống nhau. Nd : Số các tính trạng khác nhau. Ns- :Số các tính trạng đối lập nhau. Công thức của Jacard (SJ) SJ(AB)= Ns * 100/ (Ns + Nd) Trong đó: SJ(AB) : mức độ giống nhau giữa hai ch ng A, B (%). Ns: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) c a hai ch ng so sánh. Nd : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương t nh a ch ng này và âm tính c a ch ng kia). Kết quả của sự so sánh số học đƣợc biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc mức độ giống nhau mà các vi sinh vật đƣợc xếp vào các nhóm. Bằng phƣơng pháp phân loại số học Streptomyces đƣợc chia ra làm các nhóm lớn (major clusters), nhóm nhỏ (minor clusters) và các nhóm đơn thành viên (single member clusters).  Nghiên cứu về h ng oại phát sinh Nhờ sự sắp xếp chủng loại phát sinh mà các vi sinh vật đƣợc sắp xếp vào hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn. Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử DNA, RNA, protein mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotide của rRNA 16S. Mức độ giống nhau giữa hai cá thể so sánh càng lớn thể hiện mối quan hệ giữa chúng càng chặt ch . Ninh Thị Như Quỳnh 8 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn Đặ đ ểm hình thái c a xạ khuẩn Tùy loại môi trƣờng mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi trƣờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi trƣờng nuôi cấy mà kích thƣớc màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau nhƣ đỏ, da cam, hồng, trắng, vàng, nâu, xám... Khuẩn lạc xạ khuẩn có thƣờng chắc, xù xì, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và có cấu trúc 3 lớp: lớp ngoài có cấu trúc sợi bện chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc tƣơng đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn có hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Đƣờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi theo trong khoảng 0,02 - 0,1 μm đến 2 - 3 μm. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen... HSCC có thể sinh sắc tố tan trong nƣớc hoặc tan trong dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thƣờng là các chuỗi bào tử xoắn, lƣợn sóng, thẳng, vòng... Đây là đặc điểm khá quan trọng để phân loại xạ khuẩn [1]. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình trụ... Cấu trúc bề mặt bào tử có thể nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy). Hình dạng, kích thƣớc, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để định loại xạ khuẩn [1]. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trƣờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy. Trên bề mặt môi trƣờng hay dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men đƣợc khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông hoặc cặn xốp. Nhƣng thƣờng gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trƣờng, kích thƣớc từ 0,1 mm đến 3 mm. Ninh Thị Như Quỳnh 9 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu tạo tƣơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật Gram+. Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi và bảo vệ tế bào, đƣợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glycopeptide gồm các gốc NAcetylGlucosamine liên kết với N- AcetylMuramic. Căn cứ vào kết cấu hóa học của thành tế bào xạ khuẩn có thể chia thành thành 4 nhóm sau: Nhóm 1 (Type I): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin). Gồm các chi Streptomyces, Norcarsioider... Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin. Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella... Nhóm 3 (Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora... Nhóm 4 (Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đƣờng araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium... Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau, có ít vách ngăn ngang. Giống nhƣ vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân. Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram+. Màng tế bào chất dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tƣơng tự màng tế bào chất của vi khuẩn. Khi mới hình thành, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin) [8]. 3 Đặ đ ểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon, còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt...để là nguồn nitơ. Ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ Ninh Thị Như Quỳnh 10 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 25 – 30oC. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trƣờng pH là 6.8 – 7.0, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm [17]. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram+, đặc biệt khác với các vi sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này khá thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose...) [16]. Đặ điểm c a chi xạ khuẩn Streptomyces Chi Streptomyces có số lƣợng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS, HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thƣờng không lớn, đƣờng kính khuẩn lạc từ 1- 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm nƣớc. Chuỗi bào tử đƣợc tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể thẳng, lƣợn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có thể lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trƣờng. Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo tế bào của vi khuẩn Gram+, là vi sinh vật hiếu khí, dị dƣỡng. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 25 – 30oC, pH tối ƣu là 6.5 - 8.0. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và xạ khuẩn ƣa ẩm). Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau: Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin Type Peptidoglycan Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng ít và số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso Ninh Thị Như Quỳnh 11 K36B - Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9) Dạng photpholipit : PII Không có axit mycolic [23]. 1.2.4. Sinh sản c a xạ khuẩn Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử. Bào tử đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thƣớc và hình dạng khác nhau. Có loài dài tới 100 - 200 nm, có loài chỉ dài 20 - 30 nm. Có cấu trúc theo hình lƣợn sóng. Có loài hình lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác nhau mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm. Bào tử đƣợc hình thành từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (Segmentation). Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trƣờng phát triển thành hệ khuẩn ty [11]. 1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.3.1. Khái niệm chất kháng sinh Theo định nghĩa truyền thống thì chất kháng sinh (còn gọi là trụ sinh) là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thƣờng là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo định nghĩa hiện nay, kháng sinh đƣợc hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và nồng độ thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (Nduka, 2007). 1.3.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh Theo định nghĩa của Outchinnikov: chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đƣờng hóa học có Ninh Thị Như Quỳnh 12 K36B - Sinh