Tài liệu Phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------------------------- NGUYỄN HUYỀN TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN CHÍ THUẬN Học viên: NGUYỄN HUYỀN TRANG Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Chí Thuận Trưởng phòng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoàng Uyên, người đã giúp đỡ và tận tình chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Huyền Trang Bảng chữ viết tắt APW Alkaline Pepton Water bp Base pair CFU Colony-Forming Unit DNA Deoxyribonucleic acid IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside kb Kilobase pair LB Luria - Bertani NB Nutrient broth PCA phenazine - 1carboxylic PCN Pyocyanin PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SAM S-adenosylmethionine TCA Trichloroacetic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU................................................................................................................... 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ......................................... 6 1.1.1. Phân loại........................................................................................................ 6 1.1.2 Đặc điểm ........................................................................................................ 7 1.1.3. Cấu trúc gen .................................................................................................. 9 1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ....................... 10 1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống........................................... 10 1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn ............................... 10 1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .................................... 11 1.2. Hoạt chất pyocyanin....................................................................................... 12 1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen .......................................... 12 1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin ........................................................ 13 1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin ............................................................ 14 1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi............................................... 15 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi ..................... 15 1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm ................................................ 15 1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh:......................................................................... 15 1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ..................................................................................... 17 1.3.3. Các phương pháp phòng ngừa và điều trị ................................................... 18 1.3.2.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp ........................................................... 18 1.3.2.2. Điều trị................................................................................................... 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................... 21 1 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 21 2.1.2 Thiết bị ......................................................................................................... 21 2.1.3 Hóa chất ....................................................................................................... 22 2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: ................................................................ 22 2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử:............................................. 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 25 2.2.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 25 2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A..................... 25 2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn................. 26 2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn.......................... 26 2.2.1.4. Phương pháp lập kháng sinh đồ ............................................................ 27 2.2.1.5. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: ............................................... 27 2.2.1.6. Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32]....... 28 2.2.1.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn ..................................................................... 28 2.2.1.8. Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp: ............................... 28 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 29 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 29 2.2.2.2. Phương pháp PRC khuếch đại gen........................................................ 30 2.2.2.3. Phương pháp điện di.............................................................................. 32 2.2.2.4. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR ................................................. 33 2.2.2.5. Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) ................................. 34 2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen ............................................................... 36 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 38 3.1 Kết quả phân lập và xác định P. aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật 38 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. aeruginosa trên môi trường King A ............ 38 2 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 3.1.2 Kết quả nhuộm Gram................................................................................... 39 3.1.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính enzyme ........................................................ 40 3.1.4. Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh ..................................................... 41 3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử ..... 42 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................. 42 3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA): ........................................ 43 3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA ....................................................................... 44 3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA ............................ 45 3.2.5. Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn .......................... 47 3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của P.aeruginosa PS39 ................................................................................................. 51 3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn và nồng độ hoạt chất. ............................................................................................ 51 3.3.2. Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt chất PCN ............................................................................................................... 54 3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp ..................................... 56 3.3.4. Kết quả xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro ............................................................................................................................... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 62 Phụ lục 1 ................................................................................................................. 74 Phụ lục 2 ................................................................................................................. 75 3 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm phòng và hạn chế các bệnh do nhiễm khuẩn ngày càng trở nên phổ biến. Vì vậy, đề kháng kháng sinh do vi sinh vật đã tăng lên rất nhiều, nhưng số kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn. Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của người nuôi mà còn của cả các nhà quản lý sức khỏe cộng đồng bởi nó không chỉ làm giảm hiệu quả điều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người. Mặt khác, vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi thủy sản nên các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên, do các chất này không gây đề kháng khuẩn và tồn dư trong vật nuôi cũng như ảnh hưởng tới môi trường. Pseudomonas sp là vi khuẩn phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Chúng là một trong những vi sinh vật có giá trị thương mại và công nghệ sinh học. Trong các chế phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotic kiểm soát sinh học đối với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loại sắc tố là các hợp chất có tính kháng khuẩn. Trong đó, các hợp chất phenazine do Pseudomonas sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng. Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyanin PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) và phenazine1-carboxamide. Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằng chloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh. Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: 4 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66]. Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tính kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V. parahaemolyticus , V. vulnificus , V. alginolyticus , V. fluvialis , V. Proteolyticus, V. harveyi và do đó nó có thể được ứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản. Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằm mục đích phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio gây bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tôm nuôi ở Việt Nam. Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là: 1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi. 2. Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn. 3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn. 5 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ ở động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Một trong số đó là loài Pseudomonas aeruginosa. Hình 1.1: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường King A. 1.1.1. Phân loại Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria 6 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Pseudomonadales Họ (familia) Pseudomonadaceae Chi (genus) Pseudomonas Loài (species) Pseudomonas aeruginosa 1.1.2 Đặc điểm Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. P. aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula) [13]. Tế bào của chúng có dạng hình que, dài 1-1,5µm, rộng 0,5-1µm. P. aeruginosa sử dụng hô hấp hiếu khí (oxy) làm sự trao đổi chất tối ưu mặc dù chúng cũng có thể hô hấp kị khí trên nitrat hoặc nhận điện tử khác thay thế. P. aeruginosa có thể chuyển hóa một loạt các phân tử hữu cơ, bao gồm các hợp chất hữu cơ như benzoate, điều này đã giúp P. aeruginosa trở thành một vi sinh vật rất phổ biến vì nó có thể được tìm thấy trong môi trường như đất, nước, con người, động vật, thực vật, nước thải và các bệnh viện [59]. Trong tất cả các hệ sinh thái thủy vực có chứa hàm lượng oxy hòa tan cao nhưng chất dinh dưỡng thực vật thấp, P. aeruginosa là sinh vật chiếm ưu thế và điều này biến nó trở thành loài sinh vật phong phú nhất trên trái đất. Pseudomonas sp có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố: - Pyocyanin: là sắc tố phenazine, có màu xanh da trời, tan trong nước và tan trong chloroform, 96% số chủng P. aeruginosa có khả năng sinh sắc tố này. Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí, dễ dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường hoặc 7 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang dùng môi trường King A để phát hiện sinh sắc tố. Chỉ có P. aeruginosa sinh sắc tố pyocyanin. - Pyoverdin (còn gọi là fluorescent): sắc tố có màu xanh lục, tan trong nước, nhưng không tan trong chloroform. Môi trường King B được sử dụng để phát hiện sắc tố pyoverdin. Ngoài P. aeruginosa còn có các vi khuẩn như P. fluorecens, P. pytida, P. veroni, P. monteilla cũng có khả năng sinh sắc tố này. - Pyorubin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh ra sắc tố này. - Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng P. aeruginosa sinh sắc tố này. Tuy nhiên không phải tất cả các chủng Pseudomonas đều sinh sắc tố, khoảng 5- 10% số chủng Pseudomonas không sinh sắc tố. King, Ward, và Raney đã tìm ra môi trường thạch Pseudomonas Agar P (môi trường agar King A) để tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường agar King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein.[58] P. aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy in vitro. Các dấu hiệu nhận biết sự có mặt của P. aeruginosa trong lâm sàng thường bao gồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại nhiệt độ 42°C. P. aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon, và gây ra sự ăn mòn vi thể.[14] Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn được xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat 8 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất [23, 24, 41, 94, 95]. 1.1.3. Cấu trúc gen P. aeruginosa có kích thước bộ gen khoảng 5,2 – 7.000.000 cặp bazơ với 65% nucletide là loại Guanine và Cytosine, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các phần phụ khác nhau. Bộ gen lõi của các dòng P. aeruginosa phần lớn là giống nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định những tính trạnh nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng thể O. Những đoạn gen quy định các tính trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và khoảng một phần ba trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay mRNA. Tính đa dạng di truyền của vi khuẩn được hình thành bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các họ đảo gen pKLC102/PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly. Các đảo gen riêng lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài. [25, 93]. Hình1.2: Gen P. aeruginosa PA01 [77] P. aeruginosa có một nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất và siêu xoắn trong tế bào chất [33]. Nó cũng mang rất nhiều plasmid nhiễm sắc thể huy động, điều này 9 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang rất quan trọng đối với tập tính sống của sinh vật. Ví dụ như các plasmid, TEM, OXA, và PSE được mã hóa để sản xuất betalactamase, chất cần thiết cho sức đề kháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh [28]. 1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác định các vi khuẩn nói chung. Trong phương pháp vi sinh vật học, người ta nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các loài vi khuẩn. Đặc điểm hình thái của một loài vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào (hình dạng, nội bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc (màu sắc, đường kính, hình dáng). Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sự phát triển của các vi sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn năng lượng, hay các điều kiện môi trường khác. Tiếp đó là sự phát triển của chúng trên các kháng sinh khác nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổi chất… 1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1]. Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. 10 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít, do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [50]. 1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng làm suy giảm các hydrocacbon thơm như methylbenzene - những sản phẩm của ngành công nghiệp dầu khí và thường được sử dụng làm dung môi cho sơn men và sơn cũng như trong sản xuất thuốc và hóa chất. Methylbenzene được coi là chất gây ô nhiễm môi trường đang hiện diện trong không khí, đất và trên bề mặt nước [70]. P. aeruginosa có thể phá vỡ toluene, hình thức đơn giản nhất của methylbenzene. P. aeruginosa thoái hóa toluene thông qua quá trình oxy hóa của các nhóm methyl cho aldehyde, rượu và một acid, sau đó được chuyển đổi sang catechol (1,2-dihydroxybenzene). Do đó, P. aeruginosa có thể được sử dụng trong kiểm soát ô nhiễm [51]. P. aeruginosa cũng được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Vi khuẩn P. aeruginosa giúp gia tăng sức 11 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang khỏe và hệ miễn dịch của tôm bạc gân Penaeus latisulcatus khi cho tôm ăn với liều lượng 105 CFU/ml. Vi khuẩn P. aeruginosa YC58 cũng liên kết hoạt động với hệ vi sinh của ấu trùng hàu Cortez, C. Corteziensis, giúp gia tăng tỷ lệ sống và tăng trưởng của hàu ngọc Pinctada mazatlanica. Ngoài ra, khi kết hợp vi khuẩn P. aeruginosa và B. cepacia cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của điệp N. subnodosus[97]. 1.2. Hoạt chất pyocyanin 1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trình nuôi cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tố nâu, Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khả năng kháng khuẩn. Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tự nhiên như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó được chuyển đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuối cùng đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37]. Việc sinh tổng hợp phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42, 43, 45, 46]. Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thành phenazine. Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểm phân nhánh cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62]. Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Các sắc tố pyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine. Pyocyanin được kết tinh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine. Trong quá trình tổng hợp pyocyanin, bảy gen của P. aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC, D, E , F, G , M và S. Locus sinh tổng hợp phenazine đã được tìm thấy trong tất cả loài, phzM và phzS là các gen chịu trách nhiệm chính để chuyển đổi phenazine -112 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang carboxylic acid thành pyocyanin. Có hai bước được cho là tham gia vào quá trình tổng hợp pyocyanin từ PCA. Bước đầu tiên được xúc tác bởi các enzyme phzM, SAdenosylmethionine (SAM) methyltransferase, trong đó PCA được chuyển thành 5-methyl phenazine-1-carboxylic acid betaine bằng cách chuyển một nhóm methyl vào các nguyên tử nitơ của phenazine vòng phân nửa. Bước thứ hai được xúc tác bởi các enzyme phzS, FAD-monooxygenase tham gia vào phản ứng khử carboxyl hydroxylative 5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine để tạo thành pyocyanin [67]. 1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin Pyocyanin là một chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng vi khuẩn của pyocyanin đã được báo cáo kể từ năm 1940 [92]. Các sắc tố ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Escherichia coli và được đặt tên là Colicin. Các phần protein được giải phóng khi chiết dịch của các vi khuẩn có tính chất của pyocyanin [96]. Hình thức tinh khiết của pyocyanin cho thấy tùy thuộc vào nồng độ của pyocyanin mà chúng cho tác dụng diệt khuẩn khác nhau [18]. Cơ chế ức chế vi khuẩn phát triển của pyocyanin đã được nghiên cứu và kết luận rằng pyocyanin tương tác với chuỗi hô hấp màng tế bào dẫn đến ức chế việc thực hiện hoạt động trao đổi chất của các tế bào vi khuẩn [19]. Đối với E. coli, pyocyanin là nguyên nhân gây cạn kiệt nguồn cung cấp oxy cho các tế bào, sản xuất H2O2 và cũng chuyển hướng dòng chảy điện tử, gây ra độc tính đối với tế bào E. Coli [38]. Pyocyanin ảnh hưởng tiêu cực đến cơ chế vận chuyển tích cực của một số sinh vật [19]. P. aeruginosa có trong đờm của bệnh nhân xơ nang (CF) ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus. Tính kháng sinh của pyocyanin từ P. aeruginosa phân lập từ môi trường biển đã được nghiên cứu bởi Angell và cộng sự [12]. P. aeruginosa đã được phân lập từ trầm tích đại dương thu thập từ quần đảo Hawaii và sàng lọc hoạt tính kháng 13 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang khuẩn. Gần 90-95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P. aeruginosa là do pyocyanin. Nó cho thấy khả năng kháng lại các loài vi khuẩn gây bệnh như Salmonella paratyphi, E. coli và Klebsiella gây bệnh viêm phổi [81]. Pyocyanin phân lập từ P. aeruginosa 4B cho thấy khả năng kháng sinh chống lại tác nhân gây bệnh khác nhau và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như Bacillus cereus. Các sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa pyocyanin trong môi trường đã được chọn lọc và chứng minh tác dụng kháng khuẩn trên các sinh vật như S. aureus, Staphylococcus lớp biểu bì, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và Saccharomyces cerevisiae. Các sắc tố được sản xuất cho thấy khả năng chống lại các sinh vật như vi khuẩn E. coli, Acinetobacter , S. aureus và Streptococcus gây bệnh viêm phổi rất hiệu quả (Thụy Điển năm 2010). 1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55] và các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66]. Tác giả Prabhakaran Priyaja [74] đã thông báo khi khảo sát tính kháng của PCN với Vibrio sp cho thấy khả năng ức chế 7 loại Vibrio: V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V.fluvialis, V. mediterrani và V. nereis với vòng kháng khuẩn từ 13,5 đến 31,0mm. Khi dùng dịch nuôi của P. aeruginosa có hàm lượng PCN là 30mg/l cho vòng ức chế đạt 17,50 – 38,06mm. Nồng độ ức chế tối thiểu của pyocyanin chống lại các vi khuẩn và nấm dao động ở 20-120 µg /ml PCN [15, 31, 39, 40, 63]. Khả năng kháng E. ictalluri kém hơn. Mức dộ ảnh hưởng đối với một số chủng không gây bệnh như LA5, B. clausii tương tự như khi sử dụng kháng sinh TE. 14 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và là nhu cầu tuyệt đối với nhiều loài. Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm ruột của tôm trưởng thành đều gặp loài V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum. Hình 1.3: Khuẩn lạc của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus 1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm 1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh: Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ >50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua 15 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang xanh (Callinectes sapidus). Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus… hay tôm hùm châu Á (Panulirus homarus, P. ornatus...) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981. Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ thân có liên quan đến thức ăn thối rữa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu và hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độc trong ao. Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do tôm ăn Artemia và tảo giả. Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản 3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú. Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h [3]. Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong cá trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm [2]. Những năm gần đây khi mà nghề nuôi các động vật thân mềm nước mặn phát triển thì bệnh Vibriosis đã trở thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản. Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều gây ra một số dấu hiện bệnh lý nhất định. Cho đến nay, một số tác giả cho rằng Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm. Ngược lại một số tác giả lại cho rằng: Vibrio là tác nhân thứ hai. Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong nghiên cứu bệnh động vật thủy sản phân lập Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong 16