Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê

  • Số trang: 73 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 14 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ DIỆP THÚY MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ SỮA DÊ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ DIỆP THÚY MSSV: 3102867 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và động viên từ quý Thầy Cô và các bạn sinh viên Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ: Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và toàn thể quý Thầy Cô Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời tri ân đến PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều từ quá trình học tập đến nghiên cứu và hoàn thành đề tài khoa học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Trần Trà My, chị Nguyễn Thị Thúy Duy cùng tất cả các anh chị học viên cao học K18, K19, các anh chị sinh viên lớp Công nghệ sinh học K34, K35 tiên tiến và các bạn sinh viên cùng thực hiện đề tài tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến chú Năm Ngọt – Người chủ hộ nuôi dê ở Chợ Lách – Bến Tre đã cung cấp nguồn mẫu sữa dê để thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân đến cha mẹ và những người thân trong gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình Đại học. Cần Thơ, ngày 24 tháng 11 năm 2013 LÊ DIỆP THÚY Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS, trong đó có 13 dòng được phân lập từ sữa dê thu tại huyện Chợ Lách – Bến Tre, 2 dòng từ chế phẩm Bioacimin và 1 dòng từ chế phẩm Probio. Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập có hình thái khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, trong đó có 4 dòng Probi G8.1, G10.1 và G10.2 có dạng bìa chia thùy. Trong tổng số các dòng vi khuẩn, có 4 dòng dạng que và 12 dòng dạng cầu tồn tại dạng đơn, kết đôi hay kết dạng chùm. Tất cả các dòng vi khuẩn đều Gram dương, kết quả thử nghiệm oxidase âm tính, không có khả năng chuyển động, trong đó có 7 dòng có kết quả thử nghiệm catalase âm tính, bao gồm 2 dòng Bio1.2 và Bio2.1 có nguồn gốc từ chế phẩm Bioacimin và 1 dòng Probi từ chế phẩm Probio và 4 dòng vi khuẩn từ sữa dê : G1.1, G5.1, G5.6 và G6.1. Bốn dòng vi khuẩn lactic trên được chọn để tiếp tục khảo sát khả năng chống chịu pH thấp và kháng thuốc kháng sinh. Kết quả khảo sát có dòng không chịu được môi trường pH 3 trong 3 giờ là G5.1. Hầu hết các dòng đều có khả năng kháng kháng sinh tốt, có thể sử dụng cho những người nhạy cảm với kháng sinh. Từ khóa: Kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa dê, vi khuẩn acid lactic. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ............................................................................................................ LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................................... TÓM LƯỢC ....................................................................................................................... MỤC LỤC .......................................................................................................................... DANH SÁCH BẢNG.......................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... vi CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................................... vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ..............................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài ...........................................................................................................1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..........................................................................2 2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...............................................................2 2.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................2 2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước..................................................................3 2.2. Khái niệm và một số loài vi sinh vật có tiềm năng probiotic....................................4 2.2.1. Khái niệm probiotic.......................................................................................4 2.2.2. Các nhóm vi sinh vật có tiềm năng probiotic................................................5 2.3. Lợi ích và tiềm năng của vi khuẩn probiotic .............................................................8 2.3.1. Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh .................9 2.3.2. Cải thiện và tăng cường miễn dịch, giảm viêm và dị ứng ..........................10 2.3.3. Phòng chống ung thư ruột ...........................................................................11 2.3.4. Hỗ trợ tiêu hoá và dung nạp lactose ............................................................12 2.3.5. Giảm cholesterol .........................................................................................13 2.3.6. Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản và môi trường .............13 2.3.7. Vấn đề chăn nuôi - thú y và những vai trò của probiotic............................14 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................15 3.1. Phương tiện nghiên cứu...........................................................................................15 3.1.1. Thiết bị thí nghiệm ......................................................................................15 3.1.2. Dụng cụ thí nghiệm .....................................................................................15 3.1.3. Hoá chất thí nghiệm ....................................................................................15 3.2. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 3.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật từ nguồn sữa dê và chế phẩm men đông khô .........................................................................................................................16 3.2.2. Phương pháp khảo sát các đặc tính vi sinh học...........................................22 3.2.3. Phương pháp so sánh và đánh giá các thuộc tính probiotic ........................25 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................28 4.1. Nguồn gốc các dòng phân lập .................................................................................28 4.2. Giá trị pH các mẫu sữa dê .......................................................................................29 4.3. Một số đặc điểm khuẩn lạc và các thử nghiệm sinh hóa .........................................30 4.3.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa..............................30 4.3.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê ........................................................32 4.4. Đặc điểm tế bào và khả năng chuyển động .............................................................35 4.4.1. Các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa..............................35 4.4.2. Các dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê ........................................................36 4.5. So sánh và đánh giá khả năng kháng pH thấp .........................................................38 4.5.1. Ở độ pH 6,4 .................................................................................................38 4.5.2. Ở độ pH 3 ....................................................................................................41 4.6. So sánh và đánh giá khả năng kháng kháng sinh ....................................................42 4.6.1. Ampicillin....................................................................................................42 4.6.2. Tetracylin ....................................................................................................44 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................46 5.1 Kết luận.....................................................................................................................46 5.2 Đề nghị .....................................................................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................47 Tiếng Việt .......................................................................................................................47 Tiếng Anh .......................................................................................................................48 Trang web .......................................................................................................................50 PHỤ LỤC ........................................................................................................................... Phụ lục 1: Phụ lục số liệu ................................................................................................... Phụ lục 2: Phụ lục thống kê ................................................................................................ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các loài vi sinh vật thường xuất hiện trong các sản phẩm probiotic.................8 Bảng 2: Thành phần môi trường MRS broth (De Man, Rogosa and Sharpe) .............19 Bảng 3: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm sinh học và từ sữa dê...28 Bảng 4: Kết quả pH các mẫu sữa dê..............................................................................29 Bảng 5: Một số đặc điểm khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa chế phẩm men tiêu hóa..31 Bảng 6: Một số đặc điểm khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa mẫu sữa dê.....................33 Bảng 7: Đặc điểm tế bào, khả năng chuyển động và kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn được phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa.......................................................36 Bảng 8: Đặc điểm tế bào, khả năng chuyển động và kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu sữa dê..........................................................................37 Bảng 9: Bảng giá trị OD của các mẫu ở pH 6,4............................................................38 Bảng 10: Bảng giá trị OD của các mẫu ở pH 3.............................................................40 Bảng 11: Bảng kết quả so sánh khả năng kháng kháng sinh ampicillin........................43 Bảng 12: Bảng kết quả so sánh khả năng kháng kháng sinh tetracylin.........................44 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 và Probi ................................................................................................31 Hình 2: Hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm men tiêu hóa: Bio1.2, Bio2.1 và Probi ................................................................................................32 Hình 3: Kết quả thử nghiệm catalase của một số dòng phân lập từ sữa dê...................34 Hình 4: Ảnh nhuộm Gram của các dòng Bio1.2 (que ngắn) (A), Bio2.1 (cầu đôi) (B) và Probi (que dài) (C) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần...........35 Hình 5: Ảnh nhuộm Gram các dòng G1.1 (A), G9.1 (B) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.............................................................................................36 Hình 6: Sự phát triển của các dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1, G5.6, G6.1) ở độ pH 6,4 (logCFU/ml) qua các mốc thời gian......................................40 Hình 7: Sự phát triển của các dòng vi khuẩn (Bio1.2, Bio2.1, Probio, G1.1, G5.1, G5.6, G6.1) ở độ pH 3 (logCFU/ml) qua các mốc thời gian.........................................41 Hình 8: Khả năng kháng kháng sinh Ampicillin (A) và Tetracylin (T) ở nồng độ 256mg/l của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập: Bio2.1, G1.1, G5.6 và G6.1.........43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT BOD Biochemical Oxygen Demand CFU Colony Forming Unit FAO Food and Agriculture Organization HTLV human T-cell leukemia virus IBS Irritable Bowel Syndrome MRS Man Rogosa Sharpe NK natural killer RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA rDNA Recombinant DNA VSV Vi Sinh Vật WHO World Health Organization Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Khi những nhu cầu về vật chất được đáp ứng, chúng ta ngày càng quan tâm đến sức khỏe của mình hơn. Vì vậy, con người đã và luôn đi tìm những sản phẩm tốt, vừa có thể tăng cường sức khỏe, vừa có thể ngăn ngừa và điều trị một số bệnh trong cơ thể. Với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt trong lĩnh vực Công nghệ sinh học thì vấn đề trên không còn là vấn đề nan giải. Probiotic là sản phẩm không còn xa lạ trong đời sống của chúng ta. Hàng ngàn năm trước con người đã biết sử dụng probiotic như một thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những năm gần đây probiotics mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn. Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống”. Probiotic là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật số lượng đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” (FAO, 2001). Cơ chế tác động của probiotics gần như giống với kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào. Probiotic là những vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá, chúng được mệnh danh là “vi khuẩn tốt bụng” bởi vì giúp cơ thể bảo vệ chống lại một số các vi khuẩn có hại, nấm và siêu vi. Vi khuẩn dùng rộng rãi trong sản xuất probiotic và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất là các loại Lactobacillus (như L. acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. reuteri và L. casei); nhiều dòng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi nấm không gây bệnh. Như vậy vi khuẩn Lactic là một trong những nguồn vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu thế cao. Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotic khác nhau có những ứng dụng cho nhiều bệnh khác nhau. Vì vậy nguồn vi khuẩn probiotic càng phong phú sẽ góp thêm khả năng phòng và trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập được các dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 1899, một dòng Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập bởi Henry Tissier và ông đặt tên là vi khuẩn Bacillus bifidus và vi khuẩn này về sau được đặt tên là Bifidobacterium bifidum. Năm 1917, Alfred Nissle (người Đức) đã phân lập một dòng không gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli từ phân của một người lính trong Thế chiến thứ I và ông đã dùng dòng vi khuẩn này chữa lành bệnh do vi khuẩn Salmonella và Shigella. Minoru Shirota (1899-1982) có một phát minh quan trọng vào năm 1930 khi làm việc tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học của Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay là Đại học Kyoto). Đó là việc phân lập và nuôi cấy được một dòng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei và về sau được mang tên là dòng Lactobacillus casei Shirota. Từ đó đến nay các nhà khoa học Nhật Bản đã dày công nghiên cứu về tác dụng của vi khuẩn này đối với sức khỏe con người. Martin et al. (2003) đã phân lập vi khuẩn acid lactic từ sữa của 8 bà mẹ khỏe mạnh và phân của họ. Họ đã xác định vi khuẩn acid lactic bằng máy phân tích RAPD-PCR và trình tự 16S rDNA. Kết quả họ đã xác định vi khuẩn phân lập từ sữa người như Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium. Những loài này được coi là một trong các vi khuẩn probiotic (Holzapfel et al.., 1998 và Collins et al., 1998) và chứa các dòng được sử dụng trong các sản phẩm probiotic trên thị trường. Heikkila và Saris (2003) đã tập trung vào hoạt động kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus của vi khuẩn phân lập từ sữa người. Họ đã xác định các vi khuẩn bằng các kỹ thuật phân tử khác nhau và đặt tên như là khuẩn tụ cầu, liên cầu và nhóm vi khuẩn acid lactic (LAB) như Lactobacillus crispatus, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis và Leuonostoc mesenteroides, Enterococcus feacalis. Sau đó, kiểm tra hoạt động của các vi khuẩn kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus và đi đến kết Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT luận rằng vi khuẩn hội sinh trong sữa mẹ có một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ trẻ sơ sinh và mẹ đối với Staphylococcus aureus. Martin et al. (2004) đã nghiên cứu trên ba dòng Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ, xem chúng là vi khuẩn probiotic tiềm năng. Họ đã thực hiện một số thử nghiệm điều tra một số tiêu chí cần phải có ở vi khuẩn probiotic như sự tồn tại trong điều kiện pH ở đường tiêu hóa, sản xuất hợp chất kháng khuẩn, sản xuất các amin sinh học...2 dòng Lactobacillus gasseri và 1 dòng Lactobacillus fermentum được đánh giá cho thấy rằng tiềm năng probiotic của Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ là tương tự như với các dòng thường được sử dụng trong các sản phẩm probiotic thương mại. Olivares et al. (2006) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn gây bệnh bằng bốn dòng Lactobacillus: Lactobacillus salivarius CECT5713, Lactobacillus gasseri CECT5714, Lactobacillus gasseri CECT5715, Lactobacillus fermentum CECT5716 phân lập từ sữa mẹ. Tambekar và Bhutada (2010) đã phân tích 120 mẫu sữa từ trâu, bò và dê (mỗi loài 40 mẫu) và xác định được 110 dòng vi khuẩn Lactobacillus tiêu biểu như: L. acidophilus, L. brevis, L. bulgaricus, L. lactis, L. plantarum, L. rhamnosus, L. helveticus, L. casei và L. fermentum...có hoạt tính probiotic. Từ các dòng vi khuẩn được phân lập xác định được 3 mẫu vi khuẩn có tiềm năng probiotic nổi trội nhất là L. rhamnosus G119b, L. plantarum G95a từ sữa dê và L. plantarum C68a từ sữa bò. 2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Phạm Thị Ngọc Lan et al. (2003) đã phân lập được 789 dòng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các dòng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarus (có khả năng kháng nồng độ 40% acid mật, sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, Escherichia coli). Nguyễn Thị Hồng Hà et al. (2003) đã sử dụng hai dòng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella. Nguyễn Thị Hường et al. (2006) đã phân lập 192 dòng vi khuẩn lactic từ dạ dày, ruột non, ruột già và manh tràng của 9 con lợn ở giai đoạn trước và sau cai sữa. Dựa trên 5 tiêu chuẩn của Pattterson et al. (2003), đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn có đặc tính probiotic là dòng YHN77 và YHN99. Hai dòng này có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic nhằm thay thế kháng sinh cho lợn con giai đoạn sau cai sữa. Ngô Thị Phương Dung et al. (2011) đã phân lập vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và sản phẩm men tiêu hóa đông khô. Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn. 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B. subtilis, trong đó 10 dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin. Dòng DC213A được ghi nhận có tính kháng khuẩn mạnh nhất. Kết quả định danh cho thấy 10 dòng này thuộc các giống Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus. 2.2. Khái niệm và một số loài vi sinh vật có thuộc tính probiotic 2.2.1. Khái niệm probiotic Probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật sống, khi uống với số lượng nhất định, sẽ phát huy lợi ích sức khỏe ngoài chức năng dinh dưỡng vốn có của nó (Guarner và Schaafsma, 1998). Theo khái niệm của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hợp Quốc và Tổ chức Y tế Thế giới: Probiotic là những vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể ký chủ một lượng đầy đủ và hợp lý sẽ đem lại lợi ích về sức khỏe cho ký chủ. Như vậy, từ nhiều định nghĩa, khái niệm khác nhau của các tổ chức và cá nhân, ta rút ra khái niệm chung nhất về probiotic: Probiotic là những dòng vi sinh vật sống, bao gồm vi khuẩn hay vi nấm, nếu được đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ và được kiểm soát hợp lý sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng bằng cách cải thiện các tính của hệ vi sinh vật bản địa. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT 2.2.2. Các nhóm vi sinh vật có thuộc tính probiotic Trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật mang thuộc tính probiotic (xem Bảng 1). Tuy nhiên, xét về tầm quan trọng và tính phổ biến thì chỉ có 4 nhóm vi khuẩn lactic là Bifidobacterium Lactobacillus, Enterococcus và Streptococcus được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng hơn cả. Lactobacillus và Bifidobacterium tạo thành một phần chính của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật: a) Nhóm vi khuẩn Bifidobacterium Nhóm Bifidobacterium có chủ yếu trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở trẻ mới sinh được nuôi bằng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn dịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi. Một số tính chất chung của các loài thuộc nhóm Bifidobacterium: − Phân loại: thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào tử. − Hình dạng và kích thước: hình que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y, đường kính khoảng 0,5µm, dài từ 2-3µm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). − Trạng thái: tập hợp thành khối, không chuyển động, không sinh bào tử. − Hình thức sinh sản: phân đôi. − Nhiệt độ sinh trưởng: từ 31-40oC. − Điều kiện sống: kỵ khí, ưa ẩm. − Kiểu lên men: lên men lactic dị hình. − Sản phẩm lên men chính: acid acetic và acid lactic, không sinh CO2. Cho đến nay đã có 30 loài thuộc nhóm Bifidobacterium được phân lập. Bifidobacterium được sử dụng như các probiotics gồm: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium thermophilus, Bifidobacterium breve.... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT b) Nhóm vi khuẩn Lactobacillus Lactobacillus sống chủ yếu ở ruột non với khoảng 102 – 105 cfu/ml và ít hơn với 1% trong ruột kết. Một số tính chất chung của các loài thuộc nhóm Lactobacillus: − Phân loại: thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử. − Hình dạng và kích thước: dạng hình que hay hình cầu, đường kính khoảng 0.5µm, chiều dài khoảng 3µm. − Trạng thái: đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi. − Hình thức sinh sản: phân đôi hay trực phân. − Nhiệt độ sinh trưởng: 30-35 oC là tối ưu. − Điều kiện sống: sống hiếu khí hay kỵ khí, ưa acid. − Kiểu lên men: lên men đồng hình hoặc dị hình. − Sản phẩm lên men chính: acid lactic, rượu etylic và chất thơm. Cơ chế tác động: − Sinh ra acid lactic, hydrogen peroxide, một số chất giống bacteriocin ngăn chặn sự phát triển của một số vi khuẩn và nấm. − Lactobacillus còn điều chỉnh các tế bào miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và giảm cytokine. Đến nay người ta đã tìm thấy 56 loài thuộc giống Lactobacillus. Lactobacillus được sử dụng như các probiotic bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus fermentum,… Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT c) Nhóm vi khuẩn Streptococcus Đại diện là Streptococcus thermophilus, được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm từ sữa. Nó là một probiotic dùng trong sản xuất sữa chua. Vai trò: + Có khả năng giúp đỡ việc hồi phục lại việc hấp thu kém bằng cách sinh ra enzyme lactase dễ dàng cho việc tiêu hóa các lactose trong sữa. + S. thermophilus có hoạt tính oxy hóa mạnh, bảo vệ cơ thể thoát khỏi các gốc tự do nguy hiểm. + S. thermophilus còn có thể hoạt động như một số chất chống ung thư, đặc biệt chống trong trong khả năng bám chặt của vi khuẩn này vào các tế bào biểu mô. Có khả năng làm tăng số lượng tế bào sinh IgA đóng vai trò quan trọng trong việc tạo đáp ứng miễn dịch của màng nhầy. + Chúng có khả năng chống vi khuẩn Listeria hiệu quả hơn các loài vi khuẩn khác. + L. casei làm tăng mức lưu thông IgA ở trẻ bị nhiễm Rotavirus, do đó giúp giảm bệnh tiêu chảy do Rotavirus gây nên. Nguồn cung cấp: các sản phẩm từ sữa. d) Nhóm vi khuẩn Enterococcus Đại diện là Enterococcus faecium, là loại cầu khuẩn, kỵ khí không bắt buộc, Gram dương, thuộc họ Streptococcaceae. Lên men các carbohydrate sinh ra acid lactic làm giảm pH đường ruột và ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Sinh ra hydroperoxide, bacteriocin, các chất kháng độc tố chống lại vi sinh vật gây bệnh, vô hoạt các vi khuẩn gây thoái hóa đường ruột. Giảm tính nhạy cảm với hầu hết thuốc kháng sinh nói chung. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Bảng 1: Các loài vi sinh vật thường xuất hiện trong các sản phẩm probiotic Nhóm Lactobacillus Nhóm Bifidobacterium Các nhóm khác L. acidophilus B. bifidum Enterococcus faecalis L. rhamnosus B. animalis Enterococcus faecium L. gasseri B. breve Streptococcus salivarus subsp. L. casei B. infantis L. reuteri B. longum L. delbrueckii subsp. bulgaricus B. lactis L. crispatus B. adolascentis thermophilus Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris Propionibaterium freudenreichii Pediococcus acidilatici L. plantarum Saccharomyces boulardii L. salivarus Leuoconostoc mesenteroides L. johnsonii L. gallinarum L. fermentum L. helveticus 2.3. Lợi ích và tiềm năng của vi khuẩn probiotic Trong số các vi khuẩn được tìm thấy trong sữa động vật (sữa người, dê, bò..), những loài thuộc Staphylococcus, Lactococcus, Enterococcus và Lactobacillus thì thường hiện diện. Ngày càng có nhiều sự quan tâm đối với các loài thuộc nhóm Lactobacillus như L. gasseri, L. salivarius, L. rhamnosus, L. plantarum và L. fermentum, bởi vì chúng được xem là là loài có tiềm năng probiotic. Nhiều nghiên cứu về vai trò mang lại những lợi ích sức khỏe của thực phẩm lên men và probiotic. Những tác động của vi khuẩn probiotic được đánh giá liên quan đến sức khỏe bao gồm: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT − Điều hoà hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh. − Hỗ trợ tiêu hoá và điều khiển hoạt động không dung nạp lactose. − Cải thiện và tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm viêm và dị ứng. − Phòng chống ung thư ruột kết. − Giảm nồng độ cholesterol và triacylglycerol trong huyết tương. − Giảm huyết áp. − Ảnh hưởng có lợi đến quá trình trao đổi chất, mật độ và sự ổn định của xương, phòng ngừa loãng xương. − Giảm nhiễm Helicobacter pylori. − Phòng chống các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu sinh dục. 2.3.1. Điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật gây bệnh Đối với vấn đề này, probiotic đóng một vai trò điều hòa hệ vi khuẩn và tác động trực tiếp trên tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, nó còn được dùng như một cách khôi phục sự cân bằng vi sinh bị gián đoạn bởi các kháng sinh và sự nhiễm trùng. Hơn nữa, hệ vi sinh vật lactic trong sữa chua (Lactococcus lactis, Lactococus cremoris, Leuconostoc mesenteroide…) giúp làm giảm tỷ lệ bệnh tiêu chảy ở trẻ em (Sarkar, 2008). Từ nhiều nghiên cứu cho thấy, các dòng probiotic khác nhau bao gồm Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus rhamnosus GG và Lactobacillus casei DN-114001 rất hữu ích trong việc giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian lây nhiễm tiêu chảy do đã từng sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài. Trong điều trị tiêu chảy do rotavirus, Lactobacillus GG được báo cáo là thực sự hiệu quả trong việc rút ngắn thời gian tiêu chảy. Nó đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên khắp thế giới bởi một số nhà nghiên cứu như Guandalini et al. (2000), Pant et al. (1996). Ngoài ra Lactobacillus acidophilus LB1, Bifidobacterium lactis và Lactobacillus reuterii cũng được chứng minh có hiệu quả mang lại lợi ích rút ngắn thời gian tiêu chảy (Salminen et al.., 2004). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT Một loại khác của bệnh tiêu chảy là tiêu chảy ở những người đi du lịch, ảnh hưởng đến sự khoẻ mạnh của du khách không chỉ ở các nước đang phát triển mà còn ở châu Âu. Probiotic có hiệu quả trong việc ngăn ngừa một số triệu chứng của hiện tượng tiêu chảy này. Bằng chứng là Oksanen et al. (1990) đã đánh giá hiệu quả của Lactobacillus GG trong việc ngăn ngừa tiêu chảy ở 820 người đi du lịch từ Phần Lan đến Thổ Nhĩ Kỳ. Trong nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng một số dòng probiotic sản xuất các hợp chất chống vi khuẩn, chẳng hạn như acid hữu cơ, H2O2 hoặc bacteriocins, reuterin... đã được chứng minh để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Listeria monocytogenes. Bên một số vi khuẩn có trong sữa mẹ cải thiện chức năng bảo vệ đường ruột bằng cách tăng sản xuất mucine và giảm tính thấm của đường ruột. Tuy nhiên, sự cạnh tranh với các vi khuẩn sinh chất độc hay vi khuẩn gây bệnh về chất dinh dưỡng và sự gắn với thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột là cơ chế chống viêm nhiễm chính của vi khuẩn probiotic. Chế phẩm sinh học được phân lập từ sữa người như L. gasseri CECT5714, L. salivarius CECT5713 và L. fermentum CECT5714 được chứng minh để ức chế sự bám dính của vi khuẩn Salmonella cholerasuis vào mucin của ruột và tăng thời gian sống của chuột bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh. Các thử nghiệm lâm sàng khác nhau đã chứng minh rằng, trẻ em không có khả năng được nuôi bằng sữa mẹ, thay vào đó trẻ được cung cấp chế độ ăn có bổ sung bằng chế phẩm probiotic có thể bảo vệ trẻ em khỏi các bệnh viêm nhiễm. Hầu hết các nghiên cứu có liên quan đến bổ sung với L. rhamnosus LGG, đã chứng minh có thể giảm tỷ lệ nhiễm rotavirus và thời gian tiêu chảy. 2.3.2. Cải thiện và tăng cường miễn dịch, giảm viêm và dị ứng Nghiên cứu trên con người đã chỉ ra rằng các vi khuẩn probiotic có thể có tích cực ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của ký chủ (Mombelli và Gismondo, 2000). Dữ liệu cho thấy tiêu thụ vi khuẩn acid lactic thuộc nhóm Lactobacillus và Bifidobacterium hỗ trợ hệ thống miễn dịch chống lại một số tác nhân gây bệnh (Scheinbach, 1998 và Dugas et al.., 1999). Probiotic ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch theo nhiều cách khác nhau: sản Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 36 - 2014 Trường ĐHCT xuất phân bào, kích thích đại thực bào, tăng tiết nồng độ IgA (Cakir, 2003, Scheinbach, 1998 và Dugas, et al.., 1999). Cũng trong một nghiên cứu trên người, Halpern et al. (1991) bổ sung thức ăn của con người với 450 g sữa chua mỗi ngày trong 4 tháng và cuối cùng được quan sát thấy một sự gia tăng đáng kể trong việc sản xuất của γ-interferon. Trẻ em được bổ sung Lactobacillus rhamnosus GG và Bifidobacterium lactis Bb-12 cho thấy cải thiện triệu chứng dị ứng chàm so với nhóm dùng thuốc (Saarela, et al.. 2000). Sự định cư ở đường ruột thường là kết quả của sự tiếp xúc đầu tiên của trẻ sơ sinh với vi sinh vật có lợi, đây là vai trò rất quan trọng cho phát triển của hệ thống miễn dịch của trẻ sơ sinh. Điều này được chứng minh rằng sự khác biệt trong thành phần vi sinh vật đường ruột ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc các bệnh lý nhất định có liên quan đến thành phần miễn dịch quan trọng, chẳng hạn như dị ứng hoặc quá trình viêm. Với ý nghĩa này, tiêu thụ chế phẩm probiotic từ sữa của con người, đặc biệt là L. rhamnosus LGG cho thấy giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của viêm da dị ứng ở trẻ. Các tác dụng điều hòa miễn dịch của chế phẩm sinh học cũng được chứng minh trong các bệnh lý của động vật nơi hệ thống miễn dịch có liên quan. Dòng probiotic khác nhau được phân lập từ sữa của con người đã được báo cáo để tăng cường bảo vệ miễn dịch của chuột. Ngoài ra, probiotic từ sữa người như L. gasseri CECT5714 kết hợp với L. Coryniformis CECT5711 làm giảm tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của phản ứng dị ứng. Bên cạnh đó, các dòng E. coli mang thuộc tính probiotic do Nissle khám phá năm 1917 có thể có tác dụng tương đương với Mesalazine (một loại thuốc điều trị viêm loét trong hệ tiêu hoá) trong việc giảm viêm loét đại tràng. 2.3.3. Phòng chống ung thư ruột Các nghiên cứu chỉ ra rằng nếu tiêu thụ chất béo bão hòa trong chế độ ăn uống dẫn đến sự xuất hiện của ung thư ruột kết tăng lên trong thế giới phương Tây. Enzyme của vi khuẩn có hại (β-glucornidase, nitroreductase và azoreductase) chuyển đổi tiền chất gây Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -