Tài liệu Phân lập và tuyển chọn các chủng loại nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao ở vĩnh phúc (kl00503)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH- KTNN _______***_______ PHÙNG DŨNG MẠNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO Ở VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Người hướng dẫn khoa học TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI - 2010 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS. Phương Phú Công người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ Em trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh viên Phùng Dũng Mạnh Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các số liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì một công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh Viên Phùng Dũng Mạnh Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU……………………………………………………………………..1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………..……………………......3 1.1. Đại cương về nấm mốc……………….……..………………………....3 1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries……….………………………………6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới…………….6 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus…………………………………...9 1.3. Sơ lược về chi Penicillium……………………………………………12 1.4. Cellulose và cellulase…………………………………………………14 1.4.1. Cellulose………………………………………………………..……14 1.4.2. Cellulase……………………………………………………………..15 1.4.3. Cơ chế tác động của phức hệ cellulase……………………...............16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….18 2.1. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………...18 2.1.1. Mẫu phân lập………………………………………………………...18 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất dung cho nghiên cứu…………………...18 2.2. Môi trường………………………………………………………….…18 2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….......19 2.3.1. Phương pháp phân lập……………………………………………..19 2.3.1.1. Thu thập mẫu…………………………………………………...19 2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản…………………….19 2.3.1.3. Tiến hành phân lập……………………………………………...20 Khóa luận tốt nghiệp Phùng Dũng Mạnh - K32D 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính………………………………………...21 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002)………21 2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường Crapek-Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô………….21 2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô (Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg, 1996)………………………………………………..21 2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại…………………….22 2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới kính hiển vi soi nổi……………………………………………...22 2.3.4.2. Quan sát và xác định các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh qua kính hiển vi (Axioskop)………………….23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………..…………24 3.1. Kết quả phân lập………………………………………………………24 3.2. Kết quả thử hoạt tính………………………………………………….25 3.3. Kết quả định loại sơ bộ……………………………………………….27 3.3.1. Bản mô tả chủng M3………………………………………………...27 3.3.2. Bản mô tả chủng M5-3………………………………………………29 3.3.3. Bản mô tả chủng M6-1………………………………………………31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………...34 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các dạng bọng đỉnh giá ở chi Aspergillus………………………...10 Hình 1.2. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus…………………...11 Hình 1.3. Cấu tạo khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium…...13 Hình 1.4. Cấu trúc không gian lập thể của cellulose………………………...15 Hình 1.5. Sơ đồ phân giải cellulose theo Erikson và CS (1974)…………….17 Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất……………………….26 Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M3………………………...29 Hình 3.3. Một số đặc điểm hình thái của chủng M5-3………………………31 Hình 3.4. Một số đặc điểm hình thái của chủng M6-1………………………33 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các chủng nấm mốc phân lập được………………………………23 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc……………………...25 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CBH Cellobiohydrolase CMC Cacboxyl methyl cellulose CMC-ase Cacboxymethylcellulase CS Cộng sự E1 Exoglucanase E2 Endoglucanase UV Tia cực tím Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn, dị dưỡng, chúng thường có mặt trong đất, xác động thực vật và không khí, một số ký sinh trên động thực vật và người. Một số nấm mốc là tác nhân gây bệnh, làm hư hỏng các sản phẩm công, nông nghiệp nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra các enzyme, axit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, các kích thích tố tăng trưởng động thực vật và đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp. Cellulase là một phức hệ enzyme thủy phân cellulose, được tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, trong đó có nấm mốc. Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase nhằm hai mục đích chính: thứ nhất là dùng cellulase trực tiếp để phân hủy phế thải của công, nông nghiệp có thành phần chủ yếu là cellulose trong công nghệ môi trường, thứ hai là thuỷ phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau. Đặc biệt trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng có trong thức ăn ở mức cao nhất. Để giải quyết vấn đề này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme (gồm nhiều loại enzyme gọi là multi-enzyme, trong đó có cellulase) để bổ sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn. Việc bổ sung chế phẩm gồm nhiều loại enzyme sẽ giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau. 1 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường hàng trăm ngàn tấn phế phẩm có thành phần chủ yếu là cellulose, hiện đã và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì đó sẽ là một nguồn lợi lớn về mặt kinh tế, đồng thời lại giải quyết được vấn đề về ô nhiễm môi trường. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về cellulose ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình và CS (2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò... và kết quả cho nhiều triển vọng. Tuy nhiên cũng chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc phân giải cellulose, nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ra ưu thế hơn so với nấm mốc về khả năng sinh cellulase. Nhưng nếu xét về khả năng chống chịu pH, khả năng sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ... thì nấm mốc tỏ ra ưu thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác. Từ những lý do, trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, tôi chọn đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao ở Vĩnh Phúc” để nghiên cứu. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase. Bước đầu phân loại sơ bộ một số chủng có hoạt tính cellulase cao nhất. 3. Ý nghĩa của đề tài Bước đầu tuyển chọn những chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cellulase cao, cung cấp nguồn giống vi sinh vật phục vụ cho các nghiên cứu khác đi sâu hơn vào ứng dụng, hứa hẹn cho nhiều ứng dụng trong thực tiễn. 2 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về nấm mốc Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes). Deuteromycota bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Coelomycetes. Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài. Deutermycota cùng với nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm (Basidiomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J. Carlile et al. 2001). Chúng là những sinh vật nhân chuẩn, dị dưỡng, phần lớn sống hoại sinh (saprophytism), một số kí sinh (parasitism) trên người và động thực vật, còn một số khác cộng sinh (symbiosis). Thành tế bào có kitin, hệ sợi (mycelium) là một tản phát triển mạnh dạng sợi có vách ngăn, nhân ở thể đơn bội, hoặc lưỡng bội, hoặc thể song nhân, sinh sản bằng bào tử (bào tử không có roi). Theo quan điểm của các nhà nấm học hiện nay thì nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes) là nhóm nấm bao gồm các nấm túi và nấm đảm mất khả năng sinh sản hữu tính (telemorph), chỉ còn hình thức sinh sản vô tính (anamorph) được gọi chung là nhóm Mitosporic fungi (Michael J. Carlie, Sarah C. Watkinson, Graham, 1994; Noyd R.K, 2000). Ở nấm túi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes), quá trình sinh sản hữu tính xảy ra trong một giai đoạn của vòng đời gọi là giai đoạn hoàn thiện (perfect stage) hay dạng sinh sản hữu tính (telemorph). Ngược lại đặc trưng của nấm bất toàn Deuteromycetes là hình thức sinh sản vô tính. Các bào tử trần vô tính (conidia hay mitotic spores) được sinh ra bằng quá trình 3 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp nguyên phân từ một tế bào biệt hóa của sợi nấm có tên là cuống sinh bào tử trần hay giá bào tử trần (conidiophores, stipe). Các giá bào tử trần có thể được hình thành trực tiếp từ sợi dinh dưỡng (hyphal form) ở dạng đơn độc (mononematous) hoặc nhóm thành cụm giá xuất phát từ một điểm gốc (facide) hoặc thành bó kết chặt (synematous). Nếu giá bào tử trần to hơn, dày hơn hệ sợi cơ chất thì gọi là macronematous, nếu bằng hoặc nhỏ hơn sợi cơ chất thì gọi là micronematous. Các giá bào tử trần cũng có thể được tạo thành bên trong một cấu trúc đặc biệt gọi là thể quả (conidiomata). Kiểu hình thành bào tử trần này gọi là conidioma forms. Hình dạng của các quả thể này có thể có nhiều hình dạng khác nhau. Thường có hai dạng là dạng hình chai (pycnidia) và dạng hình vòm (acervuli). Một số ít nấm bất toàn không có khả năng sinh bào tử trần gọi là nhóm nấm bất thụ (mycelia steritia). Sự sinh sản của chúng nhờ các dạng hệ sợi sinh dưỡng hoặc các dạng chống chịu với môi trường như hạch nấm (sclerotia), bào tử áo (chlamydospores), tế bào Hulle … Deuteromycetes có khoảng 15000-20000 loài thuộc 2400 chi Mitosporic đã được biết đến. Nó là lớp lớn thứ hai sau lớp nấm túi Ascomycetes. Sự phân loại nấm bất toàn cho đến nay vẫn mang tính chất nhân tạo không phản ánh mối quan hệ họ hàng của các loài nấm. Khóa phân loại nấm bất toàn đầu tiên được đưa ra là khóa phân loại của Saccardo (1880-1884). Đây là khóa phân loại hoàn toàn mang tính hình thái, dựa vào kiểu tập hợp của các giá bào tử trần để phân chia tạm thời nhóm nấm này vào 3 lớp chính là Hyphomycetes, Coelomycetes và Agonomycetes. Đặc điểm của từng lớp được miêu tả như sau: 4 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Hyphomycetes (moniliaales - nấm bông): Đặc điểm của nhóm này là các giá bào tử trần được sinh ra tự do trên sợi nấm, có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể đơn độc hoặc xoắn thành bó kiểu coremia hoặc stilbace. Coelomycetes (nấm xoang): Coelomycetes khác với Hyphomycetes là giá bào tử trần được tạo thành trong các quả thể nhỏ (small fruit-bodies or conidiomata) dạng hình chai hoặc dạng hình vòm. Các quả thể nhỏ này được hình thành từ các sợi nấm kết lại hoặc từ các mô thực vật kết hợp với sợi nấm ở những loài kí sinh trên thực vật. Phân loại lớp Coelomycetes dựa vào hình thái bào tử và thể quả đồng thời dựa vào phương pháp hình thành bào tử và giá bào tử trần. Agonomycetes (mycelia sterilia – nấm bất thụ): Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore) hoặc các tế bào dày (tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trưng để phân loại (Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994). Năm 1955, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần (conidiophores) và bào tử trần (conidia). Năm 1968, Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barnett & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó … là những đặc điểm quan trọng để phân loại (Erick H.C.Mckenzie, 2004;E. Kifer & N. Morelet, Robert K.Noyd, 2000). 5 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E. Kifer & N. Morelet, Robert K. Noyd (2000) đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo (1880-1884) và Grove (1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần. - Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần (conidiophores) tạo ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính. - Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần (conidiophores) được sinh ra trong các thể quả vô tính (axesual ascomata). 1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm 1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi Eurotium herbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô. Fries (1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli. De Bary (1850) phát hiện ra rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus glaucus. Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Chuyên luận về chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang được sử dụng rộng rãi để định loại các loài của chi nấm này là chuyên luận của Raper và Fennell (1965). Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) gồm 132 loài (đã được chấp nhận) và được xếp vào 18 nhóm loài (Robert A. Samsom,1999), đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus (E. Kifer & N. Morelet; Robert K. Noyd, 2000). Để có thể xử lý phân loại một số lượng lớn các loài thuộc chi này, các nhà nghiên cứu trước đây đã chia nó ra thành các nhóm loài (group) hoặc các thứ (series) dựa trên màu sắc bào tử, hình dạng và kích thước của bọng đỉnh 6 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp giá, sự có mặt của trạng thái hữu tính… (Raper & Fennell, 1965). Năm 1985, Gams và cộng sự đề nghị đổi các nhóm loài (group) thành các chi phụ (subgenera) và các tổ chi (sections) để cho nó phù hợp với danh pháp thực vật hơn. Dưới đây là phần tóm tắt hệ thống phân loại chi Aspergillus hiện đang được sử dụng rộng rãi (Maren A. Klich, 2002). Ở đây chúng tôi bổ sung tên các nhóm loài (group) tương đương trong chuyên luận của Raper & Fennell, 1965. Chi Aspergillus Micheli ex Fries: Chi phụ Aspergillus: thể bình dạng đơn tầng (uniseriate), ưa khô, bào tử màu lục xám. - Tổ chi (Section) Aspergillus (tƣơng đƣơng với A. glaucus Group): dạng hữu tính eurotium, thể quả (cleistothecia) màu vàng với thành là một lớp tế bào nhu mô giả hình đa giác, bào tử túi (ascospore) trong suốt. - Tổ chi (Section) Restricti (tƣơng đƣơng với A. restrictus Group): chỉ có dạng vô tính, sinh trưởng chậm trên tất cả các môi trường. Chi phụ Fumigati: dạng thể bình đơn tầng, bọng đỉnh giá thường có hình quả lê, bào tử màu lục xám, lục xanh đến màu cam. - Tổ chi (Section) Fumigati (tƣơng đƣơng với A. fumigatus Group): bào tử màu lạc xám đến lục xanh. - Tổ chi (Section) Cervini (tƣơng đƣơng với A. cervinus Group): bào tử cam nhạt đến cam xám. Chi phụ Ornati: thể bình dạng đơn tầng, bào tử màu lục xám, lục vàng hoặc nâu olive. - Tổ chi (Section) Ornati (tƣơng đƣơng với A. ornatus Group): giống với chi phụ. 7 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Chi phụ Clavati: thể bình dạng đơn tầng, bọng đỉnh giá chủ yếu hình chùy, bào tử có màu lục xám. - Tổ chi (Section) Clavati (tƣơng đƣơng với A. Clavatus Group): giống với chi phụ. Chi phụ Nidulantes: thể bình có dạng đơn tầng, màu sắc bào tử thay đổi. - Tổ chi (Section) Nidulantes (tƣơng đƣơng với A. nidulans Group): giá bào tử trần ngắn, thường nâu, bào tử lục, thường có tế bào Hulle, đa số các loài có trạng thái hữu tính Emericella. Thể quả có thành mềm, bao quanh bởi tế bào Hulle, bào tử túi màu đỏ đến tía. - Tổ chi (Section) Versicolores (tƣơng đƣơng với A. versicolor Group): giá bào tử trần trong suốt đến nâu, bào tử lục, lục xám hoặc lục xanh. - Tổ chi (Section) Usti (tƣơng đƣơng với A. ustus Group): giá bào tử trần màu nâu, bào tử màu đỏ đục, nâu, hoặc olive. - Tổ chi (Section) Terrei (tƣơng đƣơng với A. terreus Group): giá bào tử trần trong suốt, bào tử màu da bò, đến cam nâu. - Tổ chi (Section) Flavipedes (tƣơng đƣơng với A. flavipes Group): giá bào tử trần trong suốt đến nâu nhợt, bào tử màu trắng đến da bò. Chi phụ Circumdati: thể bình dạng lưỡng tầng hoặc đơn tầng, bọng đỉnh giá hình cầu cho đến hình quả lê. - Tổ chi (Section) Wentii (tƣơng đƣơng với A. wentii Group): bào tử màu da bò, nâu vàng cho đến nâu olive. - Tổ chi (Section) Flavi (tƣơng đƣơng với A. flavus Group): bào tử màu lục vàng đến nâu olive. - Tổ chi (Section) Nigri (tƣơng đƣơng với A. niger Group): giá bào tử trần có thành nhẵn, bào tử đen hoặc gần đen. - Tổ chi (Section) Circumdati (tƣơng đƣơng với A. ocharaceus Group): thể bình thường là dạng lưỡng tầng, bào tử vàng, màu lông bò đến màu vàng nâu nhạt. 8 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp - Tổ chi (Section) Candidi (tƣơng đƣơng với A. candidus Group): bào tử trắng hoặc gần trắng. - Tổ chi (Section) Cremei (tƣơng đƣơng với A. cremeus Group): bào tử nâu, vàng hoặc xanh lục. - Tổ chi (Section) Sparsi (tƣơng đƣơng với A. sparsus Group): bào tử xám nhợt đến màu olive. Chi phụ Stilbothamnium : đặc điểm nổi bật là các giá bào tử trần tập hợp thành bó, dạng cụm lớn, thẳng. Chi phụ này được thiết lập bởi Samson và Seifert năm 1985 (J.E.Smith, 1994). Tuy nhiên, sự sắp đặt của một số loài và sự tồn tại của một số nhóm loài này vẫn đang còn nhiều tranh cãi (Kozakiewiez, 1989; Samson & Frisvad, 1991; Peterson, 2000). 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus Các đặc điểm đặc trƣng của chi Aspergillus Micheli ex. Fries : - Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách, không màu, màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của khuẩn lạc. - Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia). Cũng như các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trưng dùng trong phân loại chi nấm này. Các đặc điểm của cơ quan sinh bào tử trần: Cơ quan sinh bào tử trần phát triển từ một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân (foot-cell) có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần (conidiophore hay stipe) Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn, trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá bào tử trần phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle). Bọng đỉnh giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại 9 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với chi Penicillium. Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu (hình 1.1: q), hình bán cầu (hình 1.1: k, m, l), hình chùy (hình 1.1: k), hình quả bầu (hình 1.1: b, d), hình bàn trang (phần bọng đỉnh giá thẳng) (hình 1.1: a, c, e). Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình (phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng tầng (biseriate). Phialide hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá cũng là đặc điểm đặc trưng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần gũi với nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách ngăn khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc… ở các loài khác nhau. Hình 1.1. Các dạng bọng đỉnh giá ở chi Aspergillus 10 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Chuỗi bào tử trần trên phialide có thể dài ngắn khác nhau ở từng loài. Mức độ bao phủ bọng đỉnh giá bởi thể bình cũng là đặc điểm quan trọng để phân loại đến loài các loại Aspergillus. Thể bình có thể bao phủ gần toàn bộ (75%) hoặc toàn bộ (100%) bọng đỉnh giá, hoặc bao phủ một nửa bọng đỉnh giá, hoặc chỉ một phần ở bọng đỉnh giá, chúng có thể mọc sát chặt vào nhau hoặc mọc rời rạc lẻ tẻ (Bùi Xuân Đồng, 2001; Maren A. Klich, 2002). Toàn bộ phần bọng đỉnh giá, thể bình và bào tử trần gộp lại tạo lên bông nấm (conidial head). Hình dạng của toàn bộ bông nấm cũng là những đặc điểm phân loại đáng chú ý. Hình dạng bông nấm có thể là hình cầu chặt hoặc lỏng, hoặc hình phóng xạ, có thể là hình cột thẳng đứng, chặt, có thể là phân thành các thùy khác nhau (Botton B, Breton A, 1990; Raper & Fennell, 1965). Một số loài Aspergillus có khả năng tạo ra nhiều tế bào có thành dày gọi là tế bào Hulle (hình 1.2: c) và các hạch nấm (sclerotium) Hình1.2. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus Ghi chú: a: Thể bình dạng đơn tầng (uniseriate);b: Thể bình dạng lưỡng tầng (biseriate); c: Tế bào Hulle; d: Tế bào gốc (foot-cell); e: Bào tử trần (conidia). 11 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Ở một số loài Aspergillus người ta đã tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính (telrmorph) của chúng, các loài này được xếp vào các chi của lớp nấm túi như Emercella, Eurotium, Neosartorya và một số chi khác (Raper & Fennell, 1965; Samson, 1979). Đặc điểm đặc trƣng của nhóm loài Aspergillus niger: Theo khóa phân loại đến loài của chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965; Al-Musallam, 1980; Domsch et al., 1980; Klich &Pitt, 1988; Kozakiewiez, 1989; Tzean et al., 1990; Parenicova, 2000 và Maren A Krick, 2002) thì nhóm loài Aspergillus niger có những đặc điểm nổi bật sau : - Bông nấm (conidial head): dạng màu đen tối, đen hơi lục, đen hơi nâu, đen tía hoặc đen cacbon; có hình cầu hoặc phóng xạ hoặc chia ra thành các cột không đều đặc. - Giá bào tử trần (conidiophore, stipe): thường nhẵn hoặc hơi ráp ở một số loài, thành thường dày. - Bọng đỉnh giá (vesicle): hình cầu hoặc gần cầu. - Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng hoặc lưỡng tầng ở tùy loài. - Bào tử trần (conidia): hình cầu, gần cầu, elip, nhẵn hoặc gần nhẵn, hơi ráp hoặc ráp. - Hạch nấm: hình gần cầu đến cầu, màu kem khi non, khi già màu lông bò hoặc hồng hoặc nâu. 1.3. Sơ lƣợc về chi Penicillium Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, chúng phân bố ở khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái. 12 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Hinh 1.3. Cấu tạo khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium Chúng có những đặc điểm chung với Aspergillus nhưng cũng có các đặc điểm đặc thù như : Màu khuẩn lạc : Thường có màu xanh xám. Khuẩn ty: khuẩn ty của Penicillium phân nhánh, nhiều khuẩn ty có vách ngăn ngang và chính khuẩn ty này có khả năng hấp thu chất dinh dưỡng để tạo ra cọng bào tử và đính bào tử; Mỗi tế bào thường có một nhân nhưng nhiều khi có những tế bào có nhiều nhân, mỗi đoạn khuẩn ty có thể phát triển thành sợi khuẩn ty mới. 13