i
Lời cảm ơn
Lời cảm ơn đầu tiên con muốn gửi đến ba mẹ và gia đình với lòng biết ơn
sâu sắc. Ba mẹ đã cho con sự sống, gia đình cho con tinh thần và vật chất để con
vững bước trên con đường học vấn và sự nghiệp.
Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm Thu
Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm giúp tôi hoàn
thành đề án tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả các thầy cô trong Viện Công nghệ
sinh học và Môi trường đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu và hết
lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có được những nền tảng kiến thức
không chỉ trong trong suốt quá trình học tập bốn năm tại trường và còn trên những
bước đường đời sau nay.
Bên cạnh đó, tôi còn muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng
thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và Môi trường, các bạn Nguyễn Thị Hoàng
Nhạn và Lê Thị Lệ lớp 50 SH, Nguyễn Thị Lý lớp 49 SH cùng tất cả các bạn lớp 49
SH và 50 SH đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện hỗ trợ để tôi hoàn thành đồ án này.
Và một lần nữa xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người đã giúp đỡ
và dành nhiều tình cảm cho tôi trong suốt thời gian qua.
Nha Trang, ngày
tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thành Duy
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi
LỜI NÓI ĐẦU ............................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn ....................................................................3
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum..........................................................9
1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum ...........................................................9
1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................11
1.2.3. Khả năng tạo màng cellulose của Acetobacter xylinum ...............................12
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn .........................................15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới ...........15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam ..........16
1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài ......................................................................18
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................21
2.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................................21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................21
2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................21
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................25
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................26
2.3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum..........................................................26
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum........................27
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ............27
2.3.4. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum ...................28
iii
2.3.5. Bảo quản chủng giống .......................................................................................30
2.3.6. Nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn .............................................................30
2.3.7. Thu nhận và xử lí màng cellulose vi khuẩn.....................................................31
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................32
3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................................................32
3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum ................................................33
3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ...................34
3.4. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum ........................................36
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose vi khuẩn .... Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BC
: Bacterial cellulose
HS
: Herstrin and Schram
Glu
: Gluccose
GHK
: Glucose hexokinase
G6P
: Glucose 6 phosphate
G1P
: Glucose 1 phosphate
PGM
: Phosphoglucoemutase
UGP
: UDPglucose pyro-gluco 6 phosphate
PGA
: Phosphogluconic acid
PGI
: Phosphoglucose isomerase
FHK
: Fructose hexokinase
Frc
: Fructose
F6P
: Fructose 6 phosphate
1PFK
: Fructose 1 phosphate kinase
F1P
: Fructose 1 phosphate
PTS
: Hệ thống vận chuyển phosphat
FDP
:Fructose1,6 diphosphate
PE
: Polyethylen
PVC
: Polyvinylchlorua
PP
: Polypropylene
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC.......5
Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose ............................................................5
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự hình thành BC ..........................6
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 đến sự hình thành BC .......................7
Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC...................................8
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC...........................................8
Bảng 7: Một số ứng dụng của màng BC trên thế giới ..............................................15
Bảng 8: Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS ......................32
Bảng 9: Sự thay đổi của pH trong suốt quá trình nuôi cấy .......................................40
Bảng 10: Khảo sát tỉ lệ nước dừa trong nuôi cấy BC ...............................................40
Bảng 11: Các đặc điểm của màng BC.......................................................................42
Bảng 12: Khảo sát khả năng chịu lực của màng BC.................................................43
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm ...............................................4
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi...........................12
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum ..................................14
Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thực hiện nội dung nghiên cứu của đề tài .......................25
Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC .....................................................31
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi
trường HS ..................................................................................................................33
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A3 sau khi nhuộm Gram.................................................34
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A3 trên môi trường HS lỏng ........34
Hình 3.4. Phản ứng catalase của vi khuẩn A3 ...........................................................36
Hình 3.5. Vòng sáng quanh khuẩn lạc A3 sau thời gian nuôi cấy.............................37
Hình 3.6 Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid của chủng A3 .................38
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của chủng A3 .............................39
Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng nước dừa trong nuôi tạo màng BC ..........................41
Hình 3.5. Màng BC qua các giai đoạn ......................................................................42
1
LỜI NÓI ĐẦU
Túi nilon là một sản phẩm của dầu mỏ, được sử dụng nhiều nhất và rất phổ
biến trên toàn thế giới. Với các tính năng tiện dụng như dẻo dai, dễ sử dụng, đủ mọi
kích cỡ, màu sắc và kèm theo đó là dễ loại bỏ khi không còn dùng, thì túi nilon trở
thành một thứ sản phẩm hữu ích cho nhu cầu của con người.
Rác thải túi nilon trong rác thải sinh hoạt thực chất là hỗn hợp các loại nhựa
phế thải mà trong đó bao bì bằng nhựa polyethylene (PE) hoặc polypropylene (PP)
chiếm đa số. Chúng thuộc loại polyethylene tỉ trọng thấp (LDPE) hoặc tỉ trọng cao
(HDPE).
Các loại vật liệu nhựa ra đời từ đầu thế kỉ XX và gia tăng rất nhanh về số
lượng, chủng loại. Chỉ tính riêng LDPE năm 1999 thế giới đã sản xuất 27,4 triệu
tấn, năm 2000 là 33,8 triệu tấn. Số liệu thống kê mức tiêu thụ ở một số nước trên
thế giới vào năm 1994 như Mỹ là 108 kg/ người/ năm; Nhật Bản là 85 kg/ người/
năm; Hàn Quốc là 74,9 kg/người/ năm….Riêng tại Việt Nam, số liệu năm 1998 là
5,3 kg/ người/ năm và tăng lên 15 kg/ người/ năm vào năm 2003. Hiện tại số liệu
này đang ngày càng gia tăng ( Viện Vật liệu xây dựng- Bộ xây dựng, 2003).
Chính vì sự gia tăng rất lớn của nhu cầu sử dụng và sản xuất các loại bao bì
nhựa mà lượng rác thải nilon cũng tăng theo. Kéo theo đó là các tình trạng ô nhiễm
môi trường ngày càng trầm trọng. Thời gian phân hủy của túi nilon có thể kéo dài từ
50 đến 100 năm hoặc hơn nên còn rất nhiều tác hại mà nó có thể gây ra khi bị thải
vào môi trường.
Trước tình trạng báo động về ô nhiễm túi nilon và các tác hại của nó, các nhà
khoa học đã nghiên cứu để tìm ra loại bao bì có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với
môi trường. Có nhiều loại nguyên liệu đã được chú ý và đưa vào nghiên cứu như
polylactic acid (PLA), polyglyconic acid (PGS)…Tất cả đều có nguồn gốc tự nhiên
từ tinh bột của sắn, ngô, khoai tây và một số loại khác.
Ngoài các loại nguyên liệu trên thì còn có một loại nguyên liệu khác rất có
tiềm năng trong việc tạo bao bì thân thiện môi trường. Đó là màng cellulose vi
khuẩn.
2
Đây là một polysaccharide được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao
đổi chất trong môi trường nuôi cấy.
Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose như Acetobacter,
Rhizobium, Agrobacterium…nhưng các chủng vi khuẩn Acetobacter là loại vi
khuẩn sản xuất cellulose là đáng chú ý nhất. Trong đó có chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum là loài có khả năng tạo ra màng cellulose tốt nhất.
Ngoài thực phẩm, màng cellulose vi khuẩn đã và đang được nghiên cứu
nhằm mở ra các hướng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác như y học, mỹ phẩm... và
mới đây là các triển vọng trong lĩnh vực môi trường.
Với các đặc tính cơ học bền, chắc, dai, màng bacterial cellulose có thể ứng
dụng tạo loại ra loại bao bì thân thiện môi trường. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực
hiện đề tài “ Phân lập và nuôi cấy Acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi
khuẩn” với mục đích:
Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn cơ chất nước dừa.
Khảo sát khả năng tạo màng cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo
tiền đề ứng dụng làm bao bì sinh học.
3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn
Cellulose được tổng hợp bởi một số loại vi khuẩn như Acetobacter,
Rhizobium, Sarcina và Agrobacterium được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial
cellulose- BC). Trong các vi khuẩn nói trên thì Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất
cellulose đáng chú ý nhất (Brown và cs, 1976).
Về mặt cấu trúc, BC có cấu trúc dạng bó sợi đan xen lẫn nhau. Các sợi sắp
xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng đan xen vào nhau từ mọi hướng.
Do trong quá trình lên men, các vi khuẩn A. xylinum chuyển động hỗn độn không
theo qui luật, kết quả là tạo ra tính bền, dai chắc về mọi phía của màng BC. Đặc tính
cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy đặc trưng. Tuỳ thuộc
vào yêu cầu ứng dụng mà ta chọn điều kiện nuôi cấy tĩnh hay động ( Trần Thị Diễm
Chi, 2000).
Về tính chất, BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các loại cellulose
khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có
độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và
hướng.
BC còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, có tính
xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học
cao). Màng BC sau khi sấy ở 900C thì sẽ mỏng như tờ giấy, bề mặt láng bóng, rất
dai chắc. Do chuỗi polymer của màng BC có chứa nhiều nhóm OH- nên dễ dàng tạo
liên kết hydro với nước, chính vì vậy mà bên trong toàn bộ màng BC sau nuôi cấy
nước chiếm tới 99% ( Nguyễn Thúy Hương, 2008).
4
Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm
(99% thành phần màng là nước)
Dựa vào các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự (1967), Trần
Phú Hòa (1996) đã tiến hành một số khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
hình thành màng BC.
Thứ nhất, trạng thái màng BC tạo thành chịu ảnh hưởng của nguồn
đường. Kết quả sử dụng các nguồn đường của vi khuẩn A. xylinum và trạng thái
màng BC được hình thành thể hiện qua bảng 1. A. xylinum có thể sử dụng glucose,
saccharose, lactose, maltose, dextrin và galactose nhưng không thể sử dụng tinh bột.
Đối với mỗi loại đường khác nhau sẽ cho ra màng BC có trạng thái khác nhau.
5
Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC
trong nước dừa ở pH = 5,0
Loại đường
Độ dày- trạng thái
Glucose
Saccharose
Lactose
Maltose
Dextrin
Galactose
Không đường
Dày – chắc
Dày – chắc
Mỏng – mềm
Mỏng – mềm
Mỏng – mềm
Mỏng – mềm
Mỏng – mềm
Khối lượng màng sau 15 ngày
lên men (g)
198,50
193,79
84,50
86,35
81,20
50,45
50,00
(Trần Phú Hòa, 1996)
Dựa vào kết quả của bảng 1, nguồn đường glucose và saccharose được vi
khuẩn A. xylinum sử dụng một cách có hiệu quả nhất với khối lượng màng BC tạo
ra là 198,5g và 193,79g sau 15 ngày lên men. Trong thực tế sản xuất, người ta
thường sử dụng đường saccharose do giá thành rẻ và năng suất khá cao. Vì vậy
trong bảng 2, Trần Phú Hòa tiến hành khảo sát đường saccharose ở các nồng độ
khác nhau và với nồng độ 10% sẽ cho khối lượng màng cao nhất.
Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose
Nồng độ saccharose (%)
Độ dày- trạng thái
Khối lượng màng BC sau
15 ngày lên men (g)
2
Trung bình - chắc
112.08
4
Trung bình - chắc
146.45
6
Trung bình - chắc
165.76
8
Trung bình - chắc
187.54
10
Dày – chắc
198.58
12
Trung bình - chắc
188.78
14
Trung bình - chắc
185.65
Không bổ sung đường
Màng rất mỏng
95.88
(Trần Phú Hòa, 1996 )
6
Thứ hai, nguồn N sử dụng cho quá trình lên men có thể là (NH4)2HPO4 hoặc
(NH4)2SO4. Do đó khối lượng BC tạo thành cũng phụ thuộc vào hàm lượng
(NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 sử dụng.
Dựa vào kết quả của bảng 3, ta nhận thấy với nồng độ của (NH4)2SO4 là
0,5% thì khối lượng màng đạt giá trị cao nhất (210,35 g) sau 15 ngày nuôi cấy. Khi
nồng độ % của (NH4)2SO4 nằm trong khoảng 0,5%- 0,8% thì khối lượng màng thay
đổi không đáng kể.
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự hình thành BC
Nồng độ (NH4)2SO4 (%)
Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy
(g)
0,0
110,0
0,1
128,70
0,2
135,50
0,3
148,65
0,4
168,20
0,5
210,35
0,6
178,90
0,7
174,85
0,8
170,45
0,9
163,90
1
150,40
( Trần Phú Hòa, 1996)
7
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 đến sự hình thành BC
Nồng độ (NH4)2HPO4 (%)
Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy
(g)
0,0
78,3
0,1
117,1
0,2
146,9
0,3
162,5
0,4
150,2
0,5
139,3
0,6
130,4
0,7
126,8
0,8
119,7
0,9
108,5
1
107,6
( Trần Phú Hòa, 1996)
Kết quả bảng 4 cho thấy nồng độ (NH4)2HPO4 trong khoảng 0,2%- 0,4% cho
khối lượng màng BC cao nhất. Như vậy, khi bổ sung nguồn N vào môi trường nuôi
cấy cần lựa chọn nồng độ % (NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 sao cho phù hợp ( đối với
(NH4)2HPO4 thì trong khoảng 0,5%- 0,8%, (NH4)2SO4 trong khoảng từ 0,2%0,4%) để cho khối lượng màng cao nhất.
Về nhiệt độ, vi khuẩn A. xylinum hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ
28oC-32oC. Trong khoảng nhiệt độ này thì khả năng tổng hợp màng là tốt nhất. Trần
Phú Hòa đã khảo sát dựa trên các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự.
(1967) và đưa ra kết quả trong bảng 4.
8
Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC trong nước dừa
ở pH = 5,0
Nhiệt độ (oC)
Trạng thái màng
Khối lượng
trung bình (g)
15
Không phát triển
0,00
20
Màng mỏng- mềm
87,50
25
Trung bình- chắc
128,82
28-31
Dày- chắc
195,02
35
Không tạo màng
0,00
40
Không tạo màng
0,00
( Trần Phú Hòa, 1996)
Một trong những điều kiện quan trọng ảnh hưởng tới sự hoạt động sống của
vi sinh vật là độ acid của môi trường. A. xylinum là một loài chịu acid nên môi
trường thường được điều chỉnh về pH 3,5-4 bằng acetic cacid 40%. Trong 4 ngày
đầu pH tăng dần từ 3,78 đến 3,91. Sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị
pH= 3,35. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC được thể hiện qua bảng 6.
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Độ pH
Độ dày- trạng thái
Khối lượng màng (g)
2,5
Không tạo màng
0,00
3,0
Không tạo màng
0,00
3,5
Màng mỏng- mềm
92,60
4,0
Màng mỏng- mềm
148,52
4,5
Màng dày- chắc
188,32
5,0
Màng dày- chắc
193,89
5,5
Màng dày- chắc
184,20
6,0
Màng dày- chắc
173,70
6,5
Màng mỏng- chắc
163,85
7,0
Màng mỏng- mềm
86,90
7,5
Không tạo màng
0,00
8,0
Không tạo màng
0,00
( Trần Phú Hòa, 1996)
9
1.2.Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum
Phân loại khoa học của Acetobacter xylinum:
Giới:
Vi khuẩn
Ngành:
Proteobacteria
Lớp:
Alpha Proteobacteria
Bộ:
Rhodospirillales
Họ:
Acetobacteraceae
Chi:
Acetobacter
Loài:
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập
được các từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả…
Có nhiều loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có
nhiều loài có ý nghĩa kinh tế.
Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn acetic và có nguồn
gốc từ Philippines. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1989) thì A. xylinum là vi
khuẩn Gram âm, thuộc lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ
Pseudomonadieae (Krieg và Holt, 1984).
Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn
trông giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của
J-Frateur (1950). Frateur đã đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa
trên các tính chất sinh hoá. Trên cơ sở này, Frateur đã chia thành 4 nhóm:
Suboxydans, mesoxydans, oxydans và peroxydans.
• Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter
melanogennum.
• Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và
Acetobacter mesoxydans.
• Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất keto như
Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens.
10
• Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum
không chứa catalase và không oxy hoá được glucose.
Một số đặc điểm chung của Acetobacter:
Dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi
cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt
dạng kéo dài hoặc phình to ra.
Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi.
Kích thước thay đổi tuỳ loài (0,3-0,6 x 1,0-8,0 µm), có thể di động (có tiên
mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiên mao).
Hiếu khí bắt buộc và chịu được độ acid cao.
Có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không
sử dụng được tinh bột.
Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng
thay đổi tuỳ loại.
Có khả năng đồng hoá muối amôn (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài
đòi hỏi một số acid amin nhất định như pantothenic acid và các chất khoáng (K,
Mg, Ca, Fe, P, S …)ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia,
dịch nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự
phát triển của vi khuẩn Actobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acetic
acid, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá
sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…
Sau đây là một số loài quan trọng trong chi Acetobacter:
Acetobacter xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá
dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu
xanh, ccó thể tích luỹ 4,5% acetic acid trong môi trường.
Acetobacter schutzenbachi: trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không
bền vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% acetic acid do đó
thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp của Đức.
Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển
hoá glucose thành gluconic acid hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn
11
phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như para
aminopenzoic acid, panthoteric acid, nicotinic acid.
Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều
kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Có thể
phát triển được có nồng độ rượu cao (10% -12%) và làm tích luỹ đến 9,5% acetic
acid. Do vậy thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm
(phương pháp của Pháp), phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25oC -30oC.
Acetobacter aceti: Trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng
chuỗi dài. Váng của vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iod,
chúng có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu khá cao 11% và có thể
tích luỹ đến 6% acetic acid trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ
34oC.
Acetobacter pasteurianum: hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng
váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc
Iod.
1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2 µm, đứng riêng lẻ hoặc
xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu xanh với
thuốc nhuộm Iod và H2SO4 (do phản ứng của hemicellulose), sinh trưởng ở pH < 5,
nhiệt độ 28-32oC và có thể tích luỹ 4,5% acetic acid.
Acetic acid là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn,
nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt
động của vi khuẩn.
12
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi
(Tế bào hình que, đứng riêng lẻ hoặc từng chuỗi, không di động)
Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không
phát triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt
độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 250C- 300C. Còn theo Marcormide (1996) thì
A. xylinum có thể phát triển được ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 120C- 320C và nồng độ
ethanol lên đến 10% (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao
là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol,
lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose,
cellobiose, erythritol, ethanol và acetate (Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy,
2003).
Các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho A. xylinum bao gồm phản ứng catalase
(+), oxi hóa ethanol thành acetic acid (+), chuyển hóa glucose thành acid (+) và khả
năng tạo màng cellulose là phản ứng phân biệt giữa các chủng có khả năng sinh tổng
hợp cellulose.
1.2.3. Khả năng tạo màng BC của A. xylinum
Trong chi Acetobacter thì A. xylinum là loài có khả năng tạo ra BC tốt nhất
và nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử
glucose thành cellulose trong 1 giờ (Brown và cs, 1976).
Các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình
trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid
13
béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ
hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa
glucose thành cellulose ( Bazon và cs, 1984).
Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được
Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 nhưng đến giữa thế kỉ XX thì A. xylinum
và BC mới được nghiên cứu sâu bởi Hestrin và cộng sự.
Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự trong một nghiên cứu về khả năng
tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum đã chứng minh rằng A. xylinum có thể sử
dụng đường trong điều kiện hiếu khí để tạo nên cellulose.
Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng
hợp trong môi trường có đường và ATP.
Năm 1989, nhóm Saxena Trường Đại học Texa đã thu nhận được enzyme
cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptide
có trọng lượng phân tử là 83 và 93 kD. Trong đó, tiểu phần 83 kD liên quan đến quá
trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng
hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose).
Dưới đây là cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum từ nguồn đường glucose:
Glucose
(glucokinase)
Glucose-6-Phosphate
(phosphoglucomutase)
Glucose-1-Phosphat
(UDP-glucose pyrophosphorylase)
UDP-Glucose
(cellulose synthase)
Cellulose
BC được tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum có bản chất là hemicellulose (là
những polysaccharide không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính)
có đặc tính cấu trúc và cơ học khá giống với cellulose thực vật nhưng có một số đặc
14
điểm khác biệt như độ bền đứt cao, mật độ polymer hóa cao và có độ thuần khiết
cao hơn cellulose thực vật (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals.
Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với
chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước
từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) kích thước của dải là 3,2 x
133 nm, còn theo Brown và cộng sự (1976) thì kích thước của dải là 4,1 x 177 nm.
So với cellulose thực vật thì BC có độ polymer hóa cao hơn, từ 2000 – 6000 gốc, có
trường hợp lên đến 16000 hay 20000 gốc. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của
cellulose thực vật chỉ từ 13000 – 14000 ( Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Con đường tổng hợp cellulose từ A. xylinum như sau:
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum
- Xem thêm -