Tài liệu Phân lập và nuôi cấy acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi khuẩn

i Lời cảm ơn Lời cảm ơn đầu tiên con muốn gửi đến ba mẹ và gia đình với lòng biết ơn sâu sắc. Ba mẹ đã cho con sự sống, gia đình cho con tinh thần và vật chất để con vững bước trên con đường học vấn và sự nghiệp. Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành đề án tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu và hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có được những nền tảng kiến thức không chỉ trong trong suốt quá trình học tập bốn năm tại trường và còn trên những bước đường đời sau nay. Bên cạnh đó, tôi còn muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và Môi trường, các bạn Nguyễn Thị Hoàng Nhạn và Lê Thị Lệ lớp 50 SH, Nguyễn Thị Lý lớp 49 SH cùng tất cả các bạn lớp 49 SH và 50 SH đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện hỗ trợ để tôi hoàn thành đồ án này. Và một lần nữa xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người đã giúp đỡ và dành nhiều tình cảm cho tôi trong suốt thời gian qua. Nha Trang, ngày tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành Duy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC.................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iv DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi LỜI NÓI ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn ....................................................................3 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum..........................................................9 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum ...........................................................9 1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................11 1.2.3. Khả năng tạo màng cellulose của Acetobacter xylinum ...............................12 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn .........................................15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới ...........15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam ..........16 1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài ......................................................................18 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................21 2.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................................21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................21 2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................21 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................25 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................26 2.3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum..........................................................26 2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum........................27 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ............27 2.3.4. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum ...................28 iii 2.3.5. Bảo quản chủng giống .......................................................................................30 2.3.6. Nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn .............................................................30 2.3.7. Thu nhận và xử lí màng cellulose vi khuẩn.....................................................31 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................32 3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................................................32 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum ................................................33 3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ...................34 3.4. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum ........................................36 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose vi khuẩn .... Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose HS : Herstrin and Schram Glu : Gluccose GHK : Glucose hexokinase G6P : Glucose 6 phosphate G1P : Glucose 1 phosphate PGM : Phosphoglucoemutase UGP : UDPglucose pyro-gluco 6 phosphate PGA : Phosphogluconic acid PGI : Phosphoglucose isomerase FHK : Fructose hexokinase Frc : Fructose F6P : Fructose 6 phosphate 1PFK : Fructose 1 phosphate kinase F1P : Fructose 1 phosphate PTS : Hệ thống vận chuyển phosphat FDP :Fructose1,6 diphosphate PE : Polyethylen PVC : Polyvinylchlorua PP : Polypropylene v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC.......5 Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose ............................................................5 Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự hình thành BC ..........................6 Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 đến sự hình thành BC .......................7 Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC...................................8 Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC...........................................8 Bảng 7: Một số ứng dụng của màng BC trên thế giới ..............................................15 Bảng 8: Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS ......................32 Bảng 9: Sự thay đổi của pH trong suốt quá trình nuôi cấy .......................................40 Bảng 10: Khảo sát tỉ lệ nước dừa trong nuôi cấy BC ...............................................40 Bảng 11: Các đặc điểm của màng BC.......................................................................42 Bảng 12: Khảo sát khả năng chịu lực của màng BC.................................................43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm ...............................................4 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi...........................12 Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum ..................................14 Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thực hiện nội dung nghiên cứu của đề tài .......................25 Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC .....................................................31 Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường HS ..................................................................................................................33 Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A3 sau khi nhuộm Gram.................................................34 Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A3 trên môi trường HS lỏng ........34 Hình 3.4. Phản ứng catalase của vi khuẩn A3 ...........................................................36 Hình 3.5. Vòng sáng quanh khuẩn lạc A3 sau thời gian nuôi cấy.............................37 Hình 3.6 Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid của chủng A3 .................38 Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của chủng A3 .............................39 Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng nước dừa trong nuôi tạo màng BC ..........................41 Hình 3.5. Màng BC qua các giai đoạn ......................................................................42 1 LỜI NÓI ĐẦU Túi nilon là một sản phẩm của dầu mỏ, được sử dụng nhiều nhất và rất phổ biến trên toàn thế giới. Với các tính năng tiện dụng như dẻo dai, dễ sử dụng, đủ mọi kích cỡ, màu sắc và kèm theo đó là dễ loại bỏ khi không còn dùng, thì túi nilon trở thành một thứ sản phẩm hữu ích cho nhu cầu của con người. Rác thải túi nilon trong rác thải sinh hoạt thực chất là hỗn hợp các loại nhựa phế thải mà trong đó bao bì bằng nhựa polyethylene (PE) hoặc polypropylene (PP) chiếm đa số. Chúng thuộc loại polyethylene tỉ trọng thấp (LDPE) hoặc tỉ trọng cao (HDPE). Các loại vật liệu nhựa ra đời từ đầu thế kỉ XX và gia tăng rất nhanh về số lượng, chủng loại. Chỉ tính riêng LDPE năm 1999 thế giới đã sản xuất 27,4 triệu tấn, năm 2000 là 33,8 triệu tấn. Số liệu thống kê mức tiêu thụ ở một số nước trên thế giới vào năm 1994 như Mỹ là 108 kg/ người/ năm; Nhật Bản là 85 kg/ người/ năm; Hàn Quốc là 74,9 kg/người/ năm….Riêng tại Việt Nam, số liệu năm 1998 là 5,3 kg/ người/ năm và tăng lên 15 kg/ người/ năm vào năm 2003. Hiện tại số liệu này đang ngày càng gia tăng ( Viện Vật liệu xây dựng- Bộ xây dựng, 2003). Chính vì sự gia tăng rất lớn của nhu cầu sử dụng và sản xuất các loại bao bì nhựa mà lượng rác thải nilon cũng tăng theo. Kéo theo đó là các tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng. Thời gian phân hủy của túi nilon có thể kéo dài từ 50 đến 100 năm hoặc hơn nên còn rất nhiều tác hại mà nó có thể gây ra khi bị thải vào môi trường. Trước tình trạng báo động về ô nhiễm túi nilon và các tác hại của nó, các nhà khoa học đã nghiên cứu để tìm ra loại bao bì có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với môi trường. Có nhiều loại nguyên liệu đã được chú ý và đưa vào nghiên cứu như polylactic acid (PLA), polyglyconic acid (PGS)…Tất cả đều có nguồn gốc tự nhiên từ tinh bột của sắn, ngô, khoai tây và một số loại khác. Ngoài các loại nguyên liệu trên thì còn có một loại nguyên liệu khác rất có tiềm năng trong việc tạo bao bì thân thiện môi trường. Đó là màng cellulose vi khuẩn. 2 Đây là một polysaccharide được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy. Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium…nhưng các chủng vi khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất cellulose là đáng chú ý nhất. Trong đó có chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum là loài có khả năng tạo ra màng cellulose tốt nhất. Ngoài thực phẩm, màng cellulose vi khuẩn đã và đang được nghiên cứu nhằm mở ra các hướng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác như y học, mỹ phẩm... và mới đây là các triển vọng trong lĩnh vực môi trường. Với các đặc tính cơ học bền, chắc, dai, màng bacterial cellulose có thể ứng dụng tạo loại ra loại bao bì thân thiện môi trường. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “ Phân lập và nuôi cấy Acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi khuẩn” với mục đích: Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn cơ chất nước dừa. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo tiền đề ứng dụng làm bao bì sinh học. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn Cellulose được tổng hợp bởi một số loại vi khuẩn như Acetobacter, Rhizobium, Sarcina và Agrobacterium được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose- BC). Trong các vi khuẩn nói trên thì Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất cellulose đáng chú ý nhất (Brown và cs, 1976). Về mặt cấu trúc, BC có cấu trúc dạng bó sợi đan xen lẫn nhau. Các sợi sắp xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng đan xen vào nhau từ mọi hướng. Do trong quá trình lên men, các vi khuẩn A. xylinum chuyển động hỗn độn không theo qui luật, kết quả là tạo ra tính bền, dai chắc về mọi phía của màng BC. Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy đặc trưng. Tuỳ thuộc vào yêu cầu ứng dụng mà ta chọn điều kiện nuôi cấy tĩnh hay động ( Trần Thị Diễm Chi, 2000). Về tính chất, BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng. BC còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao). Màng BC sau khi sấy ở 900C thì sẽ mỏng như tờ giấy, bề mặt láng bóng, rất dai chắc. Do chuỗi polymer của màng BC có chứa nhiều nhóm OH- nên dễ dàng tạo liên kết hydro với nước, chính vì vậy mà bên trong toàn bộ màng BC sau nuôi cấy nước chiếm tới 99% ( Nguyễn Thúy Hương, 2008). 4 Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm (99% thành phần màng là nước) Dựa vào các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự (1967), Trần Phú Hòa (1996) đã tiến hành một số khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC. Thứ nhất, trạng thái màng BC tạo thành chịu ảnh hưởng của nguồn đường. Kết quả sử dụng các nguồn đường của vi khuẩn A. xylinum và trạng thái màng BC được hình thành thể hiện qua bảng 1. A. xylinum có thể sử dụng glucose, saccharose, lactose, maltose, dextrin và galactose nhưng không thể sử dụng tinh bột. Đối với mỗi loại đường khác nhau sẽ cho ra màng BC có trạng thái khác nhau. 5 Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC trong nước dừa ở pH = 5,0 Loại đường Độ dày- trạng thái Glucose Saccharose Lactose Maltose Dextrin Galactose Không đường Dày – chắc Dày – chắc Mỏng – mềm Mỏng – mềm Mỏng – mềm Mỏng – mềm Mỏng – mềm Khối lượng màng sau 15 ngày lên men (g) 198,50 193,79 84,50 86,35 81,20 50,45 50,00 (Trần Phú Hòa, 1996) Dựa vào kết quả của bảng 1, nguồn đường glucose và saccharose được vi khuẩn A. xylinum sử dụng một cách có hiệu quả nhất với khối lượng màng BC tạo ra là 198,5g và 193,79g sau 15 ngày lên men. Trong thực tế sản xuất, người ta thường sử dụng đường saccharose do giá thành rẻ và năng suất khá cao. Vì vậy trong bảng 2, Trần Phú Hòa tiến hành khảo sát đường saccharose ở các nồng độ khác nhau và với nồng độ 10% sẽ cho khối lượng màng cao nhất. Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose Nồng độ saccharose (%) Độ dày- trạng thái Khối lượng màng BC sau 15 ngày lên men (g) 2 Trung bình - chắc 112.08 4 Trung bình - chắc 146.45 6 Trung bình - chắc 165.76 8 Trung bình - chắc 187.54 10 Dày – chắc 198.58 12 Trung bình - chắc 188.78 14 Trung bình - chắc 185.65 Không bổ sung đường Màng rất mỏng 95.88 (Trần Phú Hòa, 1996 ) 6 Thứ hai, nguồn N sử dụng cho quá trình lên men có thể là (NH4)2HPO4 hoặc (NH4)2SO4. Do đó khối lượng BC tạo thành cũng phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 sử dụng. Dựa vào kết quả của bảng 3, ta nhận thấy với nồng độ của (NH4)2SO4 là 0,5% thì khối lượng màng đạt giá trị cao nhất (210,35 g) sau 15 ngày nuôi cấy. Khi nồng độ % của (NH4)2SO4 nằm trong khoảng 0,5%- 0,8% thì khối lượng màng thay đổi không đáng kể. Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự hình thành BC Nồng độ (NH4)2SO4 (%) Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy (g) 0,0 110,0 0,1 128,70 0,2 135,50 0,3 148,65 0,4 168,20 0,5 210,35 0,6 178,90 0,7 174,85 0,8 170,45 0,9 163,90 1 150,40 ( Trần Phú Hòa, 1996) 7 Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 đến sự hình thành BC Nồng độ (NH4)2HPO4 (%) Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy (g) 0,0 78,3 0,1 117,1 0,2 146,9 0,3 162,5 0,4 150,2 0,5 139,3 0,6 130,4 0,7 126,8 0,8 119,7 0,9 108,5 1 107,6 ( Trần Phú Hòa, 1996) Kết quả bảng 4 cho thấy nồng độ (NH4)2HPO4 trong khoảng 0,2%- 0,4% cho khối lượng màng BC cao nhất. Như vậy, khi bổ sung nguồn N vào môi trường nuôi cấy cần lựa chọn nồng độ % (NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 sao cho phù hợp ( đối với (NH4)2HPO4 thì trong khoảng 0,5%- 0,8%, (NH4)2SO4 trong khoảng từ 0,2%0,4%) để cho khối lượng màng cao nhất. Về nhiệt độ, vi khuẩn A. xylinum hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 28oC-32oC. Trong khoảng nhiệt độ này thì khả năng tổng hợp màng là tốt nhất. Trần Phú Hòa đã khảo sát dựa trên các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự. (1967) và đưa ra kết quả trong bảng 4. 8 Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC trong nước dừa ở pH = 5,0 Nhiệt độ (oC) Trạng thái màng Khối lượng trung bình (g) 15 Không phát triển 0,00 20 Màng mỏng- mềm 87,50 25 Trung bình- chắc 128,82 28-31 Dày- chắc 195,02 35 Không tạo màng 0,00 40 Không tạo màng 0,00 ( Trần Phú Hòa, 1996) Một trong những điều kiện quan trọng ảnh hưởng tới sự hoạt động sống của vi sinh vật là độ acid của môi trường. A. xylinum là một loài chịu acid nên môi trường thường được điều chỉnh về pH 3,5-4 bằng acetic cacid 40%. Trong 4 ngày đầu pH tăng dần từ 3,78 đến 3,91. Sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị pH= 3,35. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC được thể hiện qua bảng 6. Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC Độ pH Độ dày- trạng thái Khối lượng màng (g) 2,5 Không tạo màng 0,00 3,0 Không tạo màng 0,00 3,5 Màng mỏng- mềm 92,60 4,0 Màng mỏng- mềm 148,52 4,5 Màng dày- chắc 188,32 5,0 Màng dày- chắc 193,89 5,5 Màng dày- chắc 184,20 6,0 Màng dày- chắc 173,70 6,5 Màng mỏng- chắc 163,85 7,0 Màng mỏng- mềm 86,90 7,5 Không tạo màng 0,00 8,0 Không tạo màng 0,00 ( Trần Phú Hòa, 1996) 9 1.2.Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum Phân loại khoa học của Acetobacter xylinum: Giới: Vi khuẩn Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhodospirillales Họ: Acetobacteraceae Chi: Acetobacter Loài: Acetobacter xylinum Vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có nhiều loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn acetic và có nguồn gốc từ Philippines. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1989) thì A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, thuộc lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae (Krieg và Holt, 1984). Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trông giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J-Frateur (1950). Frateur đã đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa trên các tính chất sinh hoá. Trên cơ sở này, Frateur đã chia thành 4 nhóm: Suboxydans, mesoxydans, oxydans và peroxydans. • Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter melanogennum. • Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và Acetobacter mesoxydans. • Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất keto như Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens. 10 • Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum không chứa catalase và không oxy hoá được glucose. Một số đặc điểm chung của Acetobacter:
Dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra.
Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi.
Kích thước thay đổi tuỳ loài (0,3-0,6 x 1,0-8,0 µm), có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiên mao).
Hiếu khí bắt buộc và chịu được độ acid cao.
Có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột.
Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tuỳ loại.
Có khả năng đồng hoá muối amôn (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như pantothenic acid và các chất khoáng (K, Mg, Ca, Fe, P, S …)ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Actobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acetic acid, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)… Sau đây là một số loài quan trọng trong chi Acetobacter:
Acetobacter xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu xanh, ccó thể tích luỹ 4,5% acetic acid trong môi trường.
Acetobacter schutzenbachi: trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không bền vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% acetic acid do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp của Đức.
Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hoá glucose thành gluconic acid hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn 11 phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như para aminopenzoic acid, panthoteric acid, nicotinic acid.
Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Có thể phát triển được có nồng độ rượu cao (10% -12%) và làm tích luỹ đến 9,5% acetic acid. Do vậy thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp), phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25oC -30oC.
Acetobacter aceti: Trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng chuỗi dài. Váng của vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iod, chúng có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu khá cao 11% và có thể tích luỹ đến 6% acetic acid trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 34oC.
Acetobacter pasteurianum: hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc Iod. 1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn A. xylinum A. xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2 µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4 (do phản ứng của hemicellulose), sinh trưởng ở pH < 5, nhiệt độ 28-32oC và có thể tích luỹ 4,5% acetic acid. Acetic acid là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn. 12 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi (Tế bào hình que, đứng riêng lẻ hoặc từng chuỗi, không di động) Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 250C- 300C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có thể phát triển được ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 120C- 320C và nồng độ ethanol lên đến 10% (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004). Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate (Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003). Các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho A. xylinum bao gồm phản ứng catalase (+), oxi hóa ethanol thành acetic acid (+), chuyển hóa glucose thành acid (+) và khả năng tạo màng cellulose là phản ứng phân biệt giữa các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulose. 1.2.3. Khả năng tạo màng BC của A. xylinum Trong chi Acetobacter thì A. xylinum là loài có khả năng tạo ra BC tốt nhất và nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ (Brown và cs, 1976). Các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid 13 béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose ( Bazon và cs, 1984). Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 nhưng đến giữa thế kỉ XX thì A. xylinum và BC mới được nghiên cứu sâu bởi Hestrin và cộng sự. Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự trong một nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum đã chứng minh rằng A. xylinum có thể sử dụng đường trong điều kiện hiếu khí để tạo nên cellulose. Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Năm 1989, nhóm Saxena Trường Đại học Texa đã thu nhận được enzyme cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử là 83 và 93 kD. Trong đó, tiểu phần 83 kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose). Dưới đây là cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum từ nguồn đường glucose: Glucose (glucokinase) Glucose-6-Phosphate (phosphoglucomutase) Glucose-1-Phosphat (UDP-glucose pyrophosphorylase) UDP-Glucose (cellulose synthase) Cellulose BC được tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum có bản chất là hemicellulose (là những polysaccharide không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính) có đặc tính cấu trúc và cơ học khá giống với cellulose thực vật nhưng có một số đặc 14 điểm khác biệt như độ bền đứt cao, mật độ polymer hóa cao và có độ thuần khiết cao hơn cellulose thực vật (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004). Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) kích thước của dải là 3,2 x 133 nm, còn theo Brown và cộng sự (1976) thì kích thước của dải là 4,1 x 177 nm. So với cellulose thực vật thì BC có độ polymer hóa cao hơn, từ 2000 – 6000 gốc, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000 gốc. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của cellulose thực vật chỉ từ 13000 – 14000 ( Trần Thị Ánh Tuyết, 2004). Con đường tổng hợp cellulose từ A. xylinum như sau: Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum