Tài liệu Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang (litsea cubeba (lour.) pers

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------o0o-------------- VŨ THỊ THÙY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: 1. TS. Phí Quyết Tiến Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. ThS. Bùi Đình Lãm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ Lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn CN. Nguyễn Phú Tâm cùng các cán bộ Phòng Công nghệ Lên men đã chỉ bảo tôi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS. Bùi Đình Lãm cùng các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Thùy ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu ................................................................................................................... 11 Bảng 2.2. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ............................................................................................. 14 Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 21 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA ........................................................................................................ 26 Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái của một số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ các mẫu cây Màng tang ................................................................ 28 Bảng 4.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 32 Bảng 4.3. Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ................... 34 Bảng 4.4. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT25 khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau ............................................................................................. 36 Bảng 4.5. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C .......................................................... 37 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của chủng MPT25 .................................................................................................. 38 Bảng 4.7. Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT25 .................................................................................................. 39 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA ............................................................. 17 Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc đại diện của các chủng xạ khuẩn nội sinh trên ba môi trường đặc hiệu và 3 bộ phận khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (A-Rễ, BThân, C-Lá) ..................................................................................................... 27 Hình 4.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh được phân bố trên các bộ phận của cây Màng tang ........................................................................................................ 29 Hình 4.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo các môi trường phân lập .......... 30 Hình 4.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh được phân theo nhóm màu ...... 31 Hình 4.5. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas aeruginosa CNLM (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh .............................. 33 Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử dưới kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) và 20.000 lần (C) của chủng MPT25 .................................................................................................. 36 Hình 4.7. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% ................................................................................................... 39 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt STT Tên đầy đủ 1 CA Citrate acid-agar 2 DAB Deacetil baceatin 3 DNA Deoxyribonucleotide acid 4 DNR Daunorubicin 5 DOX1 Doxorubicin 6 HV Humic acid-agar 7 IDA Idarumycin 8 NaOCl Sodium hypochlorite 9 RNA Ribonucleic acid 10 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 11 VSV Vi sinh vật v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4 2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu......................................................... 4 2.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu..................................... 4 2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 5 2.1.3. Phân lập xạ khuẩn nội sinh ..................................................................... 7 2.1.4. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật .......................................... 8 2.1.5. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ....................................... 9 2.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh .................................................. 13 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 13 2.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................ 15 2.3. Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline .............. 16 2.4. Cây Màng tang và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh ....................... 18 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................... 20 3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20 3.1.1. Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng gống vi sinh vật ......................... 20 3.1.2. Hóa chất................................................................................................. 20 3.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 21 3.1.4. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 21 vi 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 21 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 3.4.1. Lấy mẫu cây Màng tang ........................................................................ 22 3.4.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu ............................................................ 22 3.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ............. 22 3.4.4. Đánh giá khả năng sinh anthracycline .................................................. 23 3.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25 ................ 23 3.4.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA ............................................................................................................... 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27 4.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ ......................................................................................................................... 27 4.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 29 4.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang .............. 29 4.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập ........ 30 4.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty ............ 31 4.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 32 4.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ........................... 32 4.3.2. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline ...................... 34 4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT25 ................. 35 4.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 ......................................... 35 4.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT25 ............................................................................................. 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, con người đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn, nấm, virus và các vi sinh vật khác. Để điều trị các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi sinh vật, kháng sinh được sử dụng là chủ yếu. Tuy nhiên, vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh đang là vấn đề nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu của cộng đồng. Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra. Theo nghiên cứu của Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản sinh bởi xạ khuẩn [10]. Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh học, các chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học và kiểm soát sinh học… [9, 48]. Hơn nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức năng của chúng đây là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục những mối đe dọa gia tăng của kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho con người và thực vật. Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật vẫn còn rất hạn chế . 2 Một trong những nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh là thực vật, đặc biệt là cây dược liệu. Trong số đó, cây Màng tang (Litsea cubeba) là loài dược liệu đã được trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, nhức đầu, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học do thành phần của cây mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây Màng tang còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn trên cây Màng tang nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” 1.2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn và nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại của một chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao. 1.3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh một số các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu thập tại tỉnh Phú Thọ. 1.4. Ý nghĩa của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài kế thừa kết quả của một số nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu cũng như những kết quả nghiên cứu trong, ngoài nước về lĩnh vực khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư mới. Đề tài chọn đối tượng là cây Màng tang đã được nghiên cứu khá nhiều trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu hoặc tách chiết các hợp chất tự nhiên có tiềm năng kháng vi sinh vật, kháng tế bào 3 ung thư. Từ đó, đưa ra một số cơ sở khoa học về mặt lý thuyết và cơ chế nội sinh của các chủng xạ khuẩn trên mô tế bào cây Màng tang. Đồng thời, đánh giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn nhằm tìm ra chất kháng sinh, kháng ung thư mới. 1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn - Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực y học, hóa dược. - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học, tác phong và kỹ năng làm việc sau này. - Giúp sinh viên biết cách đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu, xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu 2.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957) đã phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxyporum f. sp. Lycopersici [55]. Từ đó, có rất nhiều định nghĩa khác nhau về vi sinh vật (VSV) nội sinh, theo Bacon và White (2000) định nghĩa: “VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [9]. Xạ khuẩn nội sinh ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà phân loại học, sinh thái học, nông học, hóa học và sinh học tiến hóa bởi khả năng sản xuất ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm: kháng sinh, kháng u và kích thích sự tăng trưởng của thực vật - yếu tố quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [21]. Xạ khuẩn cũng đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [3]. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. 5 2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ nhóm Prokaryota [51]. Xạ khuẩn nội sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào. Đáng chú ý, trong số gần 300.000 loài thực vật trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của một hoặc nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo ra sự đa dạng sinh học rất lớn [56]. Tuy nhiên, mới chỉ có một vài loài thực vật được nghiên cứu để tìm ra các loài xạ khuẩn mới. 2.1.2.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 [26]. Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [42]. * Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác 6 nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. 2.1.2.2. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1]. Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [41]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome ở VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1]. Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S 7 rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [57]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá tri này là 98%. 2.1.3. Phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ... Trên bề mặt tế bào thực vật chứa rất nhiều vi khuẩn, nấm. Do đó, trong quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh, ta cần xử lý bề mặt mẫu thực vật thật kỹ, tránh bị nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội sinh phân lập. Trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu, đầu tiên ta rửa mẫu dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn, vi nấm bề mặt, để khô, cắt nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt 8 hiệu quả [38]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol và một số chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh. Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [11]. Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, hai tuần đầu tiên VSV phát triển mạnh là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men,… [12, 32, 36]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [27]. 2.1.4. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, ngày càng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn thường xâm nhập vào mô thực vật qua lỗ khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ phụ và biểu bì bị phân cắt bằng cách hình thành cụm tế bào của chúng [28]. Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên và các vết thương do cơ học hoặc côn trùng. Chủng xạ khuẩn Streptomyces scabies hình 9 thành mạng lưới phủ trên bề mặt khoai tây. Sợi nấm xâm nhập vào củ khoai tây thông qua lỗ hổng trên bề mặt cây non và các vết thương khi khoai tây đang ở giai đoạn phát triển mạnh. Sau khi xâm nhập, các tác nhân gây bệnh phát triển trong các khoảng trống của tế bào và phý hủy các tế bào mà chúng tiếp xúc. Ngoài ra, chủng Streptomyces ipomoeae cũng gây bệnh thối ở củ khoai tây bằng cách phát triển trên bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ thông qua các mô ở vị trí liên kết giữa các tế bào [15]. Loài này hình thành hệ sợi phân nhánh từ sợi chính và xâm nhập trực tiếp vào thành tế bào chủ. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự hiện hiện của các sợi nấm trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSV nội sinh vẫn là một ẩn số. Năm 2003, Coombs và Franco đã gắn protein huỳnh quang xanh vào chủng Streptomyces sp EN27 cấy vào hạt lúa mì để nghiên cứu sự hình thành, phát triển của chúng trong cây chủ [17]. Kết quả, tuy không chứng minh được giai đoạn xâm nhập ban đầu của xạ khuẩn nội sinh vào vật chủ nhưng cũng khẳng định được xạ khuẩn nội sinh xâm nhập vào cây chủ từ rất sớm, và có thể xâm nhập qua phôi của vỏ hạt rồi mở rộng ra các nội nhũ của hạt. Năm 2007, Franco tiếp tục quan sát khuẩn lạc của chủng EN27 tại các vết nứt xung quanh rễ và quá trình hình thành bảo tử trong 3-4 tuần [20]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm của chúng vào rễ thông qua các vết nứt để xâm nhập và nhân lên trong các mô tế bào. 2.1.5. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật Phần lớn xạ khuẩn nội sinh có thể sống trong các mô thực vật và không gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quá trình phát triển bình thường của cây. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, enzyme, chất kích thích sinh trưởng thực vật, ức chế và kiểm soát bệnh thực vật…. 10 2.1.5.1. Kháng ung thư, kháng sinh Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thế giới. Li J và cộng sự khi nghiên cứu chất chống ung thư và hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu trong rừng nhiệt đới đã xác định được 41 chủng xạ khuẩn nội sinh Streptomyceps có khả năng kháng ung thư. 31,7% trong số chúng biểu hiện hoạt động gây độc trên các tế bào A549, 29,3% trên các tế bào HL-60, 85,4% trên các tế bào BEL-7404 và 90,2% trên các tế bào P388D1 [34]. Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng để chữa bệnh cho con người. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi được nhiều bệnh và dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn hay nấm gây ra như: thương hàn, tả, đậu mùa… Xạ khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được xem là nguồn sản xuất chất kháng sinh nhiều nhất [44]. Trong số các tác kháng sinh được biết trên thế giới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra [18]. Nhiều loại xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài từ cây dược liệu có khả năng ức chế, tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm, virus. Do đó, xạ khuẩn nội sinh có tiềm năng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới. Bảng dưới đây cho thấy tiềm năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây dược liệu (Bảng 2.1). 11 Bảng 2.1. Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu Xạ khuẩn Cây dƣợc liệu Streptomyces Cây họ Dáy sp. MSU- (Monstera 2110 sp.) Streptomyces sp. CS Mỹ đăng mộc (Maytenus Hookeri) Streptomyces Liễu sam sp. TP- (Cryptomeria A0456 Japonica) Streptomyces sp. TPA0556 Chi Ô rô bà(Aucuba Japonica) Kháng sinh Hoạt tính Coronamycins Kháng sinh 24-demethylbafilomycin C1 Cedarmycins A and B Tài liệu tham thảo [19] Kháng sinh Kháng ung [37] thư Kháng nấm Demethylnovobio Kháng vi cins sinh vật [29] [29] Ngày càng có nhiều chất kháng sinh mới được phát hiện từ các loài xạ khuẩn nội sinh như: munumbicins A-D [13], celastramycins A-B [43], kakadumycins [12] và demethylnovobiocins [29]... Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh là nguồn tiềm năng cần được quan tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tính sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm các loại thuốc mới. 2.1.5.2. Kháng nấm, kháng viêm Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh đã được nghiên cứu. 19 chủng xạ khuẩn được phân lập từ lá nim, bạch đàn và hat cà phê đã được sử dụng để xác định hoạt tính chống nấm. Chủng NEK5 (từ lá nim), EE9 (bạch đàn) và CE1 (hạt cà phê) cho thấy hoạt tính chống nấm tốt. Dịch chiết ethyl acetate thu 12 nhận từ môi trường thạch nuôi cấy với chủng NEK5, EE9 và CE1 ức chế sự tăng trưởng của các mầm bệnh như Fusarium sp, Pythium sp, Curvularia sp và Cercospora sp [62]. Các chất chuyển hóa từ 23 chủng Streptomycetes cho thấy hoạt tính kháng nấm. Nấm men (S. cerevisiae) nhạy cảm với hầu hết các chất chiết từ xạ khuẩn nội sinh, mặc dù Candida albicans kháng với hầu hết các sản phẩm. Các hợp chất từ xạ khuẩn nội sinh Streptomycetes có thể ngăn chặn sự phát triển của nấm: (F. oxysporum, Cladosporium fulvum, và R. Solani [33]. 2.1.5.3. Kiểm soát sinh học Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà VSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tính nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất như chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào. Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F. oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic và etylen [16]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. 2.1.5.4. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã