Tài liệu Phân lập và lưu giữ giống tảo silic lông chim nitzschia longissima

1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, mặc dù có những khó khăn nhất định (đặc biệt là nghề nuôi tôm sú), song nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta vẫn được mở rộng và có những bước phát triển đáng khích lệ. Các đối tượng đưa vào nuôi trồng ngày càng đa dạng, trong đó có các loài cá biển (cá chim vây vàng, cá chẽm, cá hồng ..) hay các loài động vật thân mềm (hải sâm, nghêu, trai ngọc, ốc hương…). Vì vậy việc sản xuất thức ăn phục vụ cho nuôi trồng thủy sản cũng đa dạng (kể cả thức ăn tươi sống, thức ăn tổng hợp) và được chú trọng đầu tư hơn. Với giá trị dinh dưỡng khá cao (Brown & ctv, 1991) [20] cùng với mùi vị đặc trưng (mùi tanh)…, vi tảo là nguồn thức ăn tươi sống không thể thiếu trong công nghệ sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm của các đối tượng nuôi trồng thủy sản. Trong đó, tảo silic (Bacillariophyceae) là lớp có nhiều loài được nuôi trồng để làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản. Tuy nhiên, các loài tảo silic hiện đang được nuôi trồng phần lớn là các loài tảo silic trung tâm (Centrales) có đời sống trôi nổi, trong khi các loài sống đáy, sống bám (tảo silic lông chim Pennales: Navicula sp., Nitzschia sp., Amphora sp. …) ít được chú ý đến. Với lối sống đáy, sống bám, chúng có thể là thức ăn phù hợp cho giai đoạn sống đáy, sống bám của các đối tượng nuôi, đặc biệt là động vật thân mềm (Mollusca). Có thể nói rằng, trong công nghệ nuôi trồng vi tảo làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản, tảo giống được xem là một khâu quan trọng của qui trình nuôi. Nó ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi sinh khối tảo cũng như tỷ lệ sống của đối tượng nuôi (khi chúng sử dụng tảo làm thức ăn). Mặc dù hiện nay trên thế giới cũng như ở nước ta đã có khá nhiều phương pháp phân lập, lưu giữ giống tảo thuần chủng (Nguyễn Thị Hương, 2001) [5], (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [11]. Song việc lựa chọn được phương pháp phân lập cũng như phương pháp lưu giữ phù hợp với các loài tảo silic lông chim sống đáy, sống bám còn ít được nói đến. Do vậy, các loài tảo silic lông chim như Nitzschia sp., Navicula sp., ... vẫn phải nhập từ nước ngoài (Trung Quốc, Úc) và với giá thành nhập rất cao. Vì thế, cần phải nghiên cứu và 2 hoàn thiện các phương pháp phân lập, lưu giữ thích hợp cho từng loài tảo silic sống đáy, sống bám này. Để góp phần vào việc nghiên cứu phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng của một số loài tảo silic lông chim, trong thời gian từ ngày: 27/07/2007 đến 8/11/2008 tôi được Khoa Nuôi trồng thủy sản phân công thực hiện đề tài: “Phân lập và lưu giữ giống tảo silic lông chim Nitzschia longissima” với các nội dung chính sau: 1. Phân lập giống tảo Nitzschia longissima thuần chủng bằng một số phương pháp khác nhau. 2. Lưu giữ giống tảo Nitzschia longissima trong các điều kiện khác nhau. Mục đích của đề tài: Phân lập và lưu giữ được loài tảo Nitzschia longissima thuần chủng. Ý nghĩa của đề tài: Là cơ sở khoa học cho việc phân lập và lưu giữ cho các loài tảo silic lông chim nói chung và loài Nitzschia longissima nói riêng. Ngoài ra, còn bổ sung giống tảo silic lông chim Nitzschia longissima thuần chủng cho ngân hàng tảo giống. Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian ngắn và còn gặp một số khó khăn về điều kiện thí nghiệm, trình độ chuyên môn lại có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Song được sự hướng dẫn của Ths. Tôn Nữ Mỹ Nga nên tôi đã hoàn thành được nội dung của đề tài tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ quý báu này. Nha trang, tháng 10 năm 2008 Sinh viên thực hiện Lê Hoàng Bảo Châu 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic 1.1.1. Hệ thống phân loại (Hoek & ctv, 1995) [27] Ngành: Heterokontophyta Bacillariophyceae Lớp: Pennales Bộ: Bộ phụ: Biraphidineae Họ: Nitzschiaceae Giống: Nitzschia Loài: Nitzschia longissima Hình 1.1: Hình dạng tế bào Nitzschia longissma [1]. (độ phóng đại 400 lần) 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Nitzschia longissma (Trương Ngọc An, 1993) [1] Tế bào có hình que rất dài, vỏ mỏng, sống riêng rẽ . Mặt vỏ tế bào hình que thẳng, trục dài trung bình 440 µm. Đoạn giữa mặt vỏ phình to ra, có dạng hình thoi, 4 dài khoảng 1/4 đến 1/3 trục dài, chiều ngang 16µm . Hai đầu tế bào nhỏ đều, thẳng, chiều ngang 4-5 µm. Trên mặt vỏ có đường vân ngang (16 đường). Mỗi tế bào có hai thể sắc tố dạng bản nằm ở đoạn phình ra của tế bào. - Cấu tạo vách tế bào: Vách tế bào được cấu tạo bằng silic (SiO2.nH2O) và pectin, gồm 2 tầng, tầng ngoài (silic) và tầng trong (pectin). - Sắc tố và thể sắc tố: Thể sắc tố dạng bản, số lượng ít, kích thước lớn, gồm chlorophyll (a và c), fucoxanthin, carotenoit. - Nguyên sinh chất: Là chất sống căn bản của tế bào, có tính lỏng, nhớt, đàn hồi, và trong suốt. - Nhân: Mỗi tế bào có một nhân, thường có dạng hình cầu, kích thước phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của tế bào. Nhân nằm trên cầu nguyên sinh chất chạy qua trung tâm tế bào. Nhân có màng nhân cố định chứa một hay nhiều hạch nhân, quá trình phân chia không giảm nhiễm (Lê Viễn Chí, 1996) [2]. - Chất dự trữ: Dạng giọt dầu màu da cam với kích thước nhỏ. 1.1.2.2. Sinh sản Theo Trương Ngọc An (1993) [1], tảo silic thường có các kiểu sinh sản sau: - Sinh sản phân cắt theo kiểu nắp hộp: Hai mảnh vỏ tách rời nhau ra. Mỗi mảnh vỏ đều chứa chất tế bào với nhân và thể màu. Bất cứ mảnh nào của tế bào mới được hình thành về sau chúng tự tạo nên mảnh vỏ dưới. Như vậy, sau một số lần phân chia sẽ dẫn đến sự giảm kích thước tế bào (từ 1/2 -1/3 kích thước ban đầu). - Sinh sản bằng bào tử nghỉ trong điều kiện bất lợi: Các hình thức sinh sản bằng bào tử như bào tử nghỉ, bào tử phục hồi độ lớn (do quá trình phân cắt kiểu nắp hộp dẫn đến sự giảm kích thước tế bào sau nhiều lần phân chia). + Sự hình thành bào tử sinh trưởng (Auxospore) Khi kích thước tế bào giảm, tảo silic phải tiến hành phục hồi lại kích thước ban đầu bằng cách phân chia đặc biệt hình thành bào tử sinh trưởng. 5 + Bào tử ngủ (Resting spore) Các loài tảo gần bờ trong bộ tảo silic trung tâm thường có hình thức sinh sản bằng bào tử ngủ như chi tảo lông gai (Chaetoceros), chi tảo chuỗi thẳng (Melosira), v.v… Hình thành bào tử ngử để duy trì sự sống trong điều kiện bất lợi của môi trường như: nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, muối dinh dưỡng thiếu…. Ngoài ra, tảo silic còn có hình thức sinh sản hữu tính (đẳng giao ở tảo silic lông chim và noãn giao ở tảo silic trung tâm) (Đặng Thị Sy, 2005) [12], (Hoek & ctv, 1995) [27]. 1.1.2.3. Sinh trưởng của vi tảo Trên thế giới và ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu về sự sinh trưởng của tảo Silic. Những nghiên cứu về các giai đoạn sinh trưởng của tảo Silic phải kể đến công trình của Đặng Ngọc Thanh (1974) [14], Fluks và Main (1991) [28], Tô Huệ Mỹ (1989) [9], Sato (1991) [30] và (Hoek & ctv, 1995) [27]. Cũng như các ngành tảo khác, chu kỳ sinh trưởng của tảo Silic cũng trải qua 5 pha (Tô Huệ Mỹ, 1989) [9]: - Pha gia tốc dương: Tảo bắt đầu thích nghi với môi trường nuôi, hấp thụ chất dinh dưỡng và tiến hành phân cắt tế bào nhưng tốc độ tăng trưởng quần thể chậm. - Pha logarit: Ở pha này mật độ hay sinh khối tế bào tăng lên với tốc độ nhanh nhất, theo cấp số nhân do tảo hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh và tăng tốc độ sinh sản. - Pha gia tốc âm: Được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng chậm dần so với pha logarit. - Pha cân bằng: Sinh khối tảo không tăng và đạt mật độ cực đại. Quá trình quang hợp và phân chia tế bào vẫn xảy ra trong suốt pha này, nhưng số lượng tế bào mới sinh ra gần ngang bằng với số lượng tế bào chết đi. Do đó, không có sự tăng trưởng của tảo. - Pha tàn lụi: Sinh khối tảo giảm đi một cách rõ rệt do khả năng sinh sản của tảo mất dần sau khi đạt mật độ cực đại. Như vậy, các pha sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo cũng khác nhau. Ngoài ra, tốc độ sinh trưởng của tảo nói chung và tảo Silic nói riêng còn 6 phụ thuộc vào loài tảo nuôi và sự thay đổi của các yếu tố môi trường như: cường độ và chế độ ánh sáng (Guillard, 1975) [23], nhiệt độ (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], (Coutteau P.,1996) [21], muối dinh dưỡng (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [7], (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], mức độ xáo trộn hoặc sục khí môi trường nuôi (Coutteau P.,1996) [21], (Guillard, 1975) [23], (Fulk W. & Main K. L., 1991) [28]. 1.1.2.4. Phân bố: Theo Trương Ngọc An (1993) [1], loài tảo Nitzschia longissima là loài thuộc tính ven bờ, phân bố ven biển châu Âu, Nhật Bản, Trung Quốc, Indonesia. Ở các vùng biển Việt Nam loài này cũng thường xuất hiện, nhưng số lượng không nhiều. Còn trong các ao nuôi tôm sú ven biển Khánh hòa (Cam Ranh, Nha Trang, Ninh Hòa, Vạn Ninh), Nitzschia longissima được xem là loài chiếm ưu thế về mật độ tế bào (Hoàng Thị Bích Mai, 2005) [8]. 1.2. Thành phần sinh hóa của tảo Thành phần sinh hóa của vi tảo được Brown và ctv (1991) [20] bổ sung trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô của tế bào). Thành phần aminoacid tương tự Protein 30-55% Cacbohydrat 10-30% Lipid 10-25% Khoáng 10-40% Silic (tảo Khuê), phospho, natri, canxi Acid nucleic 4-6% trứng gà Chủ yếu là polysaccharid Các acid béo: 20-40% lipid tổng số Phospholipid: 10% lipid tổng số RNA:DNA = 3:1 Giá trị dinh dưỡng của những loài tảo khác nhau rõ rệt giữa các loài, và ngay giữa các dòng trong cùng một loài cũng khác nhau (Enright và ctv, 1986; Ryther và Goldman, 1975.Trích theo Hà Lê Thị Lộc) [6]. Chẳng hạn như các loài thuộc ngành vi tảo Prymnessiophyceae và ngành Eustigmatophyta có hàm lượng lipid là 17% 7 khối lượng khô tế bào. Trong khi các loài thuộc giống Navicula và Nitzschia (tảo Silic) có hàm lượng lipid cao nhất, với giá trị trung bình là 18% khối lượng khô tế bào (Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6]. Trong lipid của tảo có chứa một số axit béo không no, có thể mạch ngắn hay mạch dài, rất quan trọng cho động vật tiêu thụ tảo, ngay cả con người cũng không thể tổng hợp được axit béo không no này: DHA (Docosahec xaenoic-acid) chiếm 0,2-11%, EPA (Eicosapentaenoic - acid) chiếm 734% khối lượng khô của tảo. Đối với 2 loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp., EPA chiếm 1-5%, AA rất cao, chiếm hơn 20% khối lượng khô. Ngoài ra, ở Navicula sp., DHA chiếm 0,2-1%, và Nitzschia sp. chiếm 1-5% khối lượng khô (Arnaud & ctv) [19]. Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng của tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha sinh trưởng hay ở các điều kiện nuôi khác nhau (ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, pH, muối dinh dưỡng, …). Vào cuối pha logarit, tất cả các loài chứa khoảng 30-40% protein, 10-20% lipid, 5-15% cacbohydrat (Brown M. R., 1991) [20]. Vì vậy, chúng ta cần xác định thời gian thu hoạch thích hợp để có tảo đạt giá trị dinh dưỡng cao nhất. 1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo 1.3.1. Ánh sáng Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của vi tảo. Ánh sáng ảnh hưởng không chỉ đến sự phát triển số lượng của vi tảo, mà còn ảnh hưởng đến thành phần hóa sinh của vi tảo. Hầu hết các loài vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thích ứng với cường độ ánh sáng từ 50 đến 300 µEm-2s-1, tương ứng với thời gian chiếu sáng 12-18 giờ/ngày (Gilbert B., 1990) [22]. Brand và Guillard (1981) (trích theo Thinh, 1999) [31], khi nghiên cứu trên 22 loài tảo cho thấy có một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện chiếu sáng liên tục. Một số loài tăng trưởng tốt nhất ở chế độ 14 giờ, cũng có một số thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ trong ngày. Navicula và Nitzschia thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], (Nguyễn Đình Trung, 2004) [16]. 8 1.3.2. Nhiệt độ Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích thước tế bào và sự thích nghi của loài. Vi tảo có thể sống được trong khoảng nhiệt độ 16-30oC. Ở nhiệt độ cao hơn 35oC và thấp hơn 16oC, vi tảo phát triển rất kém (Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6]. Tuy nhiên, nhiệt độ được coi là thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các loài vi tảo là khoảng 20-25oC (Coutteau, 1996) [21]. Một số loài sinh trưởng ngoài tự nhiên ở nhiệt độ thấp, nhưng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì lại thích nghi với độ mặn cao hơn. Chẳng hạn, Skeletonema costatum ngoài tự nhiên sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 12-13oC và 14-20oC, trong khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng là 20-30oC (Fogg, 1965) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. Navicula sp. và Nitzschia sp. có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 10-35oC, trong đó, nhiệt độ tối ưu cho Nitzschia sp. là 20-30oC, và Navicula sp. là 26-31oC (Lê Viễn Chí, 1996) [2], (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. 1.3.3. Độ mặn Các loại tảo khác nhau có khả năng thích nghi đối với các độ mặn khác nhau. Có những loài tảo có khả năng phát triển tốt trong môi trường có độ mặn cao đến hơn 35 ppt, nhưng cũng có những loài chỉ sống được trong môi trường có độ mặn chỉ vài phần ngàn. Hầu hết, các loài tảo sinh trưởng và phát triển được trong khoảng độ mặn 12-40 ppt, nhưng phát triển tốt hơn trong khoảng 20-35 ppt (Ukeles, 1976; Duerr & Misui, 1982. Trích theo Fulks & Main, 1991) [28]. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Bích Mai (1995) [7] cho thấy loài tảo Chaetoceros sp. thích hợp phát triển ở độ mặn 20-35 ppt, tốt nhất ở 30 ppt, còn Skeletonema costatum lại thích hợp phát triển ở độ mặn thấp từ 15-25 ppt,… Tảo Chaetoceros gracilis có thể phát triển tốt như nhau trong khoảng độ mặn 10-35 ppt (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [9]. Hầu hết, các loài tảo thuộc giống Nitzschia, Navicula đều là những loài rộng muối, chúng có thể sinh trưởng ở độ mặn dao động từ 5-35 ppt (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], (Cao Thị Xoan, 2005) [17]. Trong 9 thực tế, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã nuôi Navicula sp. ở độ mặn 25-28 ppt. Trong điều kiện bị sốc mặn, khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu, duy trì cân bằng nội môi của tế bào tảo sẽ bị ảnh hưởng. Độ mặn cao có thể ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt tính quang hợp, hô hấp, tốc độ sinh trưởng của tế bào tảo (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. 1.3.4. pH pH được coi là yếu tố biến đổi nội tại. Sự biến đổi của nhiệt độ cũng như ánh sáng đều tác động đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo. pH của môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của vi tảo. Mỗi loài tảo sinh trưởng tối ưu trong môi trường có pH nhất định. pH tốt đối với hầu hết các loài tảo trong khoảng 7-9, và thích hợp nhất từ 8,2-8,7 (Ukeles 1971. Trích theo Fulks và Main, 1991) [28]. Khoảng pH này cũng thích hợp cho Navicula sp. và Nitzschia sp. (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], (Cao Thị Xoan, 2005) [17]. Tuy nhiên, có những loài chịu được khoảng dao động pH khá rộng, như Isochrysis galbana có thể phát triển tốt trong khoảng dao động pH từ 5-9 (Fulk & Main, 1991) [28]. 1.3.5 Các yếu tố dinh dưỡng Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo cả về số lượng và chất lượng. Mật độ tế bào tảo nuôi thường cao hơn nhiều so với mật độ tảo trong tự nhiên, nên việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi là cần thiết. Thành phần dinh dưỡng đa lượng cần thiết cho tảo nuôi gồm các muối nitơ, photpho, silic… Các nguyên tố vi lượng tác động đến quá trình trao đổi chất của vi tảo. Môi trường bổ sung dinh dưỡng cho tảo đang được sử dụng phổ biến hiện nay cho tảo Silic là môi trường L và L1 (Guillard, 1975) [23]. Ở Việt Nam, môi trường bổ sung dinh dưỡng của Hoàng Thị Bích Mai (1995) rất phù hợp cho tảo silic, đang được sử dụng phổ biến tại các cơ quan nghiên cứu và trại nuôi tôm sú Nha trang (Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6]  Nitơ: 10 Mặc dù nitơ chỉ chiếm từ 1-10% khối lượng cơ thể trong hầu hết các loại tảo, nhưng nhu cầu nitơ rất quan trọng đối với sự phát triển của tảo. Khi mà amon được sử dụng như nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì môi trường pH sẽ giảm nhanh, gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh hưởng tới sinh trưởng của tảo. Mzapharov và ctv (1974) (trích theo Phan Thị Thu Trang) [15] cho biết tảo có khả năng sử dụng đạm dưới dạng 3 hợp chất: Amoni, nitrat, và nitrit. Mỗi loài có nhu cầu sử dụng hàm lượng nitơ khác nhau. Hàm lượng nitơ bổ sung tốt nhất cho tảo Chaetoceros gracilis là 12,41-17,41 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [9]. Đối với Navicula sp. và Nitzschia sp., nhu cầu này từ 10-45 ppm, và tốt nhất ở 30 ppm (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], (Cao Thị Xoan, 2005) [17].  Photpho: Photpho có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của tảo. Chức năng chính của photpho là tham gia vào việc hình thành nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò là những khâu chuyển hóa trung gian hoặc những chất có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng và trao đổi chất. Hàm lượng photpho cần bổ sung cho hầu hết các loài vi tảo từ 2,5-15 ppm (trích theo Hà Lê Thị Lộc) [6], cho loài Chaetoceros gracilis là 2,27-3,27 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [9]. Đối với Navicula sp. và Nitzschia sp., hàm lượng photpho bổ sung tối ưu khoảng 10 ppm (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. Lượng photpho nhiều quá hay ít quá đều không tốt cho sự phát triển của tảo (Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6].  Silic: Silic vừa là yếu tố tạo sinh, vừa là nguyên tố tạo nên vỏ silic của tảo Silic. Theo Nguyễn Trọng Nho (1972) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [15], silic rất cần cho việc xây dựng vỏ tảo Khuê. Nếu thủy vực tồn tại nhiều tảo Khuê thì trong thời kỳ tảo Khuê phát triển mạnh, hàm lượng silic sẽ giảm nhiều, do đó sẽ hạn chế sự phát triển cực đại của tảo. Một số tác giả khác chỉ ra rằng khi thiếu silic, tảo Khuê vẫn phát triển bình thường nhưng cấu trúc tế bào sẽ bị thay đổi và khó khăn cho việc xác định loài (trích theo Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [7]. Cấu trúc phức tạp của vỏ silic giúp cho tảo có khả năng sử dụng đầy đủ ánh sáng mặt trời (trích theo 11 Cao Thị Xoan, 2005) [17]. Đối với Chaetoceros gracilis, hàm lượng silic bổ sung tối ưu là 1,49 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [9]. Trong phòng thí nghiệm, Richer (1961) đã nghiên cứu 2 loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. và thấy rằng môi trường nuôi chúng nên bổ sung thêm silic (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. Hàm lượng silic thích hợp đối với Navicula sp. là 5-30 ppm và tối ưu là 20 ppm (Halarry B. & Erica. S., 1982) [25]; còn ở Nitzschia sp., hàm lượng silic thích hợp từ 5-20 ppm, tốt nhất là 10 ppm (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. 1.4. Khái quát các công trình nghiên cứu về các phương pháp phân lập và lưu giữ vi tảo 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới Theo Hans & Robert (2005) [24], môi trường nuôi, phương pháp nuôi của tảo được nghiên cứu từ những năm 1800-1900, và kỹ thuật nuôi trồng vi tảo được mô tả trong khá nhiều sách báo, tạp chí. Vào thế kỷ 19-20, khá nhiều công trình về nuôi trồng vi tảo được công bố, song phần lớn các công trình này mô tả cách nuôi vi tảo, ít đề cập đến phương pháp phân lập, lưu giữ các loài tảo này như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống đáy. Mặc dù vậy, có thể đề cập đến một số công trình sau: Vào năm 1850, mặc dù Ferdinand Cohn đã lưu giữ thành công tảo Lục đơn bào có roi Hamatococcus, song Cohn đã không phân lập được thuần chủng loài tảo này trong phòng thí nghiệm (Hans & Robert, 2005) [24]. Năm 1971, Famintzin đã nuôi được hai loài tảo Lục Chlorococcum infusionum, Protcoccus viridis trong môi trường có chứa muối vô cơ. Môi trường này đã được phát minh bởi Knop (1865) (Hans & Robert, 2005) [24] khi ông nghiên cứu về thực vật. Báo cáo đầu tiên về nuôi thuần chủng tảo được công bố bởi Beijerinck (1890) (Hans & Robert, 2005) [24]. Ông đã giới thiệu kỹ thuật nuôi tảo trong môi trường hỗn hợp (nước muối, muối dinh dưỡng và gelatin). Vào năm 1893, ông đã phân lập được 2 loài tảo Lục (Chlorella, Scenedesmus) và một loài tảo vàng. Ngoài ra, Beijerinck còn nuôi thuần chủng một số loài tảo khác (tảo lam Anabaena...). Miquel (Pháp) cũng được xem là người có nhiều đóng góp trong nuôi trồng tảo. Từ 1890-1898, ông đã pha loãng tảo tạp trong môi trường có chứa các nguyên 12 tố khoáng khác nhau để phân lập một số loài tảo Silic trung tâm. Tuy nhiên, độ thuần chủng của tảo còn rất thấp (Hans & Robert, 2005) [24]. Năm 1892, Noll và Oltmanns (Đức) (Hans & Robert, 2005) [24] đã xuất bản những bài báo về nuôi trồng tảo, song chủ yếu là về nuôi và lưu giữ tảo chứ không đề cập đến phân lập chúng. Năm 1894, Kriiger (Đức) (Hans & Robert, 2005) [24] đã nuôi thuần chủng quần lạc tảo Lục, bao gồm Prototheca, Chlorella. Năm 18961898, Klebs đã phân lập được tảo trong các đĩa petri có agar hay gelatin cho dù tảo vẫn còn bị nhiễm vi khuẩn (Guillard , 1975) [23]. Kế đó là Tischutkin (1897) (Hans & Robert, 2005) [24], tại Belarus cũng đã nuôi thuần chủng được một số loài tảo Lam bằng môi trường có agar, nhưng độ thuần chủng cũng không cao hơn. Tại Đại học Cambirdge (Mỹ), Ward (1899-1942) (Hans & Robert, 2005) [24] đã giới thiệu phương pháp phân lập tảo thuần chủng bằng cách trộn agar, axit axetic loãng với môi trường giàu dinh dưỡng, sau đó đổ vào đĩa petri và nuôi trong phòng thí nghiệm, song một vài ngày sau đó chỉ có một số loài tảo mọc được trên bề mặt agar. Tuy nhiên, Ward cũng được xem là người đầu tiên phân lập tảo thành công trên bề mặt môi trường đặc. Đến năm 1900, Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo ở vùng nước ngọt xung quanh nhà và ông đã thuần chủng được một số loài tảo nước ngọt bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch. Đồng thời, ông cũng đã tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể tích khác nhau (1-5 lít) (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [11]. Zumstein (1900) (Hans & Robert, 2005) [24] cũng đã phân lập được loài tảo Mắt Euglena gracilis bằng pipet và tách được vi khuẩn khỏi môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo. Năm 1903, bằng phương pháp phân lập tảo của Miquel, Richter đã lưu giữ được một số loài, trong đó có tảo Silic trung tâm. Ở Đức, từ năm 1926 đến 1960 (Hans & Robert, 2005) [24], Vischer cũng đã thu và lưu giữ được một số loài thuộc các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales. Tại Trung Quốc, nghiên cứu tảo nuôi đã được bắt đầu từ năm 1940. Guo và ctv (1959) (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6] đã phân lập và nuôi 2 loài tảo đơn bào Tetraselmis sp. và Dunaliella sp.. 13 Vào năm 1997, Comtois (Hans & Robert, 2005) [24] đã phân lập và nuôi thuần chủng được một số loài tảo Silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, một phương pháp mới và đòi hỏi kỹ thuật khá cao. Bristol đã phân lập được tảo Lục từ nhiều môi trường dinh dưỡng khác nhau (môi trường của Detmet, Beierinck 1, và Beierinck 2). Ông cũng là người khẳng định việc phân lập tảo thường khó hơn việc phân lập vi khuẩn kỵ khí (http://www. Plantphysiol. org/cgi/reprint/73/533. pdf.) [33]. Những năm gần đây, các nhà tảo học chủ yếu quan tâm đến việc cải tiến và nâng cao hiệu quả những phương pháp phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối các loài đã công bố trước đây (Robert A. Anderden, 2005) (theo Hans & Robert, 2005) [24]. Năm 2007, Trường Đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng phổ biến 4 phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, dùng Micropipette, và phương pháp làm giàu). Đặc biệt, khi phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, được làm sạch bằng hỗn hợp kháng sinh khi tảo bị nhiễm vi khuẩn: 100 g Peniciline + 25 g Dihydrostreptomysin sulphate (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [11]. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300-400 loài) được phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau (y học, công nghệ thực phẩm, nông nghiệp…), nhưng chỉ có khoảng 40-50 loài tảo được sử dụng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (trích theo Thinh, 1999) [31]. 1.4.2. Ở Việt Nam Các công trình nuôi trồng tảo được bắt đầu và phát triển cùng với sự phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, các báo cáo khoa học về vấn đề này lại không nhiều, đặc biệt là quá trình phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng. Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Đại Học Nha Trang đã nghiên cứu và nuôi sinh khối ngoài trời một số tảo lục (Chlorella), tảo silic (Skeletonema costatum) làm thức ăn cho động vật nổi, thức ăn cho cá và ấu trùng tôm từ những năm 70 (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [7]… Năm 1974, Vũ Dũng đã phân lập được tảo Skeletonema costatum bằng ống hút mao quản trên kính hiển vi và nuôi nhân giống ở môi trường Alen nelson thành công (Vũ Dũng & ctv, 2000) [3]. Ngoài ra, Vũ Dũng & ctv 14 (2000) [3] bước đầu xây dựng được quy trình nuôi thu sinh khối và lưu giữ giống tảo silic Skeletonema costatumcho các cơ sở sản xuất. Vào những năm 80, đã có một số nghiên cứu thêm về tảo silic trung tâm Skeletonema costatum như Trại giống non nước (liên doanh Vatech) Đà Nẵng (1989) (Cao Văn Hạnh, 1999) [4] đã phân lập và nuôi đại trà tảo Silic trung tâm Skeletonema costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm đạt kết quả khá tốt. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III (1989) (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15] cũng đã phân lập được Skeletonema costatum tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. Năm 1994, Lê Viễn Chí & cộng sự (Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng) [5] đã lưu giữ và nuôi đại trà loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros calcitrans và tảo lục Chlamydomonas sp., Dunnalliela salina làm thức ăn cho ấu trùng Điệp quạt. Kế đó, Hoàng Thị Bích Mai (1995) [7] cũng đã đưa ra quy trình nuôi 2 loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros sp. và Skeletonema costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú (giai đoạn Zoea-Mysis1). Cũng vào năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai (Trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [6] đã thiết lập được môi trường dinh dưỡng TH04 dùng để phân lập, lưu giữu và nuôi sinh khối một số loài tảo Lục đơn bào (Chlorella sp., Scenesmus sp., Chlamydomonas sp. ). Những năm gần đây (từ năm 2000 đến nay), Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã tiến hành lưu giữ và nuôi sinh khối các loài tảo Silic (Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo Lục (Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo Eutisgmatophyta (Nanochloropsis oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) (Phan Thị Thu Trang, 2006) [15]. Tuy nhiên, phần lớn các loài tảo trên được di nhập từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc và từ Úc). Cũng tại Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, Nguyễn Thị Hương (2001) [5] đã sử dụng một số phương pháp phân lập (trên môi trường thạch, cấy chuyền trong môi trường lỏng, phương pháp pha loãng) và các phương pháp lưu giữ (ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5-6oC trong tối; môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5-6oC trong tối; môi trường bán lỏng, đặt ở điều kiện phòng thí 15 nghiệm) để phân lập và lưu giữ lại tảo silic trung tâm Chaetoceros calcitrans được nhập từ nước ngoài (Trung Quốc). Năm 2005, Đoàn Văn Phúc cũng đã phân lập được loài tảo Silic Pseudonitzschia cuspidata (loài tảo có thể chứa độc tố) tại vịnh Nha Trang trong điều kiện phòng thí nghiệm (Bùi Thị Vân, 2007) [18]. Để phục vụ cho các đề tài, dự án sản xuất giống một số đối tượng nuôi, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản (Đại học Nha Trang) cũng đang lưu giữ một số loài tảo nổi như Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Isochrysis gabana (làm thức ăn cho Artemia, Rotatoria để nuôi ấu trùng cá chẽm…). Có thể nói rằng, có khá nhiều loài tảo (chủ yếu là tảo lục và tảo silic) được phân lập, lưu giữ và nuôi đại trà làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản ở nước ta. Song các công trình nghiên cứu sâu đến phương pháp phân lập và lưu giữ các loài tảo sống đáy, sống bám như Navicula sp., Nitzschia sp… thì còn quá ít ỏi. Không những thế, việc ứng dụng các phương pháp phân lập, lưu giữ giống tảo đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới vào công nghệ phân lập, lưu giữ cũng như nuôi đại trà vi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến. Vì thế, các loài tảo dùng làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản (đặc biệt là giai đoạn ấu trùng) thường được nhập giống thuần chủng từ nước ngoài và lưu giữ trong phòng thí nghiệm. Hiện nay, một số loài đã bị tạp, nhiễm vi khuẩn hoặc đang thoái hóa. Thiết nghĩ việc phân lập và lưu giữ giống thuần chủng từ nguồn nước tự nhiên (của nước ta) được xem là cần thiết và sẽ đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn trong công nghệ sản xuất giống các đối tượng NTTS ở nước ta. 1.5. Ứng dụng của vi tảo làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản Vi tảo là những cơ thể tự dưỡng có kích thước hiển vi sống chủ yếu trong môi trường nước và có ý nghĩa to lớn đối với sự sống trong các thủy vực.Vi tảo là mắt xích đầu tiên của hệ sinh thái ở nước tạo nên năng suất sinh học sơ cấp góp phần không nhỏ trong tuần hoàn vật chất của thủy vực. Trong nuôi trồng thủy sản vi tảo được xem như là loại thức ăn cho các vật nuôi hơn là khối lượng các chất hữu cơ khổng lồ mà chúng tạo ra. Trước tiên vi tảo 16 có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt hàm lượng protein, ngoài ra còn cung cấp nhiều loại vitamin cần thiết cho các đối tượng thủy sản như B6, B12. Các khoáng chất và sắc tố trong tảo cũng đóng góp một vai trò quan trọng tronng việc xây dựng nên giá trị dinh dưỡng của một số loài tảo (Chlorophyl, Carotenoid,….) Bảng 1.2. Các lớp và các chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật thủy sản (Nguyễn Thị Hương, 2001) [5] Lớp Chi Đối tượng dùng vi tảo Bacillariophyceae Skeletonema PL, BL, BP Thalassiosira PL, BL, BP Phaeodactylum PL, BL, BP, ML, BS Chaetoceros PL, BL, BP, BS Nitzschia và Cyclotella BS Isochrysis PL, BL, BP, ML, BS Pseudoisochrysis BL, BP, ML Dicrateria, coccolithus BP Tetraselmis PL, BL, BP, AL, BS, MR Pyramimonnas BL, BP Chrysophyceae Monochrysis BL, BP, BS, MR Cryptophyceae Chroomonas BP Cryptomonas BP, BL Xanthophyceae Olisthodiscus BP Chlorophyceae Carteria, chrorococcum Haptophyceae Prasinophycea Brachiomonas Dunaliella BP Chlamydomonas BP, BS, MR Chlorella BL, BP, FZ, MR, BS Scenedesmus BL, ML, BS, MR, FZ Nanochloris FZ, MR, BS 17 Cyanophyceae Spirulina BP, MR, SC, PL, BS, PP Ghi chú: PL - Ấu trùng tôm, BL - Ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ML - Ấu trùng tôm nước ngọt, BP – Hậu ấu trùng hai mảnh vỏ, AL - Ấu trùng bào ngư, MR – Brachionus, BS – Atermia, SC – Saltwater copepoda, FZ – Phù du động vật nước ngọt 18 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng: Tảo Silic lông chim Nitzschia longissima. 2.1.2. Thời gian: 21/07/2008 đến 8/11/2008. 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý – sinh thái và phòng thí nghiệm môi trường thuộc Khoa Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại Học Nha Trang. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm (hình 2.1 và 2.2) 19 Thu tảo ngoài tự nhiên Lọc lại tảo bằng lưới vớt động vật nổi Nhân sinh khối lượng tảo vừa thu được (Từ 0,5l đến 1l, 2l, 5l) Phân lập bằng các phương pháp Nuôi cấy trên môi trường thạch (agar) Pha loãng Kiểm chứng mức độ thuần chủng: Tách tảo ra khỏi môi trường phân lập và nuôi tảo trong các ống nghiệm (V = 10ml), xác định độ thuần chủng. Tảo giống thuần chủng Phương pháp phân lập thích hợp Hình 2.1: Sơ đồ quá trình phân lập tảo giống thuần chủng 20 Tảo giống thuần chủng Lưu giữ trong các điều kiện khác nhau Môi trường bán lỏng (dịch nuôi lỏng và agar) Môi trường lỏng (dịch nuôi lỏng) Môi trường dinh dưỡng F2 ở nhiệt độ 15oC Môi trường dinh dưỡng F2 ở nhiệt độ 7 – 8 oC Môi trường dinh dưỡng HBMai – 95 ở nhiệt độ 15oC Môi trường dinh dưỡng HBMai - 95 ở nhiệt độ 7 – 8 oC Kiểm chứng: Nhân sinh khối, kiểm tra số lượng và sự phát triển (tốc độ sinh trưởng - µ) của vi tảo Điều kiện lưu giữ thích hợp cho tảo Nitzschia longissima Đưa tảo giống vào lưu giữ với thời gian khác nhau (2 tuần và 4 tuần) Thời gian lưu giữ thích hợp Hình 2.2: Sơ đồ quá trình lưu giữ tảo giống 2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm 2.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm - Lưới vớt thực vật nổi, động vật nổi và các chai nhựa để thu mẫu - Đĩa petri để phân lập tảo, bình nón 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml để lưu giữ và nuôi thí nghiệm. Ngoài ra, còn có các dụng cụ khác như pipet Pasteur, pipet 1 ml, 10 ml, đũa thủy tinh, cốc thủy tinh, các ống nghiệm, que cấy… Tất cả các dụng cụ được rửa bằng xà phòng, nước máy, để khô, sau đó đưa vào tủ sấy vô trùng ở 105oC, trong thời gian 12 giờ.